一种酶法再生atp的方法及其应用

一种酶法再生atp的方法及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种酶法再生ATP的方法包括以下步骤：(1)制备并获得ATP再生酶；(2)反应液中ATP的再生；(3)分离产物和ATP再生酶。根据本发明的再生ATP的方法，其具有如下有益效果：(1)采用新型Ppk、Adk、Pap三种ATP再生酶，酶促反应中消耗的ATP可被循环再生，大大降低ATP使用量，再生过程简单高效，反应容易控制，稳定性高。(2)反应需添加的底物多聚磷酸或其盐价格低廉，污染小。(3)酶促反应不需要添加高价的ATP起始反应，添加ADP或者廉价的AMP。(4)建立了ATP再生酶回收体系，适用于工业化大规模生产。
【专利说明】
-种酶法再生ATP的方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及生物技术领域，特别设及一种酶法再生ATP的方法及其应用。
【背景技术】
[0002] S憐酸腺巧(ATP)由一个腺巧(A)和S个憐酸基团(Pi)组成，分子量为507,分子式 Cl出16化化3P3。它是生物能量的转换器和胆存器，在设及能量的酶促反应中，起着不可替代的 重要作用。ATP分子呈A-Pi~Pi~Pi结构，远离腺巧的两个憐酸键由~表示，为高能憐酸键。 在反应过程中，ATP分子的高能憐酸键可断裂释放大量能量:当一个高能憐酸键断裂时，ATP 分子转化为二憐酸腺巧(ADP)，释放能量30.5kJ/mol;当第二个高能憐酸键断裂时，ADP分子 转化为腺巧酸(AMP)，可再释放能量27.6kJ/mol。在大部分酶促反应中，ATP通过水解为ADP 供能，但在实际生产中，反应体系中的ADP会继续水解产生AMP。
[0003] 由于目前ATP成本偏高，在工业生产中直接使用ATP进行酶促反应收益甚微。另外， ATP的大量添加导致反应过程出现沉淀物，同时增加了后期产物的纯化难度。因此，能够在 反应生产中投入的少量ATP，通过建立稳定、有效的ATP再生体系，使ATP在反应过程中循环 利用是目前利用ATP进行工业化生产的研究方向。
[0004] ATP在生物体内主要通过的底物水平憐酸化、氧化憐酸化和光合憐酸化等方法再 生，进行催化作用的酶系通常比较复杂，需要在含有活性酶系的活性细胞或者活性细胞器 内进行。工业上ATP再生常用的方法是利用酵母菌的糖酵解途径，进行底物水平憐酸化方式 再生ATP。此方法虽然再生效果良好，但是经酵母细胞酶系催化再生ATP的反应过程复杂，参 与催化反应的酶众多，反应过程不易控制，产品批次间质量差异较大。同时酵母酶系质量常 因供应的厂家不同、批次不同、甚至季节不同而有很大差异。另外反应过程需要加入大量的 酵母细胞酶液，引入了许多蛋白、色素等杂质给后期纯化带来一定困难。近年来，ATP再生的 研究重点转向使用单一酶或较简单的酶系，获得高效稳定的再生效果。其中，乙酸激酶、氨 激酶、丙酬酸激酶等酶均可有效再生ATP。但是，运些酶所利用的底物价值昂贵，如丙酬酸激 酶所利用的憐酸締醇式丙酬酸，且生成的副产物有一定的生物毒性和污染性，如乙酸激 酶、氨激酶催化反应的产物为分别为乙酸和氨气，因此较难在工业生产中大量使用。
[0005] 有研究表明，在某些细菌体内存在利用多聚憐酸或其盐再生ATP的酶系。该酶系包 括多聚憐酸激酶化C 2.7.4.1，Ppk)、腺巧酸激酶化C 2.7.4.3，Adk)和多聚憐酸-腺巧酸憐 酸转移酶化C 2.7.4. -，Pap)，本发明统称S种酶为"ATP再生酶"。其中，Ppk催化ADP与多聚 憐酸或其盐反应生成ATP ,Adk催化2分子ADP生成1分子ATP和1分子AMP，Pap则催化AMP与多 聚憐酸或其盐反应生成ADP，S种酶的合理组合均可用于合成ATP(参见图1)。另外，Ppk酶有 巧kl和化k2两种不同形式，Ppkl在多聚憐酸或其盐聚合度较高时有ATP再生作用，而巧k2可 利用低聚合度的多聚憐酸或其盐再生ATP，两种巧k酶均可用于ATP再生。使用巧k、Adk和化P 酶组合的方式再生反应中的ATP，反应底物价格低廉，产物污染相对较小，且对反应用酶的 影响较小，因此，可W开发用于工业化生产。

【发明内容】

[0006] 本发明提供了一种酶法再生ATP的方法及其应用，其通过使用化k、A化和PapS种 "ATP再生酶"再生ATP，克服现有技术的上述缺陷。
[0007] 本发明所要解决的技术问题是通过W下技术方案来实现的：
[000引一种酶法再生ATP的方法，包括W下步骤：
[0009] (1)制备ATP再生酶：
[0010] 通过基因工程改造、发酵、纯化获得ATP再生酶，或W自然提取等其它方式获得ATP 再生酶。ATP再生酶可W游离酶的形式制成酶液或者干粉;也可进一步固定于固定化载体 上，制得固定化ATP再生酶。
[0011] (2)反应液中ATP的再生：
