多 核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，"严格条件"是指：（1)在较低离子强度和较高温度 下的杂交和洗脱，如〇. 2XSSC，0. 1%SDS，60°C;或（2)杂交时加有变性剂，如50% (v/v) 甲酰胺，0. 1%小牛血清/〇. 1%Ficoll，42°C等；或（3)仅在两条序列之间的相同性至少在 90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQID NO. : 10和/或SEQIDNO. : 18所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
[0166] 本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工 合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度 较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还 可将重链的编码序列和表达标签（如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
[0167] 一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将 其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序 列。本发明所涉及的生物分子（核酸、蛋白等）包括以分离的形式存在的生物分子。
[0168]目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白（或其片段，或其衍生 物）的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子（或如载 体）和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
[0169] 本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这 些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0170] 宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高 等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细 菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、C0S7、293细胞的动物细胞等。
[0171] 用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原 核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用0&(：12法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的 方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方 法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
[0172] 获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用 的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下 进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法（如温度转换或化学诱导） 诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0173] 在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如 果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这 些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用 蛋白沉淀剂处理（盐析方法）、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析（凝胶过滤）、 吸附层析、离子交换层析、高效液相层析（HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结 合。
[0174] 本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物（为诊断目的）、治疗剂、PK(蛋 白激酶）修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
[0175] 用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：焚光或发光标记物、放射性标记物、 MRI(磁共振成像）或CT(电子计算机X射线断层扫描技术）造影剂、或能够产生可检测产 物的酶。
[0176] 可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素（Koppe等， 2005，癌转移评论（Cancermetastasisreviews) 24, 539) ;2.生物毒（Chaudhary等， 1989,自然（Nature) 339, 394;Epel等，2002,癌症免疫学和免疫治疗（CancerImmunology andImmunotherapy) 51，565) ;3?细胞因子如IL-2 等（Gillies等，1992,美国国家科学 院院刊（PNAS)89,1428;Card等，2004,癌症免疫学和免疫治疗（CancerImmunologyand Immunotherapy)53,345;Halin等，2003,癌症研究（CancerResearch)63,3202) ;4.金纳米 颗粒 / 纳米棒（Lapotko等，2005,癌症通信（Cancerletters) 239, 36;Huang等，2006,美国 化学学会杂志（JournaloftheAmericanChemicalSociety) 128，2115) ;5?病毒颗粒 (Peng等，2004,基因治疗（Genetherapy) 11，1234) ;6.脂质体（Mamot等，2005,癌症研究 (Cancerresearch)65，11631) ;7.纳米磁粒；8.前药激活酶（例如，DT-心肌黄酶（DTD)或 联苯基水解酶-样蛋白质（BPHL)) ;10.化疗剂（例如，顺铂）或任何形式的纳米颗粒等。
[0177] 本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上 述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制 于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8,较佳地pH约为 6-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合 物可以通过常规途径进行给药，其中包括（但并不限于）：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给 药。
[0178] 本发明的药物组合物可直接用于结合HPV16E7蛋白分子，因而可用于预防和治疗 肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。
