Fv3基因、大肠杆菌ToplO和Rosetta2菌、克隆载体 pGEM-T Easy Vector、限制性内切酶 BamH1、Hind II1、Taq DNA 聚合酶、T4DNA连接酶(、表达载体PQE80L、胶回收试剂盒及小量质粒提取试剂盒，含碱性磷酸酶的羊抗人IgG抗体，抗GBM抗体，快速纯化系统仪器；
[0039]B、单链抗体scFv3基因的PCR扩增，以重组噬菌粒pCANTAB_scFv3为模板，XPl和XP2为引物，进行PCR扩增；PCR扩增的引物序列:正义链5' TGGATCCCTGAGGGCCGGTTGTTTTTACC3丨;扩增条件为:94°C预变性5分钟，94°C变性30秒，57°C退火30秒，72°C延伸40秒，循环35次，72°C延伸5分钟至4°C ;预期扩增产物片段scFv3DNA长度为750bp ;
[0040]C、克隆载体PGEM-scFv3的构建和鉴定，PCR产物回收后，与pGEM_T Easy载体进行连接，转入感受态细菌ToplO，转化后的菌液接种含氨苄青霉素的LB固体培养基，过夜培养。通过蓝白斑筛选，选出阳性菌落。再接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基，370C 250r/min振荡过夜培养，提取质粒经BamH 1、Hind III双酶切，电泳验证片段大小，将重组质粒进行测序；
[0041 ] D、表达载体pQE80-l scFv3的构建和鉴定，将测序验证正确的重组质粒PGEM-scFv3和pQE80L质粒分别用BamHI1、Hind III双酶切，酶切产物经琼脂糖凝电泳后回收；将scFv3与表达载体pQE80L进行连接，转入大肠杆菌Rosetta2菌，挑取阳性克隆进行酶切鉴定，命名为pQE80L-SCFv3 ;
[0042]E、单链抗体scFv3在大肠杆菌中的诱导表达；将含有pQE80L_scFv3重组质粒的单菌落接种于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37°C振荡过夜培养；按1:50将过夜培养物接种与新鲜的LB培养基中，37°C振荡培养至0D600nm为0.8，加异丙基硫代半乳糖苷IPTG (终浓度为lmmol/L)诱导，30°C振荡培养6小时；
[0043]F、表达产物的纯化，取Iml诱导表达菌液，12000r/min多次离心I分钟收集沉淀，再用Iml菌液定容，用超声破碎仪破碎诱导表达菌；破碎条件为:功率200W，超声时间3秒，间隔时间3秒，超声次数3次，循环6次；超声破碎后，3000r/min离心30分钟，取上清进行SDS-PAGE分析，发现诱导表达的scFv3存在于破碎上清；利用N_i NTA亲和层析法，从破碎上清中纯化可溶性scFv3蛋白
[0044]G,Western blot检测scFv3的免疫活性，步骤F中纯化的表达产物经SDS-PAGE电泳后，转移到硝酸纤维素(NC)膜，滴加5%脱脂奶粉/PBS封闭37°C I小时；用PBS漂洗NC膜，加入一抗(抗GBM抗体)，于4°C孵育过夜；用PBS洗3次，加入二抗(含碱性磷酸酶的羊抗人IgG抗体)，37°C孵育2小时；用PBS洗15分钟，再加入BCIP/NBT显色后观察结果。
[0045]其中，在步骤E中“37°C振荡培养至0D600nm为0.8”，也可以为0.6、0.7、0.9或1.0，当然也可以为0.6-1.0中的其它数值，同样步骤F中，破碎条件中的循环次数也可以为7次。
[0046]文中提到的材料或型号:
[0047]T4DNA 连接酶为美国 Promega ；
[0048]表达载体PQE80L、胶回收试剂盒及小量质粒提取试剂盒均为德国Qiagen ；
[0049]含碱性磷酸酶的羊抗人IgG抗体为美国Genelabs Diagnostics)；
[0050]抗GBM抗体为德国欧蒙医学实验诊断有限公司；
[0051]快速纯化系统仪器为美国GE Healthcare公司生产；
[0052]引物XPl和XP2由上海博尚生物技术有限公司合成；
[0053]重组质粒的测序，是在上海博尚生物技术有限公司进行测序的。
【主权项】
