本发明的发明人等制作了针对人乳头瘤病毒HPV16E7蛋白质的兔源单克隆抗体 RAB-034,并研究其应用。本发明的发明人等使用所制作的抗HPV16E7兔单抗RAB-034对 福尔马林固定的宫颈组织石蜡切片进行免疫组织化学染色。借助于兔单抗RAB-034对目的 蛋白的高亲和力和高特异性，使得RAB-034不但能够特异性识别宫颈病变组织中的HPV16 E7蛋白，还能够识别宫颈早期病变中的HPV16E7蛋白。因此，兔多抗RAB-034既可用于中 晚期子宫颈癌的检测，也可用于检测有恶变可能的早期宫颈病变，为临床诊断和宫颈病变 进展风险评估提供可靠的证据。根据该发现结果，本发明的发明人完成了本发明。
[0200] 也就是说，本发明的方法是检测肿瘤标记物的方法，其特征在于：包括检测样本中 的HPV16E7的步骤。
[0201] 在本发明的方法中，所述检测样本优先是宫颈上皮损伤有可能宫颈病变的患者， 或者是宫颈已经发生病变的患者。
[0202] 所述HPV16E7优选是HPV16E7蛋白质或其片段。在此情况时，检测所述的HPV16 E7的步骤优选是使用HPV16E7的免疫组织化学染色法分析。所使用的抗HPV16E7抗体优 选是抗HPV16E7兔单克隆抗体。
[0203] 所述方法免疫检测所采用的来自HPV16E7癌基因表达的蛋白作为HPV16相关的 恶性或恶变前细胞发生的可靠指标。本发明最有用的方面之一是在对子宫颈癌、鳞状上皮 细胞损伤和腺癌及与致癌HPV16感染相关的任何上皮细胞异常的诊断中的应用；所示的 致癌HPV16感染包括中空细胞病；角化过度症；包括上皮内瘤形成或上皮内病变的癌前期 病症；高度发育不良；和侵染性或恶性癌症。除宫颈癌外，HPV16E7的检测对检测膀胱癌、 子宫内膜癌、阴茎癌等泌尿生殖系统的肿瘤，小细胞肺癌、黑色素瘤以及头颈肿瘤也是有用 的。
[0204] 本发明的另一个目的通过本发明的方法提供一种检测试剂盒。该试剂盒可以是诊 断试剂盒或研究试剂盒。
[0205] 本发明的试剂盒是用以检测肿瘤标记物的试剂盒，其特征在于具有抗HPV16E7单 克隆抗体。本发明的试剂盒优先是还具有用以检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲 液、酶联标记的二抗、检测标记、检测底物等。所述的抗体优选是抗HPV16E7抗体，更优选 是抗HPV16E7单克隆抗体，尤其优选是通过噬菌体展示和重组DNA技术，获得用于真核表 达系统的抗HPV16E7单克隆抗体基因重组表达载体。由真核表达系统产生的抗HPV16E7 兔单克隆抗体或是与该抗HPV16E7兔单克隆抗体具同等的结合活性的单克隆抗体。
[0206] 本发明提供了一种方法通过检测组织内源的HPV16E7蛋白，区分不含HPV致癌蛋 白的组织。并且当组织通过临床广泛的中性福尔马林固定，制成石蜡切片后仍能准确的检 测出致癌病毒蛋白，从而能够提高CIN等级判读的准确性，确保对患者进行准确的分流以 采取适当的随访、治疗措施。
[0207] 进一步，本发明还提供一种采用该检测方法所形成的检测试剂盒。
[0208] 本发明的主要优点在于：
[0209] (1)本发明提供的针对HPV16E7蛋白的抗体，特异性高，亲和力强，并且可以大量 制备、价格低廉。
[0210] (2)本发明提供的针对HPV16E7蛋白的抗体能够特异性的与HPV16E7蛋白结合， 也可与HPV18E7蛋白结合，因此该抗体能够用于同时检测HPV16和HPV18E7蛋白。
[0211] (3)本发明提供的检测HPV16E7蛋白的方法中使用本发明提供的抗体，稳定性 好，检测灵敏度极高。
[0212] (4)本发明提供的单克隆抗体以及检测方法，适用于相关癌症的早期癌变前风险 预警和中晚期癌症的确诊。
[0213] 下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条 件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获 得。
[0214] 实施例1
[0215] 1.人乳头瘤病毒HPV16E7兔单抗制备
[0216] 1. 1单链抗体（scFv)的筛选
