riginPro8软件绘制 标准曲线。实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，得到的标准曲线如图2所示。标准 曲线方程为y= 〇? 08551+0. 9124V(l+(x/3. 36852)~1. 0641) (R2 = 0? 99946)。
[0110] 8、根据步骤7所建立的标准曲线，定义B/B。数值为0. 5时对应的丹参酮IIA标准 品浓度为检测灵敏度（即4. 00ng/mL)，定义B/B。数值分别为0. 2和0. 8时所对应的丹参酮IIA标准品浓度范围为该检测方法的线性检测范围（即1. 01~20. 89ng/mL)。
[0111] 实施例4、检测丹参酮IIA的酶联免疫试剂盒
[0112] 一、试剂盒的制备
[0113] 本发明的检测丹参酮IIA的酶联免疫试剂盒由丹参酮IIA-0VA溶液（包被原）、抗 丹参酮IIA的单克隆抗体、羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP、包被缓冲液、洗涤液、标准品溶液、底 物缓冲液和终止缓冲液和封闭液组成。其中，丹参酮IIA-0VA溶液为实施例1中的步骤一 制备得到的；抗丹参酮IIA的单克隆抗体为实施例1的步骤五中的2制备得到的。
[0114] 二、抗丹参酮IIA的单克隆抗体在检测样品中丹参酮IIA含量上的应用
[0115] 使用步骤一的试剂盒对不同产地的丹参样品中的丹参酮IIA含量进行检测，具体 步骤如下：
[0116] 1、将待测样品粉碎，经50%甲醇超声提取，得到提取液，将提取液直接检测或加适 量样品稀释液稀释成样品溶液。
[0117] 2、包被：取96孔酶标板，采用丹参酮IIA-0VA溶液进行包被，100yL/孔；丹参酮 IIA-0VA溶液的浓度为30ng/mL;37°C包被3小时，用洗涤液洗涤4次。
[0118] 3、加标准品洛液和样品洛液：每孔加入50yL丹参酬IIA标准品洛液和待测样品 溶液；丹参酮IIA溶液浓度为：40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2. 5ng/mL、l. 25ng/mL和 0. 625ng/mL;对照孔为50yL的样品稀释液。
[0119] 4、加抗体：每孔加入50iiL单克隆抗体溶液的稀释液（用样品稀释液稀释成 125ng/mL);置湿盒中37°C条件下30min，洗板4次。
[0120] 5、加酶标二抗：将羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP(0.lmg/mL，购自Jackson公司，商品目 录号为79556)稀释1000倍，每孔加100yL，置湿盒中37°C条件下30min，洗板4次。
[0121] 6、显色：取20mg邻苯二胺（0PD)溶于10mL底物稀释液中，加4yL30%H202，将 底物溶液加入酶标板中，每孔100yL。避光显色15min。
[0122] 7、终止：每孔加入50yL终止液，用酶标仪492nm处测定各孔的0D值。
[0123] 8、绘制标准曲线：以不同浓度的丹参酮IIA溶液为横坐标，B/B。?表示含有丹参 酮IIA时的0D值，B。表示对照孔的0D值）为纵坐标，运用OriginPro8软件绘制标准曲 线。实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，得到的标准曲线如图3所示。标准曲线方 程为y= 〇? 08551+0. 9124V(l+(x/3. 36852)~1. 0641) (R2= 0? 99946)。
[0124] 9、将待测样品的B/B。代入标准曲线中，根据标准曲线方程计算得到待测样品中丹 参酮IIA的含量，检测结果见表3。
[0125] 表3、不同产地的丹参样品中丹参酮IIA含量检测结果
[0126]
[0127] 10、以ELISA检测样品中丹参酮IIA的含量结果为横坐标，以HPLC检测样品中丹 参酮IIA的含量结果为纵坐标，建立相关性曲线。
[0128] 上述HPLC法检测样品中丹参酮IIA含量方法如下：
[0129] 1、丹参酮IIA对照品溶液制备：取丹参酮IIA对照品适量，精密称定，置棕色量瓶 中，加甲醇制成每lmL含丹参酮IIA16yg的溶液，即得丹参酮IIA对照品溶液。
