生化原料药杂蛋白的鉴别方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种杂质检测方法，尤其设及一种生化原料药杂蛋白的鉴别方法。
【背景技术】
[0002] 生化原料药，如：膜岛素、鱼精蛋白和尿激酶等，是从生物体分离，纯化所得，用于 预防、治疗和诊断疾病的生化基本物质，W及用化学合成或基因重组等现代生物技术制得 的运类物质。其主要类别有：氨基酸、肤、蛋白质、酶及辅酶、多糖、脂质、核酸及其衍生物。
[0003] 生化原料药的杂质鉴别是一个难题，因此该类药品在药品注册申报或GMP认证 时，一般不要求提供杂质谱文件资料。在药典中，生化药通常采用纯度的方式来表征。其原 因在于：该类原料药可能包含的杂质往往与主药本身的结构与特性无关，而与起始物质的 物种和特定纯化工艺有关。对于蛋白类生化原料药来说，其潜在杂蛋白可能包括起始物质 所属物种的所有组成蛋白质。由于杂蛋白量少、面广且结构复杂，化学药品常用的杂质鉴别 方法不能解决生化原料药杂质鉴别的问题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种生化原料药杂蛋白的鉴别方法，W实现生化原料药中 所含杂蛋白的鉴别。
[0005] 本发明提供的一种生化原料药杂蛋白的鉴别方法，先用蛋白质组学的鉴别方法识 别出样品中可能存在的杂蛋白，再用免疫试剂针对一种或多种可能存在的杂蛋白进行特异 性检测。在必要的情况下，还可W测定杂蛋白的生物活性。
[0006] 本发明中，蛋白质组学鉴别方法是先用蛋白水解酶（如：但不仅限于膜蛋白酶和 V8蛋白酶）酶解初始样品或经过电泳分离（如：但不仅限于SDS-PA(iE电泳和双向电泳）的 样品，再经过液质联用仪器（如：LC/MS和LC/MS/MS等）获得酶解样品中所有肤段的分子 量、电荷特征的生物信息学参数，最后用生物信息学软件（如：但不仅限于Bioworks软件） 计算并联网捜库得到样品中可能存在的杂蛋白信息。
[0007] 本发明技术方案实现的有益效果：
[0008] 本发明提供的蛋白质组学鉴别方法，可W通过一次试验定性样品中几乎所有可能 存在的蛋白质的信息，适用于生化原料药中可能存在的杂蛋白的广谱筛查；而免疫鉴别则 可W对广谱筛查结果进行逐一的特异性检测，其结果具有确定性的特点。
[0009] 因此，本发明通过蛋白质组鉴别方法和免疫鉴别方法结合使用，可W解决生化原 料药中杂蛋白多样性和与主药无关性的问题，从而达到建立该类原料药杂蛋白谱的目的， 并最终为提高生化原料药的质量安全性提供科学证据。
【具体实施方式】
[0010] W下详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用W说明本发明的技术方案而 非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解， 可w对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围， 其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
[0011]本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自于国药集团化学试剂公司。
[001引 实施例1
[0013] 尿促性素是一种从绝经妇女尿液中提取的促性腺激素制品，包含FSH、LH两种主 药蛋白。但该品种主药成分含量很低，包含含量很高的杂质，主要是杂蛋白。
[0014] 通过运用蛋白质组学方法化C/MS/M巧对尿促性素肤图进行鉴别，结果表明该制 品可能包含32种多肤/蛋白质，组成如下：
[001引 表1[0016]
[0017]
[0018] 由表1可见，尿促性素制品中，除主药FSH、LH的3种成分之外，可能还存在29种 人体多肤/蛋白。除主药成分另行鉴别和定量检测外，我们检索到APOD有商品化的化ISA 诊断试剂，此外还可获得乌司他下的免疫血清。其它大部分可能存在的多肤/蛋白尚没有 商品化的免疫试剂。