[0012] 在酶促反应体系中，按需求添加 ATP、ADP或AMP中的一种、任意两种或S种组合，进 行酶促反应。同时，按比例添加 S种ATP再生酶的一种、任意两种或S种组合，并添加多聚憐 酸或其盐为憐酸供体，进行ATP再生反应。反应体系中还包含儀离子和/或儘离子，钟离子、 钢离子、锭离子中的一种或几种，Tris或憐酸根离子。本发明添加的底物、酶及各类盐可一 次性加入反应体系，也可按照工业生产工艺流程分批次流加补入。
[OOU] (3)分离产物和ATP再生酶：
[0014]固定化的ATP再生酶在反应罐中直接分离。上述分离可通过滤袋分离，也可在反 应柱中直接分离。或
[001引游离的ATP再生酶通过滤器中超滤膜分离。其中，过滤器具有进料口、出料口和回 流口，内设截留的超滤膜。经过滤器的截留液为回收的酶液，滤出液为分离出酶之后含产物 的反应液。
[0016] 回收的ATP再生酶可重复利用于步骤(2)。
[0017] 优选地，上述技术方案中，步骤（1)所述的ATP再生酶选自于多聚憐酸激酶化C 2.7.4.1，化k，包括化kl酶和化k2酶）、腺巧酸激酶化C 2.7.4.3，A化）、多聚憐酸-腺巧酸憐 酸转移酶化C 2.7.4.-，化P)中的一种、任意两种或S种组合，即单独使用化k、A化或化P，或 使用化k和Adk组合、A化和化P组合或化k和化P组合，或化k、Adk和化pS种的组合。更优选 的，选自上述S种ATP再生酶中的任意两种或S种组合，即使用化k和Mk组合、A化和Pap组 合或巧k和化P组合W及巧k、A化和化pS种的组合。
[001引其中，当选用P地与Mk两种酶组合时，P地与Mk活性比例为（10-0.1) :1;
[0019] 其中，当选用Ppk与Pap两种酶组合时，Ppk与Pap的活性比例为（10-0.1): 1;
[0020] 其中，当选用Pap与Mk两种酶组合时，Pap与Mk活性比例为（10-0.1) :1;
[0021] 其中，当选用Ppk、Pap与AdkS种酶组合时，Ppk、Pap与Adk活性比例为（10-0.1): (10-0.1):1。
[0022] 上述的化k、Adk、化P可W来源于任何生物、或者是经过人工改造具有同样催化功 能的酶。Ppk可W是巧kl酶和/或巧k2酶。
[0023] 优选地，上述技术方案中，步骤(1)所述固定化载体选自于高分子载体、无机载体、 磁性高分子微球载体中的一种或多种。其中，高分子载体选自于纤维素、葡萄糖凝胶、琼脂 糖、聚丙締酷胺、多聚氨基酸、聚苯乙締、聚丙締酸、海藻酸钢、壳聚糖、淀粉、聚乙締醇、明 胶、卡拉胶、尼龙或合成高聚物等;无机载体选自于多孔玻璃、氧化娃、硅胶、活性炭或娃藻 ±等。
[0024] 优选地，上述技术方案中，所述的固定化ATP再生酶通过下列方式固定于固定化载 体:吸附、包埋、共价、结合、交联或其组合。其中，Pap、A化、PpkS种酶可分别固定或按比例 混合后一起固定。
[0025] 优选地，上述技术方案中，步骤(2)ATP再生反应条件如下：
[00%] 反应溫度为25-60°C，优选溫度为30-50°C ;
[0027] 反应抑为5-10,优选抑为6-9。
[002引酶促反应体系包括:ATP、ADP和AMP中的一种、任意两种或立种组合，S种物质根据 酶促反应需求量，按照任意比例添加；
[0029] 再生反应体系包括:多聚憐酸或其盐，包括儀离子、儘离子中的一种或两种，锭离 子、钟离子、钢离子的一种或几种，Tris或憐酸根离子。
[0030] 优选地，上述技术方案中，本发明添加的底物、酶及各类盐可一次性加入反应体 系，也可按照工业生产工艺流程分批次流加补入。
[0031] 优选地，上述技术方案中，本发明添加的多聚憐酸或其盐的摩尔浓度为反应添加 的ATP、ADP和AMP摩尔浓度总和的0.01-40倍;儀离子浓度为0.0 l-0.2M;儘离子浓度为0.01-0.15M;钟离子浓度为0.01 -0.5M;钢离子浓度为0.01-0.5M;锭离子浓度为0.005-0.2M; Tr i S 浓度为0.0 l-0.1M、憐酸盐浓度为0.0 l-0.1M。
[0032] 优选地，上述技术方案中，多聚憐酸或其盐选自于多聚憐酸钢、多聚憐酸钟、多聚 憐酸锭、六偏憐酸(钢）、四聚憐酸(钢)和=聚憐酸(钢）中的一种或多种;儀离子选自于氯化 儀、硫酸儀、亚硫酸儀和硝酸儀中的一种或多种;儘离子选自于氯化儘和硫酸儘中的一种或 多种;钟离子选自于氯化钟、硫酸钟、硝酸钟、氨氧化钟、亚硫酸钟、碳酸钟、碳酸氨钟、醋酸 钟、憐酸氨二钟、憐酸二氨钟和巧樣酸钟中的一种或多种;钢离子选自于氯化钢、硫酸钢、硝 酸钢、氨氧化钢、亚硫酸钢、碳酸钢、碳酸氨钢、醋酸钢、憐酸氨二钢、憐酸二氨钢和巧樣酸钢 中的一种或多种;锭离子选自于氯化锭、硫酸锭、硝酸锭、氨水、碳酸锭、碳酸氨锭、憐酸氨二 锭、憐酸二氨锭和醋酸锭中的一种或多种。
[0033] 本发明方法步骤(3)中采用的超滤膜选自于醋酸纤维素膜、聚讽膜、聚丙締腊膜、 聚氯乙締膜、聚偏氣乙締膜、聚酷胺膜或陶瓷膜。
[0034] -种酶法再生ATP的方法的应用，所述方法用于多种依赖ATP的酶促反应，用于合 成物质W及无细胞蛋白表达。
[0035] 优选地，上述技术方案中，所述依赖ATP的酶促反应为转移憐酸根基团的转移酶所 参与的酶促反应，W及部分连接酶所参与的酶促反应。
