用于宫颈癌检测和分级的单隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物诊断及医药领域，具体地说，本发明涉及宫颈癌及宫颈病变组织 中HPV16E7蛋白的鉴定和早期风险预警。
【背景技术】
[0002] 宫颈癌是女性生殖系统的常见恶性肿瘤，位居女性恶性肿瘤第二位，晚期癌5年 生存率低，在世界范围内具有较高的发病率和死亡率。1976年zurHansen提出人乳头瘤病 毒（HPV)可能是性传播致癌因素，并开始研究HPV与宫颈癌之间的关系。目前，许多流行病 学已证实HPV是导致宫颈癌的元凶，还可以引起多种其它肿瘤，包括生殖道、乳腺、消化道 及呼吸道癌症。zurHansen也因此于2008年获得诺贝尔生理学或医学奖。HPV近年来在 我国人群中的传播有增无减，故宫颈癌预防、治疗的研究工作非常重要。
[0003] 80%的女性在其一生中都会感染HPV病毒，大多数HPV感染在1-2年内会被自 身免疫系统所清除，而持续存在的HPV感染将会演变为高度宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelialneoplasia，CIN)损伤，如CINII和CINIII，甚至进一步演变为宫颈癌。 据统计，约20%的低度宫颈损伤将转变为高度损伤，如果不及时治疗，其中30 %将会进一 步转为恶性肿瘤。多数中晚期子宫颈癌的病理形态显而易见，诊断并不困难。但是，对于 早期子宫颈癌，及其癌前病变的诊断至今依然是研究的重点。在正常宫颈上皮一CIN-宫 颈癌这一进展过程中，除发生了组织学、细胞学形态的相应改变，某些基因结构、功能等都 会发生变化，这些基因可作为这一进展中的分子标志，以便早期发现、诊断CIN和宫颈癌。 如Ki67、pl6INK4A、，hTERT等随CIN级别增高而表达增加（ValentinaF，RenzoB，Serena B，etal.,DetectionofHPVE7Oncoviralproteinincervicallesionsbyanew antibody.ApplimmunohistochemMolMorphol, 2013, 21 (4) : 341-350)。近年来研究显不， 抑癌基因？16??在大部分宫颈癌和癌前病变中过表达，认为可将pl6 ??蛋白作为一种生 物学标志物进行宫颈癌的早期筛查。
[0004]HPV持续感染是引起宫颈上皮内癌变的主要病毒致病因素，高危型HPV16和18是 宫颈鳞状上皮癌中检出率最高的亚型。新近一些研究显示，pl6INK4A的过表达与HPV持续 感染和宫颈癌密切相关（KalofAN，CooperK.，pl6INK4aimmunoexpression:surrogate markerofhigh-riskHPVandhigh-gradecervicalintraepithelialneoplasia.Adv AnatPathol.2006Jul;13(4):190-4.)D癌症发生过程中病毒DNA整合入人体细胞基因组 内，随着E7蛋白表达控制的缺失将持续表达病毒致癌蛋白E7,使细胞持续分化和发生癌前 病变，导致细胞调控失控，发生永生化。E7蛋白可优先与视网膜母细胞癌蛋白pRAB结合并 使其失活。由于P16 ^4"与pRAB质检存在负反馈调节，HPVE7蛋白是pRAB失活后，使得 pRAB对pl6INK4%负反馈调节作用丧失，从而导致pl6 ??在HPV感染阳性的宫颈鳞癌中有 很高的阳性表达率。2012年7月，美国病理学家协会（CAP)和美国阴道镜和宫颈病理学会 (ASCCP)指南指出，pl6可作为反映HPVE6/E7影响细胞增殖的标志物，有足够证据表明能 够用于低级别肛门-生殖道鳞状上皮病变相关推荐，建议使用特定克隆号（E6H4)的pl6INK4a 抗体作为检测HPV感染是否影响到细胞周期调控的生物标志物。该克隆号是全球唯一获得IVD认证的pl6INK4a抗体。罗氏诊断CINtec组织学pl6 (包含pl6抗体E6H4)已于2014年 5月在中国上市。因此，在HPV感染导致的高度宫颈非典型增生和宫颈癌病人的上皮细胞内 持续表达的E7蛋白，在宫颈癌的发病机制中位于pl6INK4a的上游，其本身也可作为高度宫颈 损伤和宫颈癌检测的一个肿瘤标志物。
[0005]目前宫颈组织常用的诊断方法是苏木精-伊红染色法（H&E)，尽管H&E判读是目 前对CIN进行分级的标准，但易受到病理医师主观因素以及宫颈上皮化生、萎缩、修复的变 化等因素的影响，进而导致H&E判读的重复性差、诊断准确度不够高。临床上迫切需要更 客观、更准确的诊断标准。临床HPVE7检测目前没有合适的抗体主要有两个原因：1、HPV 蛋白在临床组织或细胞样本中表达量较低，需要高亲和力的抗体进行检测；2,HPV病毒在 现有的标准组织培养技术下不能在实验室培养存活；3,E7蛋白本身存在免疫抑制，使得采 用E7蛋白免疫动物不能获得很好的免疫反应。在这种情况下我们提供一种HPV16E7蛋白 的单隆抗体及检测HPVE7过表达的方法。该单克隆抗体能够特异的结合肿瘤细胞内源的 HPV16/18E7蛋白。诊断CINI、CINII和CINIII必须依据H&E的形态判断，借助于本方 法通过检测生物标志物E7蛋白能够准确地了解癌前病变，提高CIN等级判读的准确性，确 保对患者进行准确的分流以采取适当的随访、治疗措施。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种识别HPV16E7蛋白的单隆抗体及在宫颈癌检测和风 险预警中的应用。
[0007] 在本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以 下三个互补决定区⑶R:
[0008]SEQIDN0. :4 所示的CDR1，
[0009]SEQIDN0. :6 所示的CDR2,和
[0010]SEQIDN0. :8 所示的CDR3。
[0011] 在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQIDN0. : 10所示的氨基酸序列。
[0012] 本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本发明第一方面 所述的重链可变区，和
[0013] 重链恒定区。
[0014] 在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源。
[0015] 本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述轻链可变区具有选自下 组的互补决定区⑶R:
[0016]SEQIDN0. : 12 所示的CDR1'，
[0017]SEQIDN0. : 14 所示的CDR2'，和
[0018]SEQIDN0. : 16 所示的CDR3'。
[0019] 在另一优选例中，所述的轻链可变区具有SEQID N0. : 18所示的氨基酸序列。
[0020] 本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本发明第三方面 所述的轻链可变区，和
[0021] 轻链恒定区。
[0022] 在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源、鼠源或兔源。
[0023] 本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：
