一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种稳定的同型半脫氨酸检测试剂盒，属于医学检验测定技术领域。
【背景技术】
[0002] 同型半脫氨酸是含硫氨基酸，在细胞内由蛋氨酸脱甲基生成。近期的研究表明，同 型半脫氨酸通过产生超氧化物及过氧化物损伤血管内皮细胞，改变凝血因子功能，增加血 栓形成倾向，促进动脉粥样硬化及血栓形成，使屯、血管疾病发病率及死亡率增加，因此测定 血中同型半脫氨酸的浓度在临床上意义十分重要。
[0003]测定血浆中同型半脫氨酸的方法有很多种，包括高效液相色谱法（HPLC)、循环酶 法、巧光偏振免疫分析法（FPIA)、酶联免疫分析法巧IA)、氨基酸分析仪测定法、离子色谱 法、毛细管气相色谱-质谱、电化学法等。
[0004] 其中，高效液相色谱法（HPLC):先使用还原剂使血样中所有形式的同型半脫氨酸 转变成还原形式，然后与巧光剂进行衍生生成同型半賊氨酸一巧光物质复合物，将衍生后 的样品进行色谱分析。因色谱固定相对不同物质的吸附力不同，因此流动相将其洗脱下来 的次序也不同，根据运一原理将样品中的不同物质分开，W巧光检测器检测洗脱下同型半 脫氨酸一巧光物质复合物的巧光强度，将其与标准品/内标的比值进行比较和计算，就可 W测定血总同型半脫氨酸的水平。该方法是经典的参考方法，但是操作复杂，耗时比较久， 且成本较大，逐渐被其他方法取代。
[0005] 循环酶法：目前主要用同型半脫氨酸转甲基酶及腺巧同型半脫氨酸酶的循环扩增 作用，再加上腺巧脱氨酶、嚷岭核巧憐酸化酶、黄嚷岭氧化酶、过氧化物酶等，或腺巧脱氨 酶、谷氨酸脱氨酶等显色反应测定同型半脫氨酸含量。该方法的优点在于可W直接上生化 仪使用，快速，准确方便。但是由于使用的工具酶较多，连续催化反应步骤复杂，试剂质量和 反应线性都需不断校正，对使用维护要求。由于各个蛋白酶的稳定性和活性要求不同，故测 定试剂制造中较难找到理想的稳定条件，因此稳定性受到一定的限制。且测定主要影响因 素为血氨，此外原料酶价格昂贵，市面上不容易获取，导致成本巨大。
[0006] 巧光偏振免疫分析法（FPIA):测定原理是先用二硫苏糖醇将标本中结合态的化y还原成游离形式后，同时加入腺巧，在S-腺巧-L-同型半脫氨酸水解酶的作用下将Hey转 化为S-腺巧-k同型半脫氨酸（SAH)，然后加入抗SAH单克隆抗体和巧光标记的SAH抗原， SAH与巧光标记抗原竞争结合抗SAH抗体，形成大分子的免疫复合物，最后测定其巧光偏振 度。此方法要求血标本及时送至实验室，避免血细胞内Hey的释放对测定结果的干扰。FPIA 法测定Hey具有较好的精密度，血清与血浆结果之间具有良好的相关性，但FPIA法较适合 实验室常规应用，不适合工业化生产。
[0007] 同样的，离子色谱法与毛细电泳法也主要用于实验研究，极少在临床上使用，且毛 细电泳法与高效液相色谱方法相似，还存在操作比较复杂、试验耗时较长和试验数据变异 比较大等缺点。
[0008] 酶联免疫分析法巧IA):该方法是临床上测定同型半脫氨酸常用方法，优点在于 操作比较简单快捷，并且重复性好，稳定性好，但是该方法大部分需要手工操作，耗时较长， 且试剂昂贵。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提出了一种灵敏度高、热稳定 性好、储存时间长的稳定的同型半脫氨酸检测试剂盒。
[0010] 本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种稳定的同型半脫氨酸检测试剂 盒，包括试剂1和试剂2，
[0011] 所述试剂1的组分为：肥Y还原剂：l-200mmol/L，丝氨酸：1.O-lOOmmol/L，NA畑： 0. 5-0. 8g/L，LDH:50-200KU/L;
[0012] 所述试剂2的组分为：稳定剂：0.l-lOg/l，脫硫酸P-合成酶：l-lOOKU/l，脫硫酸 P-分解酶：l-l〇〇KU/L。
[0013] 在上述稳定的同型半脫氨酸检测试剂盒中，试剂1中所述的HCY还原剂为TCEP、琉 基乙酸、邸TA的混合物。当同型半脫氨酸在细胞内积聚，并进入血液循环后，大部分W氧化 型存在，并与蛋白结合，还原型同型半脫氨酸在血中仅占1%。测定血中总同型半脫氨酸的 含量，一般需采用还原剂将氧化型同型半脫氨酸还原为还原型同型半脫氨酸。HCY还原剂的 试剂很多，但是因为都有还原性，所W极易被氧化，都不稳定，另外现有技术中有些试剂为 干粉或者为3试剂，在使用中极其不便。本发明还原剂中的TC阳相对于其他它还原剂相对 稳定，并且使用的PH范围最广。