[0036] 优选地，上述技术方案中，所述转移憐酸根基团的转移酶所参与的酶促反应为酶 法合成憐酸肌酸、憐酸精氨酸、6-憐酸己糖、1,6-二憐酸果糖、3-憐酸甘油、氧化型辅酶II、 AMP、CT (D) P、GT (D) P、UT (D) P的反应;所述部分连接酶所参与的酶促反应为酶法合成乙酷辅 酶A、肌肤、肠杆菌素、谷氨酷胺及心茶氨酸的反应。
[0037] 本发明上述技术方案，具有如下有益效果：
[003引（1)采用新型化k、A化、化pS种ATP再生酶，酶促反应中消耗的ATP可被循环再生， 从而大大降低ATP的使用量。且再生过程简单高效，反应容易控制，稳定性高。
[0039] (2)反应需添加的底物多聚憐酸或其盐价格低廉，污染小，且对反应用酶的影响较 小。
[0040] (3)酶促反应不需要添加高价的ATP起始反应，添加 ADP或者廉价的AMP，W及S种 物质的任意两种或=种组合均可W正常进行催化反应。
[0041] (4)建立了 ATP再生酶回收体系，适用于工业化大规模生产。
[0042] 此外，本发明中所描述的ATP再生体系可应用于多种依赖ATP的酶促反应，尤其是 转移憐酸根基团的转移酶化C 2.7)所参与的酶促反应，例如:憐酸肌酸、憐酸精氨酸、6-憐 酸己糖、1,6-憐酸果糖、3-憐酸甘油、氧化型辅酶11、41?、圳(0化、61'(0冲、1]1'(0化等物质的 合成反应，W及部分连接酶巧C 6)所参与的酶促反应，例如：乙酷辅酶A、肌肤、肠菌素、谷氨 酷氨和k茶氨酸等物质的合成反应。上述酶促合成反应所需的催化用酶及底物见下表1。表 1所列催化用酶可W来源于任何生物、或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶，可商购 获得。
[0043] 最后，本发明中所描述的ATP再生体系还可应用于无细胞蛋白表达等消耗生物能 量的新技术中。
[0044] 表1.本发明所设及的酶促反应催化用酶及底物 [00451
[00461

【附图说明】
[0047] 图1为本发明P地、A化、PapS种酶再生ATP的原理图。
[004引图2为本发明所表达的巧k、A化、化P酶的SDS-PAGE图。
[0049] 图3为本发明使用游离的ATP再生酶的反应工艺流程图。
[0050] 图4为本发明使用固定化ATP再生酶的反应工艺流程图。
[0051 ]图5为本发明应用于憐酸肌酸生产的肌酸和憐酸肌酸的浓度变化图。
[0化2] 图6为本发明应用于无细胞表达A化酶的SDS-PAGE图。
【具体实施方式】
[0053]下面对本发明的具体实施例进行详细描述，W便于进一步理解本发明。
[0化4] 实施例1P地、A化和化P酶的制备
[0055]本发明方法中的化k(包括化Id和化k2)、A化和化P酶可W商购获得，或者是经过人 工改造具有同样催化功能的酶。
[0化6] P地1、巧k2、A化和Pap酶的制备过程如下：
[0057]根据四种酶基因的序列，设计四对扩增引物，由中美泰和生物技术有限公司合成， 引物序列如下：
[0化引 卵41正义引物：5'-0：41416661'〔46644446口'414〔41'〔6-3'；
[0059] 卵41反义引物：5'-〔66410：7^7^4661767^6461641'1'-3'；
[0060] 卵k2正义引物：5 ' -TACATATGGCCAGCCCGGCGCAGAAG-3 ' ；
[0061 ]卵k2反义引物：5 ' -TGAATTCAGGCCGGGATATCCAGGTTC-3 ' ；
[0062] a化正义引物：5 ' -CCATATGCGTATCATTCTGCTTGGCGCTCCGG-3 ' ；
[0063] a化反义引物：5 ' -CGGATCCTTAGCCGAGGATTTTTTCCAGATC-3 ' ；
[0064] pap正义引物：5 ' -GCCATGGATACAGAAACGATCGCCAGTGCAG-3 ' ；和 [00化]pap反义引物：5 ' -CGGATCCTTAATCCGTGTCGCGATCCGCTT-3 ' ；
[0066] 提取大肠杆菌化schericMa COli化12菌株(购于天根生化科技有限公司）DM, W 其为模板，通过PCR扩增出PPkl与adk基因片段，并将其分别连接至pET 22b载体（购于 Novagene公司）；提取铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)菌株（CICC 10419)DNA，W 其为模板，通过PCR扩增出ppk2基因片段，并将其连接至祀T2化载体(购于Novagene公司）； 提取约氏不动杆菌（Acinetobacter johnsonii)菌株（CGMCC 1.8030)DNA，W其为模板，通 过PCR扩增出pap基因片段，并将其连接至祀T2化载体(购于Novagene公司）。4段连接序列经 测序正确后，分别转入E.coli BL2UDE3)菌株(购于天根生化科技有限公司）。