[0024] (1)如本发明第一方面所述的重链可变区；和/或
[0025] (2)如本发明第三方面所述的轻链可变区。
[0026] 在另一优选例中，所述抗体具有：如本发明第二方面所述的重链；和/或如本发明 第四方面所述的轻链。
[0027] 在另一优选例中，所述的抗体为特异性抗HPV的抗体；优选地，所述抗体为特异性 抗HPV16的抗体；更优选地，所述抗体为特异性抗HPV16E7蛋白的抗体。较佳地，所述抗体 还具有特异性抗HPV18E7蛋白的功能。
[0028] 在另一优选例中，所述的抗体包括：单链抗体、双链抗体、单克隆抗体、嵌合抗体 (如人兔嵌合抗体）、鼠源抗体、兔源抗体或人源化抗体。
[0029] 在另一优选例中，
[0030] 所述"HPV18E7蛋白"可以为野生型HPV18E7蛋白，也可以为野生型HPV18E7蛋 白的衍生蛋白。所述"HPV16E7蛋白"可以为野生型HPV16E7蛋白，也可以为野生型HPV16 E7蛋白的衍生蛋白。
[0031] 在另一优选例中，所述抗体为能够特异性结合HPV18E7蛋白和HPV16E7蛋白的 单克隆抗体。
[0032] 在另一优选例中，所述抗体不与其它HPV亚型结合或者与其它HPV亚型的亲和力 较低。
[0033] 在另一优选例中，所述抗体还具有以下特性：
[0034] (3)能够结合HPV16E7的空间构象的蛋白特异性结合。
[0035] 本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
[0036](i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发 明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述 的抗体；以及
[0037](ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
[0038] 在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。
[0039] 在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性抗HPV;优选地，特异性抗HPV16;更优选 地，特异性抗HPV16E7蛋白。较佳地，所述重组蛋白还特异性抗HPV18E7蛋白。
[0040] 本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸，它编码选自下组的多肽：
[0041] (1)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本 发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所 述的抗体；或
[0042] (2)如本发明第六方面所述的重组蛋白。
[0043] 在另一优选例中，所述的多核苷酸具有SEQIDN0. :3、5、7、9、11、13、15、或17、所 示的序列。
[0044] 本发明的第八方面，提供了一种载体，它含有本发明本发明第七方面所述的多核 苷酸。
[0045] 在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、 哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
[0046] 本发明的第九方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明第八方面 所述的载体或基因组中整合有本发明第七方面所述的多核苷酸。
[0047] 本发明的第十方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：
[0048] (a)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发 明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述 的抗体；和
[0049] (b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或 酶。
[0050] 在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共 振成像）或CT(电子计算机X射线断层扫描技术）造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放 射性核素、生物毒素、细胞因子（如IL-2等）、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗 粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶（例如，DT-心肌黄酶（DTD)或联苯 基水解酶-样蛋白质（BPHL))、化疗剂（例如，顺铂）或任何形式的纳米颗粒等。
[0051] 本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，其特征在于，它含有：
[0052] (i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发 明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述 的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、或如本发明第十方面所述的免疫偶联物；以及
[0053] (ii)药学上可接受的载体。
[0054] 在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。
[0055] 在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤选自 下组：胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠 癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、阴茎癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。
[0056] 本发明的第十二方面，提供了如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第 二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、 或如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、或如本发明第十方 面所述的免疫偶联物的用途，其特征在于，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；
[0057] 所述试剂、检测板或试剂盒用于：
[0058] (1)检测样品中HPV16和/或HPV18E7蛋白；和/或
[0059] (2)检测肿瘤细胞中内源性的HPV16和/或HPV18E7蛋白；和/或
[0060] (3)检测表达HPV16和/或HPV18E7蛋白的肿瘤细胞；和/或