一种检测丹参酮iia的方法及其专用酶联免疫试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测丹参酮IIA的方法及其专用酶联免疫试剂盒，属于生物技术 领域。
【背景技术】
[0002] 丹参为临床常用中药，具有活血祛瘀，调经止痛，清热安神，凉血消痈等功效。丹参 中的丹参酮类化合物表现出多种药理活性，对心脑血管疾病、肝炎、白血病等具有潜在的治 疗作用。丹参酮IIA是其主要丹参酮类成分，2010版《中国药典》以丹参酮IIA作为丹参质 量控制指标性成分之一。
[0003]目前，丹参酮IIA检测方法有薄层色谱法、高效液相色谱法、液质联用技术、近红 外光谱检测等技术，但上述方法均无法同时满足简单快速、高通量、现场检测的需求。酶联 免疫吸附检测法具有操作简便、灵敏度高、通量高、检测快速、成本低廉等特点，在中药材的 品质鉴定方面应用广泛。丹参市场需求量大，但市售丹参药材质量参差不齐，严重影响丹参 药用疗效及其他复方产品开发应用，所以建立一种简便、快速、高通量的丹参酮IIA的检测 方法对丹参的质量控制具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0004]本发明的第一个目的是提供抗丹参酮IIA的单克隆抗体，
[0005]本发明提供的抗丹参酮IIA的单克隆抗体由保藏号为CGMCCNo. 10879的杂交瘤 细胞株分泌的。
[0006]本发明的第二个目的是提供一株分泌抗丹参酮IIA的单克隆抗体的杂交瘤细胞 株DST2H4。
[0007]本发明提供的分泌抗丹参酮IIA的单克隆抗体的杂交瘤细胞株DST2H4的保藏号 为CGMCCNo. 10879。
[0008]本发明保护保藏号为CGMCCNo. 10879的杂交瘤细胞株DST2H4,该杂交瘤细胞株 的分类命名为小鼠杂交瘤细胞系，该杂交瘤细胞株已于2015年6月2日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。
[0009]本发明的第三个目的是提供上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株DST2H4的新 用途。
[0010] 本发明提供了上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株DST2H4在检测或辅助检测 待测样品中丹参酮IIA含量中的应用。
[0011] 本发明还提供了上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株DST2H4在比较或辅助比 较待测样品中丹参酮IIA含量高低中的应用。
[0012] 本发明还提供了上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株DST2H4在制备检测或辅 助检测待测样品中丹参酮IIA含量的试剂或试剂盒中的应用。
[0013] 本发明还提供了上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株DST2H4在制备检测或辅 助检测待测样品中丹参酮IIA含量的胶体金试纸条中的应用。
[0014] 本发明的第四个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品中丹参酮IIA含量的 酶联免疫试剂盒。
[0015] 本发明提供的检测或辅助检测待测样品中丹参酮IIA含量的酶联免疫试剂盒包 括独立包装的上述单克隆抗体。
[0016] 本发明提供的检测或辅助检测待测样品中丹参酮IIA含量的酶联免疫试剂盒还 可含有分别为独立包装的丹参酮IIA标准品和/或用于标记所述单克隆抗体的标记酶；
[0017] 所述丹参酮IIA标准品可为丹参酮IIA或由所述丹参酮IIA配制成的一系列不 同浓度的丹参酮IIA溶液；所述一系列不同浓度的丹参酮IIA溶液的浓度具体可为：40ng/ mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2. 5ng/mL、1. 25ng/mL和 0? 625ng/mL;所述丹参酬IIA溶液的 溶剂具体可为PBS缓冲液；所述PBS缓冲液的溶剂为水，溶质为Na2HP04、KH2P〇dPNaCl，溶 质Na2HP04、KH2P〇dPNaCl在所述PBS缓冲液中的浓度分别为0. 02M、0. 0015M和0. 14M，pH 值为7. 5;