[0067] 将转化后的E.coli BL2UDE3)单克隆接入LB培养基，培养至对数期后，加入ImM异 丙基-0-D-硫代化喃半乳糖巧(IPTG)诱导5小时后，收集菌体，十二烷基横酸钢-聚丙締酷胺 凝胶电泳(SDS-PAGE)筛选高表达菌株。
[0068] 将筛选出的高表达菌株在无菌条件下接入种子培养基，培养至对数生长期后接入 含化发酵培养基的发酵罐中，培养至对数生长期后接入含50L发酵培养基的发酵罐中，培养 5小时后加入ImM IPTG诱导5小时后，离屯、收集菌体约1 kg。
[0069] 其中LB培养基成分为：1 %蛋白腺、0.5 %酵母粉和1 %化Cl;种子培养基成分为： 1%蛋白腺、0.5%酵母粉和1%氯化钢;发酵培养基成分为：1%蛋白腺、0.5%酵母粉、1%氯 化钢、5 %憐酸氨二钢、1 %憐酸二氨钢、0.0 l %硫酸儀和1 %甘油。
[0070] 收获的菌体分别经超声或高压匀浆破菌后，离屯、收集上清。然后加40-60%饱和的 硫酸锭，离屯、收集沉淀。经Tris缓冲液抑8.0溶解后，使用G25柱(购于通用电气医疗生物科 学有限公司）脱盐，再经CM-或DEAE-Sepharose FF(购于通用电气医疗生物科学有限公司） 层析可得到初步纯化的游离酶。
[0071] 图2为所制备酶的SDS-PAGE图，如图所示：泳道1为蛋白标志物14.4-116kDa(购于 北京中科瑞泰生物技术有限公司）；泳道2为化kl酶，约60kDa;泳道3为化k2酶，约45kDa;泳 道4为Mk酶，约25kDa;泳道5为化P酶，约55kDa。
[0072] 使用现有技术记载的公知的测定酶活性的方法，检测到Img/ml化kl、化k2、A化 和Pap酶液活性分别约为100U、500U、1000U和800U，其中将IiiM底物在1分钟内完全转化定义 为1个活性单位化)。
[0073] 实施例2酶促法生产憐酸肌酸偶联ATP再生体系
[0074] 图3为本发明方法使用游离酶进行酶促反应并偶联ATP再生体系的工艺流程图。参 见图3,酶法制备憐酸肌酸同时偶联游离的ATP再生体系的操作步骤如下：
[0075] (1)在反应罐中合成憐酸肌酸和再生ATP的反应：
[0076] 在反应罐中，IOOL无菌水的反应体系为含有底物1.5kg肌酸，W及1.0kg ATP、 0.5kg憐酸氨二钢、0.38kg氯化钟、0.3kg氯化钢、0.2kg硫酸锭、1. Okg六水氯化儀和2. Okg四 聚憐酸钢的溶液，配制时均匀揽拌防止出现沉淀。调节pH值至约7.5,在反应体系中添加 500U/L肌酸激酶及500U/L巧k2酶、500U/L A化酶开始反应。反应期间控制pH值为7.5，溫度 为 35°C。
[0077] 图5为每隔1小时高效液相色谱化PLC)检测肌酸的剩余量及憐酸肌酸的生成量。反 应5小时后，憐酸肌酸生成量约为22g/L，约50% W上ATP转化为ADP、AMPdHPLC检测条件为： Kromasil C18色谱柱（购于AKZO NOB化公司）（150 X 4.6mm)，检测波长210nm，检测溫度25 °C，检测流速Iml/min，流动相为含有20mM憐酸二氨钟、0.1 %TFA和5%乙腊的水溶液。
[0078] (2)在过滤器中分离肌酸激酶和ATP再生酶：
[0079] 通过超滤方法，将步骤（1)的反应体系的反应液经过过滤器过滤分离肌酸激酶和 ATP再生酶，过滤器内装膜包(购于化11公司，截留分子量8W)a)，滤出液为分离出酶之后的 反应液，含有憐酸肌酸、ATP、ADP、AMP及盐等物质，可通过离子交换层析等方式进一步纯化。
[0080] 检测到回收的肌酸激酶、P地2酶和Adk酶的活性较反应前减少5 % -20 %不等，可添 加相应新酶后再次用于步骤(1)反应。
[0081] 实施例3酶促法生产1,6-二憐酸果糖偶联ATP再生体系（固定化酶）
[0082] 图4为本发明方法使用固定酶进行酶促反应生产并偶联ATP再生体系的工艺流程 图。参见图4,固定酶法制备1,6-二憐酸果糖同时偶联ATP再生体系的操作步骤如下：
[0083] (1)催化用酶与ATP再生酶的固定：
[0084] 催化用酶果糖激酶(FK)和憐酸果糖激酶(PFK)通过商购获得，同实施例1中初步纯 化的ATP再生酶巧k2酶和化P酶一同W商业化的环氧基固定化载体LX1000EP固定。
[0085] 将FK、PFKJpk2和Pap酶按照活性比1:1:1:1混合配成混合酶液10L，酶液中各酶 活性均约为200U。在恒溫揽拌罐中加入LX1000EP湿载体3kg与上述酶液混合，在20°C条件 下，ISOrpm揽拌12小时。过滤收集载体，用0.02M pH 8.0憐酸钟缓冲液清洗2遍，即得固定化 混合酶。FK、PFK、Ppk2和Pap酶固定化后，活性降低至原活性的30-40%。
[0086] (2)在反应柱中生成1，6-二憐酸果糖：
[0087] 配制反应液，每50L含有底物0.9kg果糖，W及0.3kgATP、0.2kgAMP、0.1 化g Tri S、 0.1kg氯化锭、0.6kg硫酸儀和1.化g六偏憐酸钢的溶液，配制时均匀揽拌防止出现沉淀。调 节抑值至约7.0，溫度升为35-40°C。