[0130] 2、样品提取液制备：取丹参药材，粉碎，过40目筛，精密称取粉末0.5g，置具塞 锥形瓶中，精密加入75 %甲醇溶液50mL，称定重量，超声处理30min(功率：280W;频率： 40kHz)，放置冷却至室温，用75%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，溶液过0. 22ym微孔滤 膜，续滤液作为供试品溶液。
[0131] 3、色谱条件：色谱柱Shim-pack0DS(4.6mmX150mm，5ym);以甲醇-水（75 :25) 为流动相；检测波长为270nm;流速lmL/min;进样量5yL。
[0132] 4、含量测定：分别取丹参酮IIA对照品溶液1、2、4、8、10iiL，注入色谱仪，以峰面 积为纵坐标，进样量（ng)为横坐标，建立标准曲线。取待测样品提取液5yL注入色谱仪， 得峰面积，带入标准曲线计算得样品中丹参酮IIA含量。
[0133] 结果如图4所示：根据ELISA检测样品中丹参酮IIA的含量结果和HPLC检测样品 中丹参酮IIA的含量结果建立的曲线方程为y= 0. 1711X+0. 2743,相关系数R2= 0.9676， 说明ELISA检测丹参酮IIA的含量结果与HPLC法检测丹参酮IIA的含量结果相关性强，可 以用本发明的间接ELISA检测法比较丹参样品中丹参酮IIA的含量高低，也可以实现丹参 样品中丹参酮IIA的含量的检测。
【主权项】
1. 抗丹参酮IIA的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No. 10879的杂交瘤细胞株分泌的。2. -株分泌抗丹参酮IIA的单克隆抗体的杂交瘤细胞株DST 2H4,其保藏号为CGMCC No.10879。3. 权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求2所述的杂交瘤细胞株DST 2H4在检测或 辅助检测待测样品中丹参酮IIA含量中的应用。4. 权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求2所述的杂交瘤细胞株DST 2H4在制备检 测或辅助检测待测样品中丹参酮IIA含量的试剂或试剂盒中的应用。5. 权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求2所述的杂交瘤细胞株DST 2H4在制备检 测或辅助检测待测样品中丹参酮IIA含量的胶体金试纸条中的应用。6. 权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求2所述的杂交瘤细胞株DST 2H4在比较或 辅助比较待测样品中丹参酮IIA含量高低中的应用。7. -种检测或辅助检测待测样品中丹参酮IIA含量的酶联免疫试剂盒，包括独立包装 的权利要求1所述的单克隆抗体。8. 根据权利要求7所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述样品为丹参。9. 权利要求7或8所述的酶联免疫试剂盒在检测或辅助检测待测样品中丹参酮IIA含 量中的应用。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述样品为丹参。
【专利摘要】本发明公开了一种检测丹参酮IIA的方法及其专用酶联免疫试剂盒。本发明的试剂盒所使用的抗丹参酮IIA的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株CGMCC？No.10879分泌产生的。通过实验证明：本发明的抗丹参酮IIA的单克隆抗体特异性强，对隐丹参酮的交叉反应率为28.321％；对丹参酮I的交叉反应率为10.088％；对二氢丹参酮的交叉反应率为3.105％；对丹酚酸B、丹参素和迷迭香酸的交叉反应率均小于0.001％；利用抗丹参酮IIA的单克隆抗体制备得到的间接竞争酶联免疫试剂盒可用于定性或定量检测样品中丹参酮IIA，线性检测范围在1.01～20.89ng/mL，具有快速、灵敏的优点。CGMCC No.1087920150602
【IPC分类】C07K16/44, C12N5/20, G01N30/02, G01N33/577, C12R1/91, G01N30/06
【公开号】CN105131120
【申请号】CN201510437433
【发明人】黄璐琦, 张波, 南铁贵, 袁媛, 詹志来, 康利平
【申请人】中国中医科学院中药研究所
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年7月23日