[0018] 所述标记酶具体可为辣根过氧化物酶。
[0019] 本发明提供的检测或辅助检测待测样品中丹参酮IIA含量的酶联免疫试剂盒还 可含有分别为独立包装的包被缓冲液和/或洗涤液和/或底物缓冲液和/或终止缓冲液和 /或封闭液；
[0020] 所述包被缓冲液的溶剂为水，溶质为Na2C0jPNaHCO3;溶质Na20)3和NaHCO3在所 述包被缓冲液中的浓度分别为〇. 01M和0. 04M;所述包被缓冲液的pH值为9. 6 ;
[0021] 所述洗涤液的溶剂为水，溶质为Na2HP04、KH2P04、NaCl和吐温-20 ;溶质Na2HP04、 KH2P04、NaCl和吐温-20在所述洗涤液中的浓度分别为0. 02M、0. 0015M、0. 14M和0. 1% (体 积百分含量）；所述洗涤液的pH值为7. 5 ;
[0022] 所述底物缓冲液的溶剂为水，溶质为柠檬酸三钠和Na2HP04;溶质柠檬酸三钠和 Na2HP04在所述底物缓冲液中的浓度分别为0. 01M和0. 03M;所述底物缓冲液的pH值为 5. 5；
[0023] 所述终止缓冲液为2M的硫酸水溶液；
[0024] 所述封闭液的溶剂为水，溶质为Na2HP04、KH2P04、NaCl和脱脂牛奶；溶质Na2HP04、 KH2P04、NaCl和脱脂牛奶在所述封闭液中的浓度分别为0. 02M、0. 0015M、0. 14M和3% (质量 百分含量）；所述封闭液的pH值为7. 5。
[0025] 上述酶联免疫试剂盒中，所述样品为丹参。
[0026] 上述酶联免疫试剂盒在检测或辅助检测待测样品中丹参酮IIA含量中的应用也 属于本发明的保护范围。
[0027] 上述应用中，所述样品为丹参。
[0028] 本发明提供了一种检测丹参酮IIA的方法及其专用酶联免疫试剂盒。本发明所提 供的酶联免疫试剂盒包括抗丹参酮IIA单克隆抗体，该单克隆抗体是通过间接竞争ELISA 方法筛选出的杂交瘤细胞株CGMCCNo. 10879分泌的。通过实验证明：本发明所提供抗丹参 酮IIA的单克隆抗体特异性强，对隐丹参酮的交叉反应率为28. 321%;对丹参酮I的交叉 反应率为10. 088%;对二氢丹参酮的交叉反应率为3. 105%;对丹酸酸B、丹参素和迷迭香 酸的交叉反应率均小于0. 001% ;利用该单克隆抗体制备得到的间接竞争酶联免疫试剂盒 可用于定性或定量检测待测样品中的丹参酮IIA，线性检测范围在1. 01~20. 89ng/mL，具 有快速、灵敏的优点。
【附图说明】
[0029] 图1为丹参酮IIA和丹参酮IIB的化学结构。
[0030] 图2为丹参酮IIA完全抗原制备路线图。
[0031] 图3为酶联免疫试剂盒检测丹参酮IIA浓度的标准曲线。
[0032] 图4为ELISA检测样品中丹参酮IIA含量结果与HPLC检测结果相关性曲线图。
【具体实施方式】
[0033] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0034] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0035] 弗氏完全佐剂：Sigma公司，产品目录编号为F5881。
[0036] 弗氏不完全佐剂：Sigma公司，产品目录编号为F5506。
[0037] 丹参酮IIA标准品溶液：将丹参酮IIA溶于PBS缓冲液后得到的溶液。
[0038] PBS缓冲液：溶剂为水，溶质为Na2HP04、KH2P0#NaCl，溶质Na2HP04、KH2P0#NaCl 在PBS缓冲液中的浓度分别为0. 02M、0. 0015M和0. 14M;pH值为7. 5。
[0039] 包被缓冲液：溶剂为水，溶质为Na2C0jPNaHCO3;溶质Na20)3和NaHCO3在包被缓冲 液中的浓度分别为0. 01M和0. 04M;pH值为9. 6。
[0040] 洗涤液：溶剂为水，溶质为Na2HP04、KH2P04、NaCl和吐温-2