一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种生物蛋白检测技术方案，特别是一种中性粒细胞明胶酶相关脂质 运载蛋白含量检测试剂盒。
[0002] 本申请中下列表达式的意义为：
[0003] 0. 01-0. 2M化C1:表示溶液中化C1 浓度为 0. 01-0. 2mol/L;
[0004] 0. 1-3%薦糖：表示每100血溶液中加薦糖0.l-3g。
[0005]Tris:S径甲基氨基甲烧；
[0006]BSA:牛血清白蛋白；
[0007] 邸TA:乙二胺四乙酸；
[0008]EDAC:水溶性碳二亚胺类交联剂；
[000引阳G:聚乙二醇；
[0010]MES:-水吗嘟乙横酸；
[0011] PVN指聚乙締基糞，VN指其单体；SDS指十二烷基横酸钢；KPS指过硫酸钟；
[0012] 本申请中跟上述表达式类似之处，所表达意义均跟上述意义类似；本申请中类似 表达式另有说明的除外。
【背景技术】
[0013] 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（简称NGAL)是1993年在中性粒细胞内首 先被发现的，与炎症、胚胎发育、免疫应答、趋化作用、信号转导W及多种肿瘤的发生与发展 等过程相关。近年来国内外的研究表明，NGAL蛋白在多种疾发过程中具有特异性表达变化 的特点，使得NGAL成为检测疾病的生物标志物。
[0014] 在发生缺血性和毒性肾损伤过程中，肾小管上皮细胞中的NGAL将显著增加，在开 始的两个小时内，尿液和血液中NGAL水平将显著增加，因此NGAL是早期急性肾损伤的敏感 标志物。
[0015] 急性肾功能损伤预后将发展成为急性肾功能衰竭。通用的诊断方法如测定血清肌 酢或者半脫氨酸蛋白酶抑制剂C(切statinC)，只能在损伤后一天甚者几天内检测。有研 究表明，健康志愿者尿液中NGAL含量检测结果分布0. 7-9.6ng/ml，平均值为5. 3ng/ml。而 血浆中的含量检测结果为37-106ng/ml，平均值为63ng/ml。当肾损伤后，随机检测重病患 者，尿液NGAL的浓度为llOng/ml到4000化g/ml不等。而他们邸TA抗凝血浆检测结果为 25ng/ml到3491ng/ml。根据急性肾衰竭患者检测的90%阳性预测值判断，尿液中NGAL的 阳性判断值为35化g/ml，而血浆检测的阳性判断值为40化g/ml。
[0016] 目前NGAL的测定方法主要有酶联免疫法、放射免疫法、Western-blottingW及化 学发光法。酶联免疫法自动化程度不高，且受人为因素影响较大；放射免疫法存在着环境污 染问题；Western-blotting操作复杂，测定精密度低；而化学发光法灵敏度虽高，但测定线 性范围较小且检测成本较高，需要特定化学发光检测仪，运些原因导致其应用范围较小。
[0017] 胶乳增强免疫透射比浊法也是测定人血浆或尿液中NGAL浓度的常用方法，该方 法对仪器设备要求不高，没有环保和操作人员自身防护等问题。与其他测定方法比较，该方 法简便快速、灵敏可靠，普通自动或半自动生化分析仪就可，有较大应用范围，较大的实用 价值。
[0018]NGAL浓度在正常人尿液中低于lOng/ml，在重度肾病患者尿液中浓度可高达 7000ng/mlW上。如此宽广的浓度范围，对检测试剂盒灵敏度和线性范围均提出了较高的要 求。目前市场上已有胶乳增强免疫透射比浊法测定人血浆或尿液中NGAL浓度的试剂盒，但 运些试剂盒无法同时满足宽线性范围和高灵敏度的要求，因此需要稀释样本才能测定高浓 度NGAL运在使用上带来了不便。
【发明内容】
[0019] 为解决上述问题，本发明公开了一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检 测试剂盒，组成构成简单、测试灵敏度好、线性范围广、稳定好，测试成本低廉，精度高，便于 推广，在很大程度上能提高扩大检测的线性范围，提高检测灵敏度。
[0020] 本发明公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒，包括试剂 R1、试剂R2W及NGAL试剂参考标准品，其中：试剂R1包括Tris、化Cl、BSA、Tween-20、PEG、 NaNs;试剂R2包括Tris、化Cl、BSA、Tween-20、NaN3、薦糖、NGAL抗体致敏胶乳微粒；NGAL试 剂参考标准品包括化is、化C1、BSA、Tween-20、邸TA、胞吨及不同含量NGAL所述NGAL抗体 致敏胶乳微粒包括PS纳米胶乳微粒和PVN纳米胶乳微粒（胶乳微粒中PVN纳米胶乳微粒 的含量占胶乳微粒总体积的50-80% )，且PS纳米乳胶微粒的粒径大于PVN纳米胶乳微粒 的粒径。本方案中通过大粒径的PS微球和小粒径的PVN微球相配合，从而有利于在整体上 改善试剂的检测灵敏度和扩大线性范围，较大粒径PS微球可W提高灵敏度，但偶联抗体量 较小，线性范围也相应较窄。乙締基糞（VN)因糞环与碳碳双键共辆，其在一定波长范围内 的吸光值比苯乙締强，从而可W通过较小粒径的PVN微粒来改善检测灵敏度和增强扩大检 测的线性范围，同时经检测在同一波长下，粒径较小的PVN微球与粒径较大的PS微球具有 相近的A值（紫外吸光光度法），并且采用混合型的微球体系有利于控制整体的成本和加工 性能。
[0021] 本发明公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒的一种改进， PS纳米胶乳微粒的粒径为120nm-180nm.
