5-羟基吲哚乙酸免疫原、抗体和检测试剂及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及5-羟基吲哚乙酸免疫原、抗5-羟基吲哚乙酸特异 性抗体和5-羟基吲哚乙酸检测试剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 5_ 羟基吲噪乙酸（5-Hydroxyindole-3_aceticacid，5-HIAA)，其结构式如式 (II)所示：
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[0004]5-羟基吲哚乙酸（5-HIAA)作为5-羟色胺（5-HT)的代谢产物，是由单胺氧化酶催 化经5-羟基吲哚乙醛转变而来。5-HIAA在肝脏中代谢，并随尿液排泄至体外。5-HT水平 在中午时分最高，午夜最低，故其代谢产物5-HIAA的含量白天较夜晚高，因此测定24h尿液 更能准确的反应5-HIAA的含量水平。临床上5-HIAA含量升高常见于类癌瘤、热带口炎性 腹泻、支气管燕麦细胞癌等疾病；而其含量降低常见于肾病、抑郁症、强迫性神经症。因此， 测定尿液中5-HIAA含量可为多种疾病的诊断、治疗以及发病机制的研究提供重要依据。 [0005]目前用于5-HIAA含量检测的方法主要有：高效液相色谱法、离子色谱法等。但是 这些方法耗时长、成本高、检测规模小，并不适用于临床患者尿液中5-HIAA含量的检测。目 前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的5-HIAA检测试剂，尤其是质量好的自动化 检验试剂。因此，研发一种质量达到临床检验要求、实用性强、性价比高，可应用于全自动生 化分析仪的5-HIAA检测试剂势在必行。
【发明内容】
[0006]本发明为了克服现有技术存在的缺陷，采用独特的5-羟基吲哚乙酸制备免疫原 性强的5-羟基吲哚乙酸免疫原及其抗体，用该抗体制备的5-羟基吲哚乙酸均相酶免疫检 测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对5-羟基吲哚乙酸高通量、快速化的检测。该检测 试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低5-羟基吲哚乙酸 检测成本，有利于临床推广使用。
[0007]本发明的一个目的在于提供一种免疫原性强的5-羟基吲哚乙酸免疫原。
[0008]本发明的另一个目的在于提供一种5-羟基吲哚乙酸免疫原的制备方法。
[0009] 本发明的又一个目的在于提供使用本发明5-羟基吲哚乙酸免疫原制备得到的特 异性强的抗5-羟基吲哚乙酸特异性抗体。
[0010] 本发明的再一个目的在于提供一种5-羟基吲哚乙酸检测试剂及其制备方法。
[0011] 本发明的5-羟基吲哚乙酸免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗5-羟基 吲哚乙酸特异性抗体。该抗体特异性高，与5-羟基吲哚乙酸的结合力强。由该抗体制备得 到的5-羟基吲哚乙酸检测试剂，可以快速、准确地确定样品中的5-羟基吲哚乙酸含量。本 发明是通过以下技术方案实现的：
[0012] 一种5-羟基吲哚乙酸免疫原，其结构式如式（I)所示：
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[0014] 载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，选自血清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白 中的一种。更优选为血清白蛋白，进一步优选为牛血清白蛋白。
[0015] 所述的5-羟基吲哚乙酸免疫原由5-羟基吲哚乙酸与上述载体连接而成，5-羟基 吲哚乙酸的化学结构如式（II)所示：
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[0017] 该5-羟基吲哚乙酸免疫原的制备方法如下：
[0018] (1)将载体蛋白100~300mg溶解于25~75ml0? 2M，pH8. 5的磷酸缓冲液中；
[0019] (2)将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：100~300mg5-羟基吲哚乙酸、 1. 75~5. 25ml二甲基甲酰胺、1. 75~5. 25ml乙醇、3. 5~10. 5ml10mM，pH5. 0的磷酸钾 缓冲液、100~300mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基）碳二亚胺、25~75mgN-羟基硫代琥 珀酰亚胺，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30~60min;
[0020] (3)将溶解好的溶液滴加至载体蛋白溶液中，并在2~8°C下搅拌过夜，得到抗原； 将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到5-羟基吲哚乙酸免疫原。
[0021] -种抗5-羟基吲哚乙酸特异性抗体，是由上述的5-羟基吲哚乙酸免疫原免疫实 验动物后产生的完整抗体分子，或者为保留与5-羟基吲哚乙酸特异性结合能力的抗体片 段或抗体衍生物。