[0088] 将上述步骤（1)中的混合固定酶约3kg装入反应柱，排尽气泡后制得酶反应柱。使 用恒流累将反应液W15LA流速由下而上缓慢累入通过酶反应柱，反应期间控制溫度为37 °C。循环反应约6小时后，收集反应液，检测1,6-二憐酸果糖的生成量约为30g/L，70% W上 ATP 转化为 ADP、AMP。
[0089] 固定化酶循环反应20次W上或者-4°C储存时间一月W上，酶活性降低约10-15%， 需按比例补加或更换部分新酶。
[0090] 实施例4酶促法生产肌肤偶联ATP再生体系
[0091] 参见图3,酶法制备肌肤同时偶联游离的ATP再生酶再生ATP的操作步骤如下：
[0092] (1)在反应罐中合成肌肤和再生ATP的反应：
[0093] 在反应罐中，IOOL无菌水的反应体系为含有底物心组氨酸1.8kg、e-丙氨酸1.0kg， W及2. OkgAMP、0.6kg憐酸氨二钢、0.38kg氯化钟、0.3kg氯化钢、1. Okg六水氯化儀和5. Okg 四聚憐酸钢的溶液，配制时均匀揽拌防止出现沉淀。调节抑值至约7.0,在反应体系中添加 800U/L肌肤合成酶及600U/L Adk酶、600U/L Pap酶开始反应。反应期间控制抑值为7.0，溫 度为37°C。
[0094] 反应6小时后，肌肤生成量约为20g/L，约80%^上41?转化为40?、41?。册以：检测条 件为：Kromasi 1 C18色谱柱（购于AKZO NOB化公司）（150 X 4.6mm)，检测波长2IOnm，检测溫 度25 °C，检测流速0.8ml/min，流动相为含有SOmM憐酸盐缓冲液和15 %甲醇的水溶液。
[00M] (2)在过滤器中分离肌肤合成酶和ATP再生酶：
[0096]通过超滤方法，将步骤（1)的反应体系的反应液经过过滤器过滤分离肌肤合成酶 和ATP再生酶，过滤器内装膜包(购于化11公司，截留分子量8W)a)，滤出液为分离出酶之后 的反应液，含有肌肤、ATP、ADP、AMP及盐等物质，可通过离子交换层析等方式进一步纯化。
[0097] 检测到回收的肌肤合成酶、A化酶和化P酶的活性较反应前减少10%-20%不等， 可添加相应新酶后再次用于步骤(1)反应。
[0098] 实施例5酶促法生产茶氨酸偶联ATP再生体系
[0099] 参见图3,酶法制备茶氨酸同时偶联游离的ATP再生体系的操作步骤如下：
[0100] (1)在反应罐中合成茶氨酸和再生ATP的反应：
[0101] 在反应罐中，IOOL无菌水的反应体系为含有底物1.化g谷氨酸钢、0.7kg盐酸乙胺， W及1. Okg ATP、0.5kg憐酸氨二钢、1. Okg六水氯化儀、0.5kg-水氯化儘和2. Okg四聚憐酸 钢的溶液，配制时均匀揽拌防止出现沉淀。调节抑值至约7.0,在反应体系中添加500U/L茶 氨酸合成酶及600U/L A化酶开始反应。反应期间控制pH值为7.0，溫度为30°C。
[0102] 反应5小时后，茶氨酸生成量约为14g/L，约95%^上4了?转化为41?。册1(：检测条件 为:Kromasi 1 C18色谱柱（购于AKZO NO肥L公司）（150 X 4.6mm)，检测波长203皿，检测溫度 30°C，检测流速Iml/min，流动相为含有0.05%TFA和5%乙腊的水溶液。
[0103] (2)在过滤器中分离茶氨酸和ATP再生酶：
[0104] 通过超滤方法，将步骤（1)的反应体系的反应液经过过滤器过滤分离茶氨酸合成 酶和Adk酶，过滤器内装膜包(购于化11公司，截留分子量8W)a)，滤出液为分离出酶之后的 反应液，含有茶氨酸、AMP及盐等物质，可通过离子交换层析等方式进一步纯化。
[0105] 检测到回收的茶氨酸合成酶和Adk酶的活性较反应前减少5%-10%不等，可添加 相应新酶后再次用于步骤(1)反应。
[0106] 实施例6酶促法生产憐酸肌酸偶联ATP再生体系
[0107] 参见图3,酶法制备憐酸肌酸同时偶联游离的ATP再生酶再生ATP的操作步骤如下：
[0108] (1)在反应罐中合成憐酸肌酸和再生ATP的反应：
[0109] 在反应罐中，IOOL无菌水的反应体系为含有底物0.5kg肌酸，W及0.26kgATP、 0.4kgADP、0.化gAMP、0.14kg憐酸氨二钢、0.0化g氯化钟、0.03kg氯化锭、0.1 f5kg-水氯化车孟 和2.Okg多聚憐酸锭(按平均聚合度500计算）的溶液，配制时均匀揽拌防止出现沉淀。调节 抑值至约10.0,在反应体系中添加100U/L肌酸激酶及100U/L化kl酶、1000U/L Pap酶开始 反应。反应期间控制pH值为10.0，溫度为60°C。
[0110] 反应6小时后，憐酸肌酸生成量约为3g/L，约30%^上41?转化为40?、41?。册1(：检 测条件同实施例2步骤(1)。
[0111] (2)在过滤器中分离肌酸激酶和ATP再生酶：
[0112] 通过超滤方法，将步骤（1)的反应体系的反应液经过过滤器过滤分离肌酸激酶和 ATP再生酶，过滤器内装膜包(购于化11公司，截留分子量20kDa)，滤出液为分离出酶之后的 反应液，含有憐酸肌酸、ATP、ADP、AMP及盐等物质，可通过离子交换层析等方式进一步纯化。