[0019] 使用AP0D-ELISA诊断试剂检测尿促性素制品，检测结果表明制品中APOD不存在。
[0020] 使用乌司他下免疫血清通过免疫双扩散方法检测尿促性素制品，检测结果表明制 品中含有乌司他下成分。
[0021] 采用《中国药典》2010年版二部的方法，检测尿促性素制品中乌司他下效价，结果 表明制品中含有600IU/mg的乌司他下成分。经过换算，尿促性素制品中，乌司他下成分约 含 24%。
[0022] 由此，我们可W确定尿促性素制品肯定含有乌司他下杂质，无APOD杂质。
[002引实施例2
[0024] 尿促卵泡素是W尿促性素为起始物质的促性腺激素制品，主药成分是FSH，纯度达 98%。
[00巧]通过运用蛋白质组学方法化C/MS/M巧鉴别尿促卵泡素，结果表明该制品可能包 含23种多肤/蛋白质，组成如下：
[0026] 表2
[0027]
[0028] 由表2可见，尿促卵泡素制品中，除主药F甜的2种成分之外，可能还存在21种人 体多肤/蛋白。主药成分另行鉴别和定量检测。
[0029] 使用AP0D-ELISA诊断试剂检测尿促卵泡素制品，检测结果表明制品中APOD不存 在。因为尿促卵泡素的起始物质尿促性素中也未检测到APOD杂质成分，该结果也能与实施 例1的结论相应证。
[0030] 采用《中国药典》2010年版二部的方法，检测尿促卵泡素制品中乌司他下效价。结 果表明，制品中每万单位F甜效价约含5IU的乌司他下成分。经过换算，尿促卵泡素制品中， 乌司他下成分约含2%。。运表明，经过高度纯化处理，终产品尿促卵泡素已经去除绝大部分 由起始物质尿促性素带入的乌司他下成分。
[0031] 使用乌司他下免疫血清通过免疫双扩散方法检测尿促卵泡素制品，未检测到乌司 他下成分。因为乌司他下含量太低，已经低于免疫双扩散方法的检测限，该结果也能与免疫 检测的结果相印证。
[0032] 由此，我们可W确定尿促卵泡素制品含有非常低的乌司他下杂质（~2%。），无 APOD杂质。
【主权项】
1. 一种生化原料药杂蛋白的鉴别方法，其特征在于，先用蛋白质组学的鉴别方法识别 出样品中可能存在的杂蛋白，再用免疫试剂针对一种或多种可能存在的杂蛋白进行特异性 检测。2. 根据权利要求1所述的生化原料药杂蛋白的鉴别方法，其特征在于 所述的蛋白质组学鉴别方法是先用蛋白水解酶酶解初始样品或经过电泳分离的样品， 再经过液质联用仪器获得酶解样品中所有肽段的生物信息学参数，最后用生物信息学软件 计算并联网搜库得到样品中可能存在的杂蛋白信息。3. 根据权利要求2所述的生化原料药杂蛋白的鉴别方法，其特征在于所述的蛋白水解 酶选自于胰蛋白酶和V8蛋白酶之一种或几种。4. 根据权利要求2所述的生化原料药杂蛋白的鉴别方法，其特征在于所述的电泳选自 于SDS-PAGE电泳和双向电泳之一种或几种。5. 根据权利要求2所述的生化原料药杂蛋白的鉴别方法，其特征在于所述的生物信息 学参数选自于分子量和电荷特征之一种或几种。6. 根据权利要求2所述的生化原料药杂蛋白的鉴别方法，其特征在于所述的生物信息 学Bioworks软件）。7. 根据权利要求2所述的生化原料药杂蛋白的鉴别方法，其特征在于所述的液质联用 仪器为LC/MS和LC/MS/MS之一种或几种。
【专利摘要】一种生化原料药杂蛋白的鉴别方法，先用蛋白质组学的鉴别方法识别出样品中可能存在的杂蛋白，再用免疫试剂针对一种或多种可能存在的杂蛋白进行特异性检测。本发明通过蛋白质组学鉴别方法和免疫鉴别方法的结合使用，可以解决生化原料药中杂蛋白多样性和与主药无关性的问题，可以达到建立生化原料药杂蛋白谱的目的。
【IPC分类】G01N33/68, G01N33/76, G01N30/02
【公开号】CN105181968
【申请号】CN201510532719
【发明人】钱卫
【申请人】钱卫
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月26日