1.人源化抗肾小球基底膜抗体的单链抗体scFv3的制备方法，其特征在于:所述制备方法包括以下步骤: A、选材，筛选出抗人GBM抗体的单链抗体scFv3基因、大肠杆菌ToplO和Rosetta2菌、克隆载体pGEM-T Easy Vector、限制性内切酶BamH1、Hind II1、Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、表达载体PQE80L、胶回收试剂盒及小量质粒提取试剂盒，含碱性磷酸酶的羊抗人IgG抗体，抗GBM抗体，快速纯化系统仪器； B、单链抗体scFv3基因的PCR扩增，以重组噬菌粒pCANTAB-scFv3为模板，XPl和XP2为引物，进行PCR扩增； C、克隆载体pGEM-SCFv3的构建和鉴定，PCR产物回收后，与pGEM_TEasy载体进行连接，转入感受态细菌ToplO，转化后的菌液接种含氨苄青霉素的LB固体培养基，过夜培养。通过蓝白斑筛选，选出阳性菌落。再接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基，370C 250r/min振荡过夜培养，提取质粒经BamH 1、Hind III双酶切，电泳验证片段大小，将重组质粒进行测序； D、表达载体pQE80-lscFv3的构建和鉴定，将测序验证正确的重组质粒pGEM-scFv3和PQE80L质粒分别用BamHI1、Hind III双酶切，酶切产物经琼脂糖凝电泳后回收；将scFv3与表达载体PQE80L进行连接，转入大肠杆菌Rosetta2菌，挑取阳性克隆进行酶切鉴定，命名为 pQE80L-scFv3 ； E、单链抗体scFv3在大肠杆菌中的诱导表达；将含有pQE80L-SCFv3重组质粒的单菌落接种于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37°C振荡过夜培养；按1:50将过夜培养物接种与新鲜的LB培养基中，37°C振荡培养至0D600nm为0.6—1.0,加异丙基硫代半乳糖苷IPTG(终浓度为lmmol/L)诱导，30°C振荡培养6小时； F、表达产物的纯化，取Iml诱导表达菌液，12000r/min多次离心I分钟收集沉淀，再用Iml菌液定容，用超声破碎仪破碎诱导表达菌； G、Westernblot检测scFv3的免疫活性，步骤F中纯化的表达产物经SDS-PAGE电泳后，转移到硝酸纤维素(NC)膜，滴加5%脱脂奶粉/PBS封闭37°C I小时；用PBS漂洗NC膜，加入一抗(抗GBM抗体),于4°C孵育过夜；用PBS洗3次，加入二抗(含碱性磷酸酶的羊抗人IgG抗体)，37°C孵育2小时；用PBS洗15分钟，再加入BCIP/NBT显色后观察结果O2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤B中PCR扩增的引物序列:正义链 5' TGGATCCCTGAGGGCCGGTTGTTTTTACC3';扩增条件为:94°C预变性 5 分钟，94°C变性 30秒，57°C退火30秒，72°C延伸40秒，循环35次，72°C延伸5分钟至4°C ;预期扩增产物片段 scFv3DNA 长度为 750bp。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于: 步骤F中的破碎条件为:功率200W，超声时间3秒，间隔时间3秒，超声次数3次，循环6— 7次。超声破碎后，3000r/min离心30分钟，取上清进行SDS-PAGE分析，发现诱导表达的scFv3存在于破碎上清；利用N-1 NTA亲和层析法，从破碎上清中纯化可溶性scFv3蛋白。
【专利摘要】本发明公开了一种人源化抗肾小球基底膜抗体的单链抗体scFv3的制备方法，包括选材、PCR扩增、隆载体pGEM-scFv3的构建和鉴定、表达载体pQE80-l？scFv3的构建和鉴定、单链抗体scFv3在大肠杆菌中的诱导表达、pQE80L-scFv3重组质粒的单菌的LB培养、纯化和检测scFv3的免疫活性落等步骤，本发明首次制备出了抗GBM抗体的单链抗体scFv3,并对其进行了纯化和免疫活性检测。理论上,scFv3蛋白可抑制抗GBM抗体与靶抗原α3(Ⅳ)NC1的结合,从而减轻抗GBM抗体介导的抗GBM病，这为探索抗GBM病的治疗方法提供了一种新的思路。
【IPC分类】C12N15/70, C12N15/13, C07K16/42
【公开号】CN105131118
【申请号】CN201510669438
【发明人】刘章锁
【申请人】刘章锁
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年10月16日