[0179] 本发明的药物组合物含有安全有效量（如0? 001_99wt%，较佳地0? 01_90wt%， 更佳地0.l-80wt%)的本发明上述的单克隆抗体（或其偶联物）以及药学上可接受的载体 或赋形剂。这类载体包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。 药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐 水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜 在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约 5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
[0180] 使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全 有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重， 较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给 药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0181] 单克隆抗体的制备
[0182] 本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，本发 明抗原，可被施用于动物以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来 制备（见Kohler等人，Nature 256 ;495, 1975 ;Kohler等人，Eur. J. Immunol. 6:511, 1976； Kohler等人，Eur. J. Immunol. 6:292, 1976 ；Hammer 1 ing等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell办131'1(1〇1]1&8，￡186￥161'，11￥.，1981)，卩策菌体展不技术或可用重组0嫩法（美国 专利号4, 816, 567)制备。
[0183] 代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水 平产生、且对培养基（HAT培养基基质）敏感的那些骨髓瘤细胞，包括骨髓瘤细胞株，例如 鼠类的骨髓瘤细胞株，包括衍生自M0PC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞株（可购自 SalkInstituteCellDistributionCenter，圣地亚哥，加利福尼亚，美国）以及SP_2、NZ0 或X63_Ag8_653 细胞（可购自AmericanTypeCultureCollection，洛克维尔，马里兰，美 国）。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞株也已被描述用于产生人单克隆抗体[Kozbor， J.Immunol.，133 :3001 (1984);Brodeur等，单克隆抗体的生产技术和应用（Monoclonal AntibodiesProductionTechniquesandApplications)，51-63 页(MarcelDekker， Inc.，纽约，1987)]。
[0184] 对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆 抗体的产生，如，通过体外结合分析例如，酶联免疫吸附分析（ELISA)或放射免疫分析 (RIA)。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后，可将杂交瘤克隆通过有限稀 释步骤形成亚克隆（subcloned)，并通过标准方法生长（Goding，单克隆抗体（Monoclonal Antibodies):原则和实践（PrinciplesandPractice)，AcademicPress(1986) 59-103 页）。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培养基。此 外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。
[0185] 由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化 工艺适当地得到分离，这些纯化工艺为例如，蛋白A-琼脂糖法（proteinA-Sepharose)、轻 基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
[0186] 噬菌体展示技术是一项筛选技术，将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表 达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的DNA则位于病毒粒子内，从而使大 量多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等） 的多肽配体通过淘选得以快速鉴定。
[0187] 本发明提供了一种针对HPVE7蛋白的单克隆抗体，特别是针对HPV16E7蛋白的 单克隆抗体。在本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用噬菌体展示技术进行筛选， 重组DNA方法组建真核表达系统来表达抗体，再将分泌于培养基中的抗体经亲和层析柱 (ProteinA-Sephrose)进行纯化。
[0188] 多克隆抗体的制备
[0189] 本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，本 发明抗原，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。对于多克隆抗体，可利用亲和纯化 的方法来制备（《抗体制备与使用实验指南》中第四章多克隆抗体的制备，HOOKActived Agarose使用说明书）。
[0190] 方法和样本
[0191] 本发明涉及用于组织的样本检测宫颈癌和风险预警的方法。该方法步骤大致如 下：获得组织样本；将样本进行福尔马林固定，制备成石蜡切片；检测在所述石蜡切片的样 本中HPV16E7癌蛋白水平。
[0192] 本发明可以用于HPV16感染相关癌症中HPV16E7癌蛋白的检测，其中HPV16感染 相关的癌症例如宫颈癌、膀胱癌、子宫内膜癌、阴茎癌等泌尿生殖系统的肿瘤，小细胞肺癌、 黑色素瘤以及头颈肿瘤以及这些癌症的前期阶段。
[0193] 本发明中所采用的样本（样品）为组织样本，且福尔马林固定的石蜡切片。
[0194] 试剂盒
[0195] 本发明还提供了一种指含有本发明的抗体（或其片段）或本发明的检测板的试剂 盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
[0196] 本发明进一步设计用于检测高危型HPVE7癌蛋白的检测试剂盒，该试剂盒包括识 别高危型HPVE7癌蛋白的抗体，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、酶联标记的 二抗、检测标记、检测底物等。所述的抗体优选是抗HPVE7抗体，更优选是抗HPV16E7单 克隆抗体。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
[0197] 本发明进一步设计开发用于对来自宫颈病变组织样本中HPV感染相关情况诊断 评估的试剂盒，该试剂盒可以检测存在于样本中的高危型HPV16E7癌蛋白，其中样本可以 是石蜡切片或者是冰冻切片。将宫颈组织制成切片，并且被用于开发在基于非细胞学形态 分析基础上对样本中的HPV感染情况进行免疫学检测的检测试剂盒和体外诊断装置。
[0198] 本发明的目的之一在于提供一种检测HPV16E7蛋白表达的方法，并且所述的方法 可用于检测HPV感染相关癌症特别是宫颈癌的检测。
[0199]