人源化抗肾小球基底膜抗体的单链抗体scFv3的制备方法
【技术领域】
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[0001]本发明涉及属于医疗生物领域，具体的说涉及单链抗体scFv3的制备方法。
【背景技术】
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[0002]抗肾小球基底膜病是以循环中抗GBM抗体阳性和(或)抗GBM抗体在肺和(或)肾脏中沉积为特征的一组自身免疫性疾病，起病急，发展快，预后差。抗GBM抗体对于抗GBM病具有诊断意义，它的水平与病情的严重程度和预后都有明显相关性，提示该抗体在发病机制中起了重要作用。抗GBM抗体的靶抗原为GBM中IV型胶原α 3链的羧基末端球状非胶原区(NCl区)。
[0003]目前抗GBM病的主要治疗方法是强化血浆置换和免疫抑制剂联合治疗。糖皮质激素和免疫抑制剂只能部分减少抗GBM抗体的产生，对于体内已存在的致病性抗体却无能为力。血浆置换可以清除体内循环的抗GBM抗体，并不能解离已与靶抗原结合的抗体，特异性较差，且价格昂贵。如果我们能获得抗GBM抗体的特异性抗体，分子量较小，不仅能与血液循环中游离的抗体结合，形成小的复合物，滤过基底膜；也可以封闭抗GBM抗体，使其不能与靶抗原结合，从而不再继续损害肾脏，从而缓解患者的症状，缩短病程，改善预后。
【发明内容】
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[0004]本发明主要解决目前在治疗GBM方面存在的技术不足，提供了一种在原核细胞中构建并表达抗肾小球基底膜(GBM)抗体的单链抗体scFv3的方法。
[0005]为解决上述问题，本发明所采用的技术方案是:
[0006]人源化抗肾小球基底膜抗体的单链抗体scFv3的制备方法，其特征在于，其制备方法包括以下步骤:
[0007]A、选材，筛选出抗人GBM抗体的单链抗体scFv3基因、大肠杆菌ToplO和Rosetta2菌、克隆载体pGEM-T Easy Vector、限制性内切酶BamH1、HindII1、Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、表达载体PQE80L、胶回收试剂盒及小量质粒提取试剂盒，含碱性磷酸酶的羊抗人IgG抗体，抗GBM抗体，快速纯化系统仪器；
[0008]B、单链抗体scFv3基因的PCR扩增，以重组噬菌粒pCANTAB_scFv3为模板，XPl和XP2为引物，进行PCR扩增；
[0009]C、克隆载体PGEM-scFv3的构建和鉴定，PCR产物回收后，与pGEM_T Easy载体进行连接，转入感受态细菌ToplO，转化后的菌液接种含氨苄青霉素的LB固体培养基，过夜培养。通过蓝白斑筛选，选出阳性菌落。再接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基，370C 250r/min振荡过夜培养，提取质粒经BamH 1、Hind III双酶切，电泳验证片段大小，将重组质粒进行测序；
[0010]D、表达载体PQE80-1 scFv3的构建和鉴定，将测序验证正确的重组质粒PGEM-scFv3和pQE80L质粒分别用BamHI1、Hind III双酶切，酶切产物经琼脂糖凝电泳后回收；将scFv3与表达载体pQE80L进行连接，转入大肠杆菌Rosetta2菌，挑取阳性克隆进行酶切鉴定，命名为pQE80L-SCFv3 ;
[0011]E、单链抗体scFv3在大肠杆菌中的诱导表达；将含有pQE80L-scFv3重组质粒的单菌落接种于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37°C振荡过夜培养；按1:50将过夜培养物接种与新鲜的LB培养基中，37°C振荡培养至0D600nm为0.6—1.0,加异丙基硫代半乳糖苷IPTG(终浓度为lmmol/L)诱导，30°C振荡培养6小时；
[0012]F、表达产物的纯化，取Iml诱导表达菌液，12000r/min多次离心I分钟收集沉淀，再用Iml菌液定容，用超声破碎仪破碎诱导表达菌；