[0113] 检测到回收的肌酸激酶、Ppk 1酶和化P酶的活性较反应前减少30%-50%不等，可 添加相应新酶后再次用于步骤(1)反应。
[0114] 实施例7酶促法生产憐酸肌酸偶联ATP再生体系
[0115] 参见图3,酶法制备憐酸肌酸同时偶联游离的ATP再生酶再生ATP的操作步骤如下：
[0116] (1)在反应罐中合成憐酸肌酸和再生ATP的反应：
[0117] 在反应罐中，IOOL无菌水的反应体系为含有底物2. Okg肌酸，W及0.30kg AMP、 I.化g Tris、2.92kg氯化钢、1.33kg硫酸锭、4. Ikg六水氯化儀和21 .Okg六偏憐酸钢的溶液， 配制时均匀揽拌防止出现沉淀。调节pH值至约5.0,在反应体系中添加800U/L肌酸激酶及 1000U/L巧k2酶、100U/L A化酶、800U/L Pap酶开始反应。反应期间控制抑值为5.0,溫度为 25 °C。
[011引反应10小时后，憐酸肌酸生成量约为19g/L，约20%^上41?转化为40?、41?。册1〔 检测条件同实施例2步骤(1)。
[0119] (2)在过滤器中分离肌酸激酶和ATP再生酶：
[0120] 通过超滤方法，将步骤（1)的反应体系的反应液经过过滤器过滤分离肌酸激酶和 ATP再生酶，过滤器内装膜包(购于化11公司，截留分子量8W)a)，滤出液为分离出酶之后的 反应液，含有憐酸肌酸、ATP、ADP、AMP及盐等物质，可通过离子交换层析等方式进一步纯化。
[0121] 检测到回收的肌酸激酶、Ppk2酶、A化酶和化P酶的活性较反应前减少15 % -40 %不 等，可添加相应新酶后再次用于步骤(1)反应。
[0122] 实施例8酶促法生产憐酸肌酸偶联ATP再生体系
[0123] 参见图3,酶法制备憐酸肌酸同时偶联游离的ATP再生酶再生ATP的操作步骤如下：
[0124] (1)在反应罐中合成憐酸肌酸和再生ATP的反应：
[0125] 在反应罐中，IOOL无菌水的反应体系为含有底物1.8kg肌酸，W及4. Okg ATP、 0.6kg TriS、1.05kg氯化锭、2. Okg六水氯化儀和0.4kg多聚憐酸钢(按平均聚合度50计算） 的溶液，配制时均匀揽拌防止出现沉淀。调节抑值至约6.5,在反应体系中添加100U/L肌酸 激酶及300U/L Pap酶开始反应。反应期间控制pH值为6.5，溫度为37°(：。
[01%] 反应7小时后，憐酸肌酸生成量约为21g/L，约90%^上4了?转化为40?。册1(：检测条 件同实施例2步骤(1)。
[0127] (2)在过滤器中分离肌酸激酶和ATP再生酶：
[0128] 通过超滤方法，将步骤（1)的反应体系的反应液经过过滤器过滤分离肌酸激酶和 ATP再生酶，过滤器内装膜包(购于化11公司，截留分子量20kDa)，滤出液为分离出酶之后的 反应液，含有憐酸肌酸、ATP、ADP及盐等物质，可通过离子交换层析等方式进一步纯化。
[0129] 检测到回收的肌酸激酶和化P酶的活性较反应前减少10 % -20 %不等，可添加相应 新酶后再次用于步骤(1)反应。
[0130] 实施例9酶促法生产1，6-二憐酸果糖偶联ATP再生体系（固定化酶）
[0131] 参见图4,固定酶法制备1,6-二憐酸果糖同时偶联ATP再生体系的操作步骤如下：
[0132] (1)催化用酶与ATP再生酶的固定：
[0133] 催化用酶果糖激酶(FK)和憐酸果糖激酶(PFK)通过商购获得，同实施例1中初步纯 化的ATP再生酶Mk酶和化P酶分别W商业化的环氧基固定化载体LX1000EP或含氨基合成高 聚物载体LXl OOOHA固定。
[0134] 分别将FK、PFK、A化和化P酶制成酶液，各化，4种酶液活性均为200-400U。
[01巧]在恒溫揽拌罐中加入LX1000EP湿载体化g与FK酶液化混合，在20°C条件下，ISOrpm 揽拌12小时。过滤收集载体，用0.02M pH 8.0憐酸钟缓冲液清洗2遍，即得固定化F邱每。A化 酶W相同方法固定。
[0136] 在恒溫揽拌罐中加入LX1000HA湿载体Ikg与PFK酶液3L混合，在20°C条件下， 150巧m揽拌12小时。过滤收集载体，用0.02M pH 8.0憐酸钟缓冲液清洗2遍，即得固定化PFK 酶。Pap酶W相同方法固定。
[0137] (2)在反应柱中生成1，6-二憐酸果糖：
[0138] 配制反应液，每50L含有底物1.1kg果糖，W及0.75kgATP、0.25kg憐酸二氨钟、 0.2kg氯化钟、0.6kg硫酸儀和1.25kg四聚憐酸钢的溶液，配制时均匀揽拌防止出现沉淀。调 节抑值至约8.0，溫度升为40-45°C。
[0139] 将上述步骤（1)中的固定酶混合装入反应柱，共约4kg，排尽气泡后制得酶反应柱。 使用恒流累将反应液WlOLA流速由下而上缓慢累入通过酶反应柱，反应期间控制溫度为 42°C。循环反应约6小时后，收集反应液，检测1,6-二憐酸果糖的生成量约为36g/L，50%W 上ATP转化为ADP、AMP。