[0217] 采用His-HPV16E7重组蛋白免疫兔子，用His-HPV16E7重组蛋白和His不相关 蛋白进行效价检测。分离兔子B淋巴细胞获得免疫球蛋白基因。将B细胞的全套可变区基 因克隆出来，组装成噬菌体抗体库。构建的噬菌体抗体库采用重组蛋白His-HPV16E7进行 淘选。经过三轮淘选的富集作用；测定噬菌体滴度；噬菌斑扩增；DNA测序；ELISA检测筛选 到的靶分子结合肽。其中ELISA检测筛选选用重组蛋白His-HPV16E7,并用His不相关蛋 白设置阴性对照（N)，Anti-6XHis抗体设置包被His抗原阳性对照（P)，同时设置空白对照 (包被抗原直接加入酶标二抗）。His-HPV16E70. 1yg/ml包板，His不相关蛋白5yg/ml包 板，4°C过夜，PBST洗涤拍干后，加入5%脱脂奶粉封闭，室温作用2h或4°C过夜，PBST洗涤 拍干后，加入待测抗体5yg/ml。37°C反应lh，PBST洗涤拍干后再分别加入抗Flag-HRP二抗 (SigmaA8592) (1:10000)，Anti-6XHis(Abeamabll87) (1:10000)，37。(：反应 60min，PBST 洗涤拍干后TMB显色和2MH2S04终止。ELISA筛选结果以待检抗体对重组蛋白His-HPV16 E7反应OD值大于2的为阳性，并进行复检。筛选获得8株单链抗体：scFvOOl，scFv016， scFv017,scFv020,scFv023,scFv034,scFvl33,scFvl39〇
[0218] 初步鉴定该8株scFv的结合的表位氨基酸序列区域。采用ELISA方法进行鉴 定：抗原选用重组蛋白和多肽，其中重组蛋白为His-HPV16E7;多肽分别为HPV16E7-l(氨 基酸序列SEQIDN0. : 19PTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEE)，HPV16E7-27 (氨基酸 序列SEQIDNO. :20LNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAH)，HPV16E7-5(氨基酸序列SEQID NO. :21KCDSTLRLCVQSTHVDIRTLE)，His-Vac(氨基酸序列SEQIDNO. :22DEIDGPAGQAEPDRA HYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIV)，Hisl8E7-l(氨基酸序列SEQIDNO.: 23SDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRH)。并根据scFv与氨基酸序列结合能力的不同对该8株 scFv进行分组。结果见图1 :该8株scFv被分成四组，其中scFvOOl为单独一组，scFv016、 scFv023,scFv034 和scFvl39 为一组，scFv017 和scFv020 为一组，scFcl33 为单独一组。每 组各选取一株scFv进行全长兔单抗表达：分别选取scFvOOl，scFv020,scFv034,scFvl33。
[0219] 1.2兔单克隆抗体的生产
[0220] 生产兔单克隆抗体的真核体外表达技术在本领域是熟知的。首先根据兔抗体基因 库Fc序列，结合上面选取的scFv抗体基因，构建全长兔单克隆抗体基因表达载体，共构建 四个真核表达载体。表达载体通过脂质体瞬转J1EK293F细胞，72小时后收取培养上清，并对 培养上清经亲和层析柱（ProteinA-Sephrose)进行纯化。共获得四株兔单克隆抗体，分别 为：RAB-001，RAB-020,RAB-034 和RAB-133。
[0221] 1. 3阳性兔单克隆抗体的特异性及交叉反应