[0014] 作为优选，所述的TCEP、琉基乙酸、EDTA按质量比5-7:1. 5-2. 5:1混合。将HCY还 原剂的浓度限定在l-200mmol/L的原因在于还原剂浓度过小不能将血清中的HCY完全还 原，导致结果偏低。如果HCY浓度大了，会影响后续反应，从而影响整个结果。HCY还原剂的 浓度是TCEP的浓度，琉基乙酸、邸TA按TCEP的用量调整。TCPE与琉基乙酸和邸TA按上述 比例混合使用，更加稳定，从而使试剂更加稳定。
[0015] 在上述稳定的同型半脫氨酸检测试剂盒中，试剂2中所述的稳定剂为可溶性淀粉 和谷脫甘肤的混合物。现有技术中同型半脫氨酸检测试剂盒一般采用甘油、乙二醇、BSA等 常规的试剂做稳定性，导致稳定效果一般，本发明中采用的可溶性淀粉与谷脫甘肤都是含 有较多琉基的酶，单独做稳定性存在的时候，热稳定性较差，但是通过不断试验发现，将可 溶性淀粉和谷脫甘肤共同作为稳定剂使用时，可W大幅度提高同型半脫氨酸检测试剂的 稳定效果，可W达到在4°C下至少保存1年W上。
[0016] 作为优选，所述可溶性淀粉和谷脫甘肤按质量比10 :0. 8-2混合。稳定剂的浓度 是可溶性淀粉的浓度，谷脫甘肤按可溶性淀粉的用量调整。若稳定剂的浓度过高，则成本较 大，但若稳定剂的浓度过低，则达不到应有的效果。
[0017] 在上述稳定的同型半脫氨酸检测试剂盒中，试剂1和试剂2均还包括缓冲液 10-200mmol/l，其中缓冲液为TRIS、Good'S缓冲液、MOPS、肥阳S、S乙醇胺、憐酸钟缓冲液、 憐酸钢缓冲液中的一种或多种。
[0018] 在上述稳定的同型半脫氨酸检测试剂盒中，试剂1和试剂2均还包括保护剂，保护 剂占试剂1或试剂2的质量百分比的0. 1-20%，其中保护剂为BSA、薦糖、海藻糖、甘油、乙 二醇、山梨醇、PEG6000中的一种或多种。
[0019] 在上述稳定的同型半脫氨酸检测试剂盒中，试剂1和试剂2均还包括表面活性剂， 表面活性剂占试剂1或试剂2的质量百分比的0. 01-1 %，其中表面活性剂为曲拉通系列、吐 溫系列、brij-35、二月桂甘油硫酸醋中的一种或多种。
[0020] 在上述稳定的同型半脫氨酸检测试剂盒中，试剂1和试剂2均还包括防腐剂 0.l-5g/l，其中，防腐剂为叠氮钢、proclin300、MIT、硫酸庆大霉素、硫柳隶中的一种或多 种。
[0021] 本发明稳定的同型半脫氨酸检测试剂盒原理为：氧化型HCY被转化成游离HCY，游 离HCY在CBS催化下和丝氨酸反应生成k脫硫酸山-脫硫酸在C化催化下又生成HCY、丙 酬酸和畑3;该循环反应生成的丙酬酸可W用乳酸脱氨酶LDH和NADH检测到，NADH转变成 NAD+的速率与样品中HCY含量成正比。
[0022] 反应原理的反应式如下：
[0023]
[0026] 在340nm处测定NADH降低速率可献则得同型半脫氨酸的含量。
[0027] 本发明稳定的同型半脫氨酸检测试剂盒可W使液体试剂盒。
[0028] 与现有技术相比，本发明具有W下几个优点：
[0029] 本发明稳定的同型半脫氨酸检测试剂盒测定方便，双试剂无需配制，为液态试剂， 可W直接使用，且检测速度快，灵敏度高，准确度高，稳定性好，线性范围广，储存时间长，可 W达到在4°C下至少保存1年W上，另外原料成本较低，完全满足临床检验的需要。
【附图说明】
[0030] 图1为本发明稳定的同型半脫氨酸检测试剂盒与对比例1进口试剂盒的血清中同 型半脫氨酸含量的相关性曲线。
[0031] 图2为本发明稳定的同型半脫氨酸检测试剂盒与对比例2、6、7试剂盒的热稳定性 曲线。
[0032] 图3为本发明稳定的同型半脫氨酸检测试剂盒与对比例3、4、5试剂盒的还原剂热 稳定性曲线。
【具体实施方式】
[0033] W下是本发明的具体实施例结合【附图说明】，对本发明的技术方案作进一步的描 述，但本发明并不限于运些实施例。
[0034] 本发明试剂盒测定血清中同型半脫氨酸含量的测试条件为：方法：速率法；主/副 波长：340nm/405nm;样本/试剂1/试剂2 : 16. 5/250/25 ;溫度：37°C;血清+试剂1时间： l-5min;加入试剂2后的反应时间：3-5min;校正类型：线性；校准方法：两点定标；反应方 向：向下。
[0035] 测定步骤：
[0036] 标本 16. 5y1
[0037] 试剂 1 250y1
[0038] 混匀，置于37°C解育l-5min
[0039] 试剂 2 25y1
[0040] 混匀，37°C解育1. 5min后，连续检测l-3min，计算AA/min。
[0041] 计算结果
[0042]
[004引样品要求：
[0044]1、样本为