[0013]G,Western blot检测scFv3的免疫活性，步骤F中纯化的表达产物经SDS-PAGE电泳后，转移到硝酸纤维素(NC)膜，滴加5%脱脂奶粉/PBS封闭37°C I小时；用PBS漂洗NC膜，加入一抗(抗GBM抗体)，于4°C孵育过夜；用PBS洗3次，加入二抗(含碱性磷酸酶的羊抗人IgG抗体)，37°C孵育2小时；用PBS洗15分钟，再加入BCIP/NBT显色后观察结果。
[0014]作为一种改进:
[0015]步骤B中，PCR扩增的引物序列:正义链 5' TGGATCCCTGAGGGCCGGTTGTTTTTACC3'；扩增条件为:94°C预变性5分钟，94°C变性30秒，57°C退火30秒，72°C延伸40秒，循环35次，72°C延伸5分钟至4°C ;预期扩增产物片段scFv3DNA长度为750bp。
[0016]作为进一步的改进:
[0017]步骤F中的破碎条件为:功率200W，超声时间3秒，间隔时间3秒，超声次数3次，循环6—7次。超声破碎后，3000r/min离心30分钟，取上清进行SDS-PAGE分析，发现诱导表达的scFv3存在于破碎上清；利用N-1 NTA亲和层析法，从破碎上清中纯化可溶性scFv3蛋白。
[0018]由于采用了上述技术方案，本发明主要方法为用PCR扩增抗GBM抗体单链抗体scFv3基因，即将scFv3DNA与pGEM_T Easy质粒连接，构建克隆载体pGEM_scFv3 ;用酶切后电泳鉴定构建载体的正确性；测序检测质粒重组后序列有无改变；再将scFv3亚克隆入表达载体PQE-80L,构建pQE80L-scFv3重组质粒，转化大肠杆菌Rosetta2,酶切鉴定。IPTG诱导表达蛋白后，通过SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物的抗体活性。
[0019]其中，scFv3单链抗体有许多优点:
[0020](I)分子小，免疫原性低，用于人体不易产生抗异种蛋白反应；
[0021](2)容易进入血循环，半衰期短，全身清除快，肾脏蓄积很少；
[0022](3) Fe段，不易与具有Fe受体的非靶细胞结合；
[0023](4)由于单链抗体不需要糖基化，可用原核表达系统来表达，易于基因操作和基因工程大量生产。
[0024]结果分析:
[0025]1、scFv3 基因的 PCR 扩增
[0026]以重组噬菌粒PCANTAB-scFv3为模板进行PCR扩增，凝胶电泳显示一条750bp大小的基因片段。
[0027]2、克隆载体pGEM_scFv3的酶切鉴定
[0028]筛选得到的重组pGEM_scFv3用BamH1、Hind III双酶切显示两个片段，分别是3.0kb和750bp,与预计结果相同。
[0029]3、测序及表达载体pQE80-l scFv3的酶切鉴定
[0030]测序结果显示，克隆入pGEM-T Easy载体的基因片段与筛选出的单链抗体scFv3一致。提取质粒，用限制性内切酶BamH1、Hind III双酶切。将scFv3亚克隆入表达载体PQESOLo酶切鉴定显示有两条基因片段，一条是750bp，一条是4.7kb，证明重组质粒正确的克隆入表达载体。
[0031]4、scFv3的诱导表达和纯化
[0032]将重组菌用IPTG低温诱导6小时后，菌液超声破碎，破碎上清用15% SDS-PAGE电泳分析可见一条相对分子量约27kD特异的诱导表达带。利用N-1 NTA亲和层析法从破碎上清中纯化scFv3蛋白。电泳显示目的蛋白得到了较好的纯化。
[0033]5、Western blot 检测 scFv3 的免疫活性
[0034]将抗GBM抗体稀释后，作为一抗进行Western blot鉴定，在纯化后的诱导蛋白相应位置处有一明显的特异性染色条带，说明诱导表达的scFv3能与抗GBM抗体特异性结入口 ο
[0035]结果讨论:
[0036]本发明主要通过对噬菌体展示技术所筛选出的抗GBM抗体的单链抗体scFv3基因进行原核表达，首次制备出了抗GBM抗体的单链抗体scFv3，并对其进行了纯化和免疫活性检测。理论上，scFv3蛋白可抑制抗GBM抗体与革E抗原a 3 ( IV )NC1的结合，从而减轻抗GBM抗体介导的抗GBM病，这为探索抗GBM病的治疗方法提供了一种新的思路。
【具体实施方式】
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[0037]实施例1:人源化抗肾小球基底膜抗体的单链抗体scFv3的制备方法，其制备方法包括以下步骤:
[0038]A、选材，筛选出抗人GBM抗体的单链抗体sc