羟基吲哚硫酸的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种可W简便且高灵敏度地检验出样品中的径基吗I噪硫酸的测定技 术。
【背景技术】
[0002] 径基吗I噪硫酸是来源于食物蛋白質的色氨酸代谢产物，作为尿毒症物质而被广为 人知。尿毒症物质随着肾功能障碍的发展而存积于体内，而成为引起食欲低下、恶屯、、呕吐 等尿毒症症状的原因。现实中，已经报道有：在慢性肾功能不全患者中，血清中的径基吗I噪 硫酸的浓度显著地增至正常人的大约60倍（例如，参见非专利文献1)。因此，测定体液中、 特别是血清中的径基吗I噪硫酸的浓度，对疾病的诊断或检查而言是极其有用的。更进一步 地，该测定方法可W灵活运用于治疗效果的判定、预后的推测、饮食疗法的处方食物的选定 等。
[0003]W往，径基吗I噪硫酸的测定主要使用气相色谱法或高效液相色谱法进行。然而，运 些方法虽然在灵敏度或精度方面优异，但是存在分析要求熟练、在测定装置或设备上需要 高额费用的问题。另一方面，作为不使用运些装置而测定径基吗I噪硫酸的方法，报道有使用 针对径基吗I噪硫酸的特异性抗体的EIA法（酶免疫测定法）（例如，参见专利文献1)。然 而，利用抗原抗体反应的测定方法存在测定时间长、且测定操作烦杂等问题。
[0004] 根据上述背景可知，正在寻求开发可W不使用高价的测定装置而简便地实施、迅 速且准确地测定径基吗I噪硫酸的浓度的方法。 现有技术文献 专利文献 阳0化]专利文献1:日本专利第4183777号公报 非专利文献
[0006] 非专利文献1:日本透析疗法学会志，21 (10)951~956(1988)
【发明内容】
本发明要解决的课题
[0007] 本发明的目的在于提供一种可W迅速且高灵敏度地检验出样品中的径基吗I噪硫 酸的简便的测定方法。进一步地，本发明的目的还在于提供一种利用该测定方法的径基吗I 噪硫酸的测定用试剂盒、W及肾功能检查方法。 解决课题的手段
[0008] 本发明人为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现：通过使硫酸醋酶和四 挫盐作用于样品中的径基吗I噪硫酸而生成甲贈色素，并求取该甲曆色素的生成量，相比于 W主，可W简便、迅速且高灵敏度地测定样品中的径基吗I噪硫酸。此外，本发明人发现，硫酸 醋酶中，尤其是来自假单胞菌属的硫酸醋酶，其水解径基吗I噪硫酸的硫酸部位的活性高，通 过使用该硫酸醋酶可W更迅速且高灵敏度地测定径基吗I噪硫酸。进一步地，还发现了 ：当使 硫酸醋酶和四挫盐作用于样品中的径基吗I噪硫酸时，通过使得白蛋白与之共存，样品的稀 释直线性提高。此外，还发现了 ：当使硫酸醋酶和四挫盐作用于样品中的径基吗I噪硫酸时， 通过使之与阴离子表面活性剂和/或硫醇化合物共存，不仅样品的稀释直线性提高，而且 灵敏度也进一步地提高。本发明是基于上述认识并进一步地反复研究的结果而完成的。
[0009]目P，本发明提供了如下所述的形态的径基吗I噪硫酸的测定方法、径基吗I噪硫酸的 测定用试剂盒、W及肾功能的检验方法。
[项1]. 一种径基吗I噪硫酸的测定方法，是测定样品中包含的径基吗I噪硫酸的方法，其 特征在于，包括W下工序：使硫酸醋酶和四挫盐作用于样品，测定所生成的甲繼色素。
[项2],根据项1所述的测定方法，其特征在于，所述硫酸醋酶是芳基硫酸醋酶。
[项3],根据项1或2所述的测定方法，其特征在于，所述硫酸醋酶是来源于选自于 由假单胞菌属、分枝杆菌属、不动杆菌属、链霉菌属W及曲霉菌属构成的组中至少1种微生 物。
[项4].根据项1~3中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述硫酸醋酶来源于属 于假单胞菌属的细菌。
[项引.根据项1~4中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述硫酸醋酶来源于绿 脈杆菌。