[0140] 固定化酶循环反应20次W上或者-4°C储存时间一月W上，酶活性降低约10-15%， 需按比例补加或更换部分新酶。
[0141] 实施例10无细胞蛋白表达A化酶偶联ATP再生体系
[0142] 无细胞蛋白表达A化酶同时偶联ATP再生体系的操作步骤如下：
[0143] (1)表达载体PIVEX2.4d-a化的构建：
[0144] 根据adk基因的序列，设计一对扩增引物，由中美泰和生物技术有限公司合成，引 物序列如下：
[0145] a化正义引物：5 ' -TCCATGGGTATCATTCTGCTTGGCGCTCCGG-3 ' ；和
[0146] a化反义引物：5 ' -CGGATCCTTAGCCGAGGATTTTTTCCAGATC-3 ' ；
[0147] 参照实施例1所描述方法，PCR扩增a化基因片段，使用化O I和BamH I双酶切后，连 接至PIVEX2.4d载体(购于Roche公司），构建成PIVEX2.4d-adk载体，经测序正确。
[0148] (2)大肠杆菌无细胞抽提物制备：
[0149] 将E.COli A19(缺失核酸酶I基因，不降解外源基因）单克隆接入LB培养基，培养至 对数生长期后接入含化发酵培养基的发酵罐中，培养至ODsoo达到3时离屯、收集菌体。LB培养 基及发酵培养基成分参见实施例1。
[0150] 用S30缓冲液重悬菌体，4°C离屯、洗涂3次，收集菌体，保存于-80°CdS30缓冲液成分 为：14mM醋酸儀、60mM醋酸钟、ImM二硫苏糖醇(DTT)及1 OmM TriS (pH值8.1)。
[01引]称量菌体重量，每10克菌体加入100mL S30缓冲液重溶，同时加入ImM DTT。在 7化化压力下高压均质破碎菌体，再加入ImM DTT，4°C离屯、收集上清。在恒溫摇床中l(K)rpm、 37°C解育30分钟，制得大肠杆菌无细胞抽提物。
[0152] (3)使用无细胞抽提物表达蛋白偶联ATP再生体系
[0153] 在I(K)山蛋白表达体系中，加入20山步骤(2)所述大肠杆菌无细胞抽提物，加入15ii g/ml步骤（1)所述表达载体piVEX2.4d-a化，加入15mM醋酸儀、50mM醋酸锭、50mM肥阳S-氨 氧化钟（抑值7.5)、2%口668000、2111]\101'1'、0.33111]\1魁扩、0.27111]\1辅酶4、4111]\1草酸、11]/41了7 RNA聚合酶、IOmM ATPUmM GTP、ImM CTP、ImM UTP W及20种氨基酸各2mM，同时加入IUAU A化酶、IUAU Pap酶W及IOmM四聚憐酸盐用作ATP再生。在恒溫摇床中2(K)巧m、30°C反应6小 时。
[0154] 图6为所表达Adk酶的SDS-PAGE图，如图所示:泳道1为蛋白标志物14.4-116kDa(购 于北京中科瑞泰生物技术有限公司）；泳道2为无细胞表达的Adk酶，约25kDa。
[01巧]对比例1酶促法生产憐酸肌酸
[0156] 酶法制备憐酸肌酸的操作步骤如下：
[0157] 在反应罐中，IOOL无菌水的反应体系为含有底物1.5kg肌酸，W及6. Okg ATP、 0.5kg憐酸氨二钢、0.38kg氯化钟、0.3kg氯化钢、0.2kg硫酸锭和1. Okg六水氯化儀的溶液， 配制时均匀揽拌防止出现沉淀。调节pH值至约7.5,在反应体系中添加500U/L肌酸激酶开始 反应。反应期间控制pH值为7.5,溫度为35 °C。
[015引反应5小时后，憐酸肌酸生成量约为15g/L，约90%W上ATP转化为ADP、AMP。HPLC检 测条件同实施例2步骤(1)。
[0159] 对比实施例2可W看出：没有偶联适合酶法生产的ATP再生系统，反应体系需要的 ATP量大大增加，且反应生成的产物量明显减少，从而加大了生产成本。
[0160] 对比例2酶促法生产憐酸肌酸偶联单一 ATP再生酶体系
[0161 ]酶法制备憐酸肌酸并偶联单一ATP再生酶体系的操作步骤如下：
[0162] 在反应罐中，IOOL无菌水的反应体系为含有底物1.5kg肌酸，W及1.0kg ATP、 0.5kg憐酸氨二钢、0.38kg氯化钟、0.3kg氯化钢、0.2kg硫酸锭、1. Okg六水氯化儀和2. Okg四 聚憐酸钢的溶液，配制时均匀揽拌防止出现沉淀。调节pH值至约7.5,在反应体系中添加 500U/L肌酸激酶及2500U/L巧k2酶开始反应。反应期间控制pH值为7.5，溫度为35°C。
[0163] 反应6小时后，憐酸肌酸生成量约为20g/L，约90%W上ATP转化为ADP、AMP。HPLC检 测条件同实施例2步骤(1)。