[0022] 所述的完整的抗体分子、抗体片段或抗体衍生物，为采用单一的5-羟基吲哚乙酸 免疫原对动物加强免疫所获得的多克隆抗体，或者为免疫后经体细胞杂交获得的单克隆抗 体。所述的实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马的一种，优选为兔。
[0023] 所述的抗5-羟基吲哚乙酸特异性抗体由上述制得的5-羟基吲哚乙酸免疫原采用 常规方法接种实验动物，加强免疫后取抗血清。
[0024] 抗5-羟基吲哚乙酸特异性抗体的制备方法，具体步骤如下：
[0025] (1)用PBS将上述合成的BSA-5-羟基吲哚乙酸免疫原稀释至0? 1~3.Omg/ml，得 到抗原溶液，然后用〇. 5~5. 0ml抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注 射；
[0026] (2)2~3周后，再用0. 5~5. 0ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂对上述 实验动物注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射3~6次；
[0027] (3)对上述实验动物取血，分离纯化得到效价为1:30000~1:50000的抗5-羟基 吲哚乙酸特异性抗体。
[0028] 本发明提供一种5-羟基吲哚乙酸检测试剂，含有上述的抗5-羟基吲哚乙酸特异 性抗体和指示试剂，所述的指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂或发光试剂 中的一种；所述的酶试剂由5-羟基吲哚乙酸酶标偶联物和酶的底物组成，酶标偶联物为葡 萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物，酶的底物为葡萄糖-6-磷酸。
[0029] 5-羟基吲哚乙酸检测试剂的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
[0030] (1)试剂A:将2. 018~8. 072g、5. 625~22. 50mM氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷 酸和 0? 856 ~3. 422g、5. 625 ~22. 50mM葡萄糖-6-磷酸用 0? 5 ~2L55mM、pH= 8. 0 的 Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将所述的抗5-羟基吲哚乙酸特异性抗体加到上述均相 酶底物中，抗5-羟基吲哚乙酸特异性抗体与均相酶底物的体积比为1:100~1:10000 ;
[0031] (2)试剂B:将5-羟基吲哚乙酸酶标偶联物加到120mM、pH= 8. 2的Tris缓冲液 中，5-羟基吲哚乙酸酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100~1:10000。
[0032] 所述的抗5-羟基吲哚乙酸特异性抗体与均相酶底物的体积比优选为1:800;
[0033] 所述的5-羟基吲哚乙酸酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比优选为1:2000。
[0034] 所述的5-羟基吲哚乙酸酶标偶联物的制备方法包含以下步骤：
[0035] (1)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：称取7. 5~22. 5mg规格为100KU的葡 萄糖_6_磷酸脱氢酶，室温溶解于6~18mL含有72. 6mg0. 05MTris、8mg3. 3mMMgCl# lOOmgNaCl的溶液中，pH= 9. 0 ;在溶液中加入112. 5~337. 5mg还原态的烟酰胺腺嘌呤 二核苷酸、67. 5~202. 5mg葡萄糖-6-磷酸以及0. 375~1. 125mL卡必醇；再逐滴加入1~ 3mL二甲基亚砜；
[0036] (2) 5-羟基吲哚乙酸的激活：在无水状态下称取5~15mg5-羟基吲哚乙酸，溶解 于300~900yL二甲基甲酰胺中；使上述溶液温度降到-2~-8°C;加入1. 5~4. 5yL三 丁胺；加入〇. 75~2. 25yL氯甲酸异丁酯；-2~-8°C搅拌30~60分钟；
[0037] (3)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与5-羟基吲哚乙酸的连接：将步骤（2)激活的5-羟基 吲哚乙酸溶液逐滴加入到步骤（1)溶解的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中；2_8°C搅拌过夜；
[0038] (4)纯化产物：通过G-25凝胶层析柱纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄 糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物，于2-8°C下储存。
[0039] 5-羟基吲哚乙酸均相酶免疫检测试剂在使用之前，为了避免指示试剂中的酶标偶 联物和酶的底物发生反应，酶标偶联物和酶的底物是不混合的且分开放置，所以将酶的底 物与