[0022] 本发明公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒的一种改进， PVN纳米胶乳微粒的粒径为80nm-120nm。
[0023] 本发明公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒的一种改进， PVN纳米胶乳微粒的制备为：在PH8-10的碳酸盐缓冲液中，加入SDS、KPSW及VN单体，KPS 在碳酸盐缓冲液中的含量为0. 1-0. 3wt%，在常压保护气氛围和水浴条件下揽拌反应后，提 取胶乳微粒并清洗后即可。
[0024] 本发明公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒的一种改进， SDS在碳酸盐缓冲液中的含量为0. 08-0. 15wt%。本方案中SDS浓度的大小对所制备出的 PVN纳米微球的粒径具有显著影响。当SDS浓度较大时，所生成的PVN胶束数目越多，而其 形成的PVN胶束粒径却随之减小，在一定范围可用调节SDS浓度的方法来调节PVN乳胶粒 的粒度，从而控制PVN纳米胶乳微粒的粒径为80nm-120nm。
[0025] 本发明公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒的一种改进， 水浴的溫度为70-85摄氏度。
[0026] 本发明公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒的一种改进， 保护气氛围为氮气和二氧化碳混合气，其中二氧化碳占混合气总量的5-15 (v/v) %。通过采 用氮气和二氧化碳混合气作为保护气，不仅仅可W起到保护隔绝降低杂质和副反应发生的 作用，还可W通过调节二氧化碳的含量来调节和维持碳酸缓冲液的PH，提高缓冲液的缓冲 能力，从而维持PVN胶乳微粒的制备稳定性，提高微粒的质量。
[0027] 本发明公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒，包括试剂 R1、试剂R2W及NGAL试剂参考标准品，其中：
[0028]试剂 R1:
[0029]Tris 10-100mM
[0030]NaCl 50-200mM
[0031]BSAO. 05%-1%
[0032]Tween-20 0. 01% -0. 1%
[0033]阳GO. 5 %-3%
[0034] NaNs 0. 1%
[0035]试剂 R2:
[0036]TrislO-lOOmM
[0037]NaCl 50-200mM
[0038]BSAO. 05 %-1 %
[0039]Tween-20 0. 01%-〇.1%
[0040]NaNs 0. 1%
[00川薦糖1%-10%
[004引NGAL抗体致敏胶乳微粒0. 1 % -1 %，NGAL抗体致敏胶乳微粒直径50-150皿；
[0043]NGAL试剂参考标准品：
[0044]TrislO-lOOmM
[0045]NaCl 50-200mM
[0046]BSAO. 05 %-1 %
[0047]Tween-20 0. 01% -0. 1%
[0048]邸TA 0. 5-5mM
[0049]化N3 0. 1 %
[0050] 重组人NGAL蛋白纯品。
[0051] 作为一种优选，所述试剂R1中PEG的数均分子量为6000。
[0052] 作为一种优选，所述试剂R1、试剂R2W及NGAL试剂参考标准品的酸碱度均为 抑 7-8。
[005引机理：
[0054] 采用化学交联方法，将具有高特异性、高亲和力的NGAL抗体偶联至胶乳微粒表面 的簇基官能团上，当此胶粒与样本混合时，在促凝剂作用下，抗体与样本中的抗原发生特异 性结合，形成抗原-抗体-胶乳微粒复合物，产生一定的浊度变化。在一定范围内，反应液 吸光度值与样本中抗原NGAL含量成正比关系。通过测定一系列已知浓度的NGAL标准品与NGAL试剂反应的吸光度，绘制标准曲线，便可根据待测样本的吸光度值测得NGAL含量。
[00巧]本发明在免疫比浊法的基础上引入具有一定粒径的纳米微球，将抗体包被与微球 表面，当抗体与样本中的抗原结合时，形成一个更大的抗原-抗体-胶乳微粒复合物，增加 了浊度变化，从而提高了检测反应的灵敏度。另一方面，本发明采用化学偶联的技术，将抗