一种检测木犀草苷的方法及其专用酶联免疫试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种检测木犀草巧的方法及其专用酶联免疫试剂盒，属于生物技术领 域。
【背景技术】
[0002] 木犀草巧（Luteoloside)是常用中药金银花(Xonicerae Japonicae FLO巧的主 要活性成分之一，具有抗氧化、抗炎、抑菌杀菌、抗肿瘤、抗诱变、平喘、治疗糖尿病等药理 作用。2010版《中国药典》规定木犀草巧是金银花、菊花K虹ysanthemumi化0S)、锦灯笼 (化ysalis CALYX SEU FRUCTU巧等中药质量控制的指标性成分之一。
[0003] 目前，木犀草巧检测方法有薄层色谱法、高效液相色谱法、液质联用检测法、毛细 管电泳检测法等，但上述方法均无法同时满足简单快速、高通量、现场检测的需求。酶联免 疫吸附检测法具有操作简便、灵敏度高、通量高、检测快速、成本低廉等特点，在中药材的品 质鉴定方面应用广泛，但木犀草巧的免疫检测方法还未见报道。市场上所售金银花由于种 质、生境、采收加工、储藏条件等诸多差异，导致金银花药材质量参差不齐，严重影响金银花 药用疗效及其他商业产品开发应用，所W建立一种简便、快速、高通量的木犀草巧免疫检测 方法具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一个目的是提供抗木犀草巧的单克隆抗体。 阳0化]本发明提供的抗木犀草巧的单克隆抗体由保藏号为CGMCCNo.10581的杂交瘤细 胞株分泌的。
[0006] 本发明的第二个目的是提供一株分泌抗木犀草巧的单克隆抗体的杂交瘤细胞株 Lg3A4。
[0007] 本发明提供的分泌抗木犀草巧的单克隆抗体的杂交瘤细胞株Lg3A4的保藏号为 CGMCCNo.10581。 阳00引本发明保护保藏号为CGMCC No. 10581的杂交瘤细胞株Lg 3A4,该杂交瘤细胞株 的分类命名为小鼠杂交瘤细胞系，该杂交瘤细胞株已于2015年4月15日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。
[0009] 本发明的第S个目的是提供上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株Lg3A4的新用 途。
[0010] 本发明提供了上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株Lg3A4在检测或辅助检测待 测样品中木犀草巧含量中的应用。 W11] 本发明还提供了上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株Lg3A4在比较或辅助比较 待测样品中木犀草巧含量高低中的应用。
[0012] 本发明还提供了上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株Lg3A4在制备检测或辅助 检测待测样品中木犀草巧含量的试剂或试剂盒中的应用。
[0013] 本发明还提供了上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株Lg3A4在制备检测或辅助 检测待测样品中木犀草巧含量的胶体金试纸条中的应用。
[0014] 本发明的第四个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品中木犀草巧含量的酶 联免疫试剂盒。
[0015] 本发明提供的检测或辅助检测待测样品中木犀草巧含量的酶联免疫试剂盒包括 独立包装的上述单克隆抗体。
[0016] 本发明提供的检测或辅助检测待测样品中木犀草巧含量的酶联免疫试剂盒还可 含有分别为独立包装的木犀草巧标准品和/或用于标记所述单克隆抗体的标记酶；
[0017] 所述木犀草巧标准品可为木犀草巧或由所述木犀草巧配制成的一系列不同浓 度的木犀草巧溶液；所述一系列不同浓度的木犀草巧溶液的浓度具体可为：400ng/mL、 200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12. 5ng/mL和6. 25ng/mL;所述木犀草巧溶液的溶 剂具体可为PBS缓冲液；所述PBS缓冲液的溶剂为水，溶质为胞2册〇4、KH2PO4和化C1，溶质 胞2册〇4、KH2PO4和化C1在所述PBS缓冲液中的浓度分别为0. 02M、0. 0015M和0. 14M，所述 PBS缓冲液的抑值为7. 5 ;
[0018] 所述标记酶具体可为辣根过氧化物酶。
[0019] 本发明提供的检测或辅助检测待测样品中木犀草巧含量的酶联免疫试剂盒还可 含有分别为独立包装的包被缓冲液和/或洗涂液和/或底物缓冲液和/或终止缓冲液和/ 或封闭液；
[0020] 所述包被缓冲液的溶剂为水，溶质为化2〔〇3和Na肥03;溶质化2〔〇3和Na肥03在所 述包被缓冲液中的浓度分别为0. 01M和0. 04M;所述包被缓冲液的抑值为9.6;