[0164] 对比实施例2及对比例1可W看出：偶联一种ATP再生酶的体系的再生效果没有偶 联两种或者S种ATP再生酶组合体系的效果好:反应总体需要的酶量需要增加，且生成产物 量有所减少，反应时间增长。但是此方法的优点在于可W降低ATP的使用量，使反应中的ATP 部分得到再生，从而降低生产成本。本发明采用新型巧k、Adk、化pS种ATP再生酶，酶促反应 中消耗的ATP可被循环再生，从而大大降低ATP用量，且再生过程简单高效，反应容易控制， 稳定性高;其次，反应需添加的底物多聚憐酸或其盐价格低廉，污染小，且对反应用酶的影 响较小;再次，酶促反应不需要添加高价的ATP起始反应，添加 ADP或者廉价的AMP，从及立种 物质的任意两种或S种组合均可W正常进行催化反应;最后，建立了 ATP再生酶回收体系， 适用于工业化大规模生产。
[01化]本发明中所描述的ATP再生体系还可应用于多种依赖ATP的酶促反应。还还可应用 于无细胞蛋白合成等消耗生物能量的新技术中。
[0166]虽然本发明已W实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人 员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范 围由权利要求书及其等同形式所限定。
【主权项】
1. 一种酶法再生ATP的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1) 制备并获得ATP再生酶： 通过基因工程改造、发酵、纯化或自然提取来获得ATP再生酶;该ATP再生酶是以游离酶 的形式制成酶液或干粉，或是以固定化酶形式固定于固定化载体上； (2) 反应液中ATP的再生： 添加 ATP、ADP和AMP的一种或多种组合，进行酶促反应； 添加 ATP再生酶； 添加多聚磷酸或其盐为磷酸供体，进行ATP再生反应； (3) 分离产物和ATP再生酶： 固定化的ATP再生酶在反应罐中直接分离;或 游离的ATP再生酶通过滤器中超滤膜分离;经过滤器的截留液为回收的ATP再生酶，滤 出液为分离出酶之后含产物的反应液。2. 根据权利要求1所述的酶法再生ATP的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤： (4) 回收的ATP再生酶重复利用于步骤(2)。3. 根据权利要求1所述的酶法再生ATP的方法，其特征在于，所述ATP再生酶选自于多聚 磷酸激酶(Ppk)、腺苷酸激酶(Adk)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(Pap)的一种或多种组 合。4. 根据权利要求3所述的酶法再生ATP的方法，其特征在于，当选用Ppk和Adk两种酶组 合时，Ppk与Adk活性比例为（10-0.1): 1;当选用Ppk和Pap两种酶组合时，Ppk与Pap的活性比 例为（10-0.1): 1;当选用Pap和Adk两种酶组合时，Pap与Adk活性比例为（10-0.1): 1;当选用 Ppk、Pap和Adk三种酶组合时，Ppk、Pap与Adk活性比例为（10-0 · 1): (10-0 · 1): 1。5. 根据权利要求3所述的酶法再生ATP的方法，其特征在于，所述固定化ATP再生酶通过 吸附、包埋、共价、结合和交联的一种或多种方式固定于固定化载体;三种ATP再生酶可分别 固定或按比例混合后一起固定。6. 根据权利要求1所述的酶法再生ATP的方法，其特征在于，所述步骤（2)中ATP再生反 应条件如下： 反应温度为25-60 °C; 反应pH为5-10; 酶促反应体系包括:ATP、ADP和AMP中的一种或多种组合，三种物质根据需求按任意比 例添加； 再生反应体系包括:多聚磷酸或其盐，镁离子和/或锰离子，铵离子、钾离子和钠离子的 一种或多种，Tris或磷酸根离子。7. 根据权利要求6所述的酶法再生ATP的方法，其特征在于，多聚磷酸或其盐的摩尔浓 度为反应添加的ATP、ADP和AMP的一种或多种的摩尔浓度总和的0.01-40倍;镁离子浓度为 0.01 -0.2M;锰离子浓度为0.01 -0.15M;钾离子浓度为0.01-0.5M;钠离子浓度为0.01 -0.5M; 铵离子浓度为〇. 005-0.2M; Tris浓度为0.01-0.1M、磷酸盐浓度为0.01-0.1M。8. 根据权利要求1-7任一权利要求所述的酶法再生ATP的方法的应用，其特征在于，所 述方法用于多种依赖ATP的酶促反应，用于合成物质以及无细胞表达蛋白。9. 根据权利要求8所述的酶法再生ATP的方法的应用，其特征在于，所述依赖ATP的酶促 反应为转移磷酸根基团的转移酶所参与的酶促反应，以及部分连接酶所参与的酶促反应。10.根据权利要求9所述的酶法再生ATP的方法的应用，其特征在于，所述转移磷酸根基 团的转移酶所参与的酶促反应为酶法合成磷酸肌酸、磷酸精氨酸、6-磷酸己糖、1，6_二磷酸 果糖、3-磷酸甘油、氧化型辅酶11^10\(：1'(0)?、61'(0汗及1]1'(0汗的反应 ;所述部分连接酶所 参与的酶促反应为酶法合成乙酰辅酶A、肌肽、肠杆菌素、谷氨酰胺及L-茶氨酸的反应。
【文档编号】C12P21/02GK105861598SQ201610268246
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】刘珊珊, 于铁妹, 秦永发
【申请人】深圳市古特新生生物科技有限公司