[0222] 检测时，采用间接ELISA方法：抗原选用His_HPV16E7和His_HPV18E7融合蛋白。 并用His不相关蛋白设置待检抗体阴性对照（N)，Anti-6XHis抗体设置包被His抗原阳性 对照（P)，同时设置空白对照（包被抗原直接加入酶标二抗）。His-HPV16E7和His-HPV18 E7融合蛋白0. 5yg/ml包板，His不相关蛋白5yg/ml包板，4°C过夜，PBST洗涤拍干后，加 入5%脱脂奶粉封闭，37°C作用2小时或4°C过夜，PBST洗涤拍干后，加入待测抗体0. 1yg/ ml，37°C反应1小时，PBST洗涤拍干后再分别加入羊抗兔-HRP二抗（SigmaA0545) (1:20 000)，Anti-6XHis(Abeamabll87) (1:10 000)，37°C反应 1 小时，PBST洗涤拍干后TMB显色 和 2MH2S04终止。结果见图 2 :RAB-001，RAB-020,RAB-034,RAB-133 均能与His-HPV16E7 结合，而不与His不相关蛋白结合；同时RAB-001和RAB-034能与His-HPV18E7,而RAB-020 和RAB-133只能结合His-HPV16E7重组蛋白。
[0223] 2.单克隆抗体的鉴定
[0224] 2. 1ELISA检测兔单克隆抗体效价
[0225] 融合蛋白把8-1^16￡7 0.5 1^/1111包板，4°(：过夜，？831'洗涤拍干后，加入5% 脱脂奶粉封闭，37°C作用2小时或4°C过夜，PBST洗涤拍干后，加入anti-HPV16E7单抗 RAB-001，RAB-020,RAB-034,RAB-133,初始浓度为1yg/ml，倍比稀释，共11个浓度梯度， 37°C反应1小时，PBST洗涤拍干后再加入羊抗兔-HRP二抗（SigmaA0545) (1:20 000)，37°C 反应1小时，PBST洗涤拍干后TMB显色和2MH2S04终止，0D450nm处读数。结果见图3 :当 采用His-HPV16E7为抗原时，4株抗体均有较高的结合力。RAB-001抗体效价略优于其他抗 体，其次是RAB-034和RAB-133,相对较差的是RAB-020。采用本领域常规的方法对RAB-034 单克隆抗体的多肽结构进行了测序。
[0226] 2. 2Anti_HPV16E7兔单克隆抗体的抗原结合表位分析
[0227] 鉴定单克隆抗体在HPV16E7抗原蛋白中的表位氨基酸序列区域。采用ELISA 方法进行鉴定：抗原选用多肽或重组蛋白，其中多肽分别为His-Vac，HPV16E7-1，HPV16 E7-5，HPV16E7-27;重组蛋白为His-HPV16E7蛋白抗原。重组蛋白抗原0. 5yg/ml包板， 多肽抗原2yg/ml包板，4°C过夜，PBST洗涤拍干后，加入5%脱脂奶粉封闭，37°C作用2小 时或 4°C过夜，PBST洗涤拍干后，加入anti-HPV16E7 单抗RAB-001，RAB-020,RAB-034， RAB-133(lyg/ml)，37°C反应1小时，PBST洗涤拍干后再加入羊抗兔-HRP二抗（Sigma A0545) (1:20000)，37°C反应1小时，PBST洗涤拍干后TMB显色和2MH2S04终止，0D450nm处 读数。结果见图4:RAB-001和RAB-034只能够结合重组蛋白His-HPV16E7,因此初步推测 RAB-001和RAB-034是识别重组蛋白HPV16E7的空间构象。RAB-020和RAB-133为特异性 结合HPV16E7的结合表位为5-34位氨基酸。
[0228] 2. 3兔单克隆抗体免疫细胞化学染色法检测表达HPV16E7的宫颈癌细胞系
[0229] 表达HPV16E7蛋白的宫颈癌细胞株CaSki细胞，在此用作高度子宫颈病变状态中 的E7蛋白过表达的肿瘤细胞模型（阳性对照）。不含HPVDNA的宫颈癌细胞株C-33A细 胞，在此作为阴性对照。用兔单克隆抗体RAB-001，RAB-020,RAB-034,RAB-133分别对这两 种细胞进行免疫细胞化学染色试验。具体实验方法如下：
[0230] CaSki，C-33A细胞分别种植于置于24孔细胞培养板中的盖玻片上，37°C，5%C02 培养24小时，弃除培养基后PBS小心润洗两次，甩干；采用4%多聚甲醛固定液室温固定30 分钟；为防止非特异性背景染色，不允许在染色过程中使盖玻片变干。加入0. 3%Triton X-100(inPBS)室温使细胞膜通透15分钟；为了使内源过氧化物酶失活加入3%H202/PBS 室温处理5分钟，甩干；加入PBS洗液洗5分钟，甩干；加入10%FBS/PBST封闭液封闭1小 时，甩干；分别加入兔单克隆抗体RAB-001 (10, 8, 4, 2yg/ml)