[0021] 所述洗涂液的溶剂为水，溶质为化2册〇4、KH2PO4、化C1和吐溫-20;溶质胞2册〇4、 KH2PO4、化C1和吐溫-20在所述洗涂液中的浓度分别为0. 02M、0. 0015M、0. 14M和0. 1% (体 积百分含量）；所述洗涂液的抑值为7. 5 ;
[0022] 所述底物缓冲液的溶剂为水，溶质为巧樣酸S钢和化2册〇4;溶质巧樣酸S钢和 化2册〇4在所述底物缓冲液中的浓度分别为0. 01M和0. 03M;所述底物缓冲液的抑值为 5. 5 ;
[0023] 所述终止缓冲液为2M的硫酸水溶液；
[0024] 所述封闭液的溶剂为水，溶质为化2册〇4、KH2PO4、化C1和脱脂牛奶；溶质化2册〇4、 KH2PO4、化C1和脱脂牛奶在所述封闭液中的浓度分别为0. 02M、0. 0015M、0. 14M和3% (质量 百分含量）；所述封闭液的抑值为7. 5。
[00巧]上述酶联免疫试剂盒中，所述样品为金银花；所述金银花具体为亚特红蕾、亚特立 本、巨花一号和/或久丰一号。
[00%] 上述酶联免疫试剂盒在检测或辅助检测待测样品中木犀草巧含量中的应用也属 于本发明的保护范围。
[0027] 上述应用中，所述样品为金银花；所述金银花具体为亚特红蕾、亚特立本、巨花一 号和/或久丰一号。
[0028] 本发明提供了一种检测木犀草巧的方法及其专用酶联免疫试剂盒。本发明所提 供的酶联免疫试剂盒包括抗木犀草巧的单克隆抗体，该单克隆抗体是通过间接竞争化ISA 方法筛选出的杂交瘤细胞株CGMCCNo. 10581分泌的。通过实验证明：本发明所提供抗木 犀草巧的单克隆抗体特异性强，对芹菜素的交叉反应率为1.27% ;对木犀草素的交叉反应 率为1.02% ;对葛根素、抽皮巧、金丝桃巧、异荘草巧、芦下、搬皮素的交叉反应率都小于 0.001%。利用该单克隆抗体制备得到的间接竞争酶联免疫试剂盒可用于定性或定量检测 待测样品中的木犀草巧，线性检测范围在9. 07~258. 0711邑/111以具有快速、灵敏的优点。
【附图说明】
[0029] 图1为木犀草巧和木犀草素-7-0-P-D-葡萄糖醒酸巧的化学结构式。
[0030] 图2为酶联免疫试剂盒检测木犀草巧浓度的标准曲线。
【具体实施方式】
[0031] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0032] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033] 弗氏完全佐剂：Sigma公司，产品目录编号为巧881。
[0034] 弗氏不完全佐剂：Sigma公司，产品目录编号为巧506。
[0035] 绿原酸标准品溶液：将绿原酸溶于PBS缓冲液后得到的溶液。
[0036]PBS缓冲液：溶剂为水，溶质为胞2册〇4、皿2?〇4和化C1，溶质化2册〇4、皿2?〇4和化C1 在PBS缓冲液中的浓度分别为0. 02M、0. 0015M和0. 14M;抑值为7. 5。
[0037] 包被缓冲液：溶剂为水，溶质为NazCOs和Na肥03;溶质化2〔〇3和Na肥03在包被缓冲 液中的浓度分别为0. 01M和0. 04M;抑值为9.6。 阳03引 洗涂液：溶剂为水，溶质为胞2册〇4、皿2?〇4、化C1和吐溫-20 ;溶质胞2册〇4、KH2PO4、 化C1和吐溫-20在洗涂液中的浓度分别为0. 02M、0. 0015M、0. 14M和0. 1 % (体积百分含 量）；抑值为7. 5。
[0039] 样品稀释液：溶剂为水，溶质为化2册〇4、KH2PO4和化C1、吐溫-20和明胶；溶质 胞2册〇4、皿2口〇4和NaCl在样品稀释液中的浓度分别为0. 02M、0. 0015M和0. 14M;吐溫-20在 样品稀释液中的体积百分含量为0. 1% ;明胶在样品稀释液中的质量百分含量为0. 5%。
[0040] 底物缓冲液：溶剂为水，溶质为巧樣酸S钢和化2册〇4;溶质巧樣酸S钢和化2HPO4 在底物缓冲液中的浓度分别为0. 01M和0. 03M;抑值为5. 5。
[0041] 终止缓冲液：浓度为2M的硫酸水溶液。 阳042] 封闭液：溶剂为水，溶质为Na2HP〇4、KH2P〇4、NaCl和脱脂牛奶；溶质崎册〇4、皿2口〇4、 化(：1和脱脂牛奶在封闭液中的浓度分别为0.021、0.00151、0.141和3%(质量百分含量）； 抑值为7. 5。
[0043] Balb/C小白鼠购自军事医学科学院实验动物中屯、。
[0044] SP2/0骨髓瘤细胞购自中国兽医药品监察所。
[0045] 实施例1、杂交瘤细胞株的获得及抗木犀草巧的单克隆抗体的制备
[0046] -、木犀草巧-BSA免疫原和木犀草巧-OVA包被原的合成
[0047] 1、称取木犀草素-7-0-P-D-葡萄糖醒酸巧标准品（购自中国食品药品检定研 究院，产品目录编号为m968，化学结构式如图l所示）4.40mg，溶解于lmL无水N，N-二 甲基甲酯胺（购自Sigma公司，产品目录编号为D4551)中，常溫下磁力揽拌，得到木犀草 素-7-0-P-D-葡萄糖醒酸巧标准品溶液。 W48] 2、向步骤1中的木犀草素-7-0-P-