[项6],根据项1~5中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述硫酸醋酶是由下述 (i)~（iv)中的任一项所述的多肤构成的芳基硫酸醋酶： (i) 由序列号1所示的氨基酸序列组成的多肤； (ii) 由在序列号1所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加或插入1个或多个氨基酸残基 的氨基酸序列构成、并且具有与所述（i)的多肤同等W上的催化径基吗I噪硫酸的水解反应 的活性的多肤； (iii) 由与序列号1所示的氨基酸序列有60%W上的序列同一性的氨基酸序列构成、 并且具有与所述（i)的多肤同等W上的催化径基吗I噪硫酸的水解反应的活性的多肤； (iv) 由能与序列号2所示的碱基序列的互补序列在严格的条件下杂交的碱基序列所 编码的氨基酸序列构成、并且具有与所述（i)的多肤同等W上的催化径基吗I噪硫酸的水解 反应的活性的多肤。
[项7].根据项1~6中任一项所述的测定方法，其特征在于，在白蛋白的存在下，使硫 酸醋酶和四挫盐作用于样品。
[项引.根据项1~7中任一项所述的测定方法，其特征在于，在选自于由阴离子性 表面活性剂和硫醇化合物构成的组中的至少1种的存在下，使硫酸醋酶和四挫盐作用于样 品。
[项9], 一种径基吗I噪硫酸测定用试剂盒，其特征在于，含有硫酸醋酶和四挫盐。
[项10].根据项9所述的测定用试剂盒，其特征在于，包含：含有四挫盐的第1试剂W及含有硫酸醋酶的第2试剂。
[项11].根据项9或10所述的测定用试剂盒，其特征在于，进一步地包含白蛋白。
[项12].根据项9~11中任一项所述的测定用试剂盒，其特征在于，进一步地包含选 自于由阴离子性表面活性剂和硫醇化合物构成的组中的至少1种。
[项13].项9~12中任一项所述的测定用试剂盒，用于诊断肾功能。
[项14].项9~13中任一项所述的测定用试剂盒，用于诊断肾功能不全。
[项15].-种肾功能的检查方法，其特征在于，包括W下工序：使硫酸醋酶和四挫盐作 用于从生物体中采集的样品，测定所生成的甲騰色素。
[项16].根据项15所述的检查方法，其特征在于，所述样品是血液、血清、血浆或尿。 [项17].项15或16所述的检查方法的用途，用于检查肾功能不全。 发明的效果
[0010] 根据本发明的测定方法，能够W简便的方法，且迅速且高灵敏度地测定样品中的 径基吗I噪硫酸。因此，通过运用本发明的测定方法，能容易地进行由径基吗I噪硫酸量变得明 晰的肾功能障碍的检验，且能简易地进行肾功能的判定、伴随肾功能障碍的疾病的检查或 诊断等。
【附图说明】 W11][图U是表示本发明的径基吗I噪硫酸的测定方法中反应机制的图。
[图2]是表示实施例1中测定所得的吸光度（纵轴）和样品中的已知径基吗I噪硫酸浓 度（横轴）之间的关系的图。
[图3]是表示实施例9中测定所得的吸光度（纵轴）和添加径基吗I噪硫酸的血清样品 的稀释倍率（横轴）之间的关系的图。
【具体实施方式】 1.辫基呵吸硫酸的测定方法 本发明的测定方法是测定样品中包含的径基吗I噪硫酸的方法，其特征在于，包括W下 工序：使硫酸醋酶和四挫盐作用于样品，测定所生成的甲艦色素。 柳1引测定辫基呵吸硫酸的化制 虽然不希望对本发明做出限制性解释，但认为本发明的测定，可W通过图1所示的机 审IJ，从而测定径基吗I噪硫酸。目P，通过使硫酸醋酶发挥作用，样品中的径基吗I噪硫酸被水解， 生成径基吗I噪。所生成的径基吗I噪容易被氧化而成为說蓝，但是如果此时共存有四挫盐，贝U 四挫盐被还原，生成甲,贈色素。该甲繼色素反映样品中的径基吗I噪硫酸的浓度，所W可W 通过比色定量所生成的甲贈色素来定量样品中的径基吗I噪硫酸。
[0014] 样品 本发明的测定方法中，成为径基吗I噪硫酸的测定对象的样品，只要是需要测定径基吗I噪硫酸的有无或浓度的材料即可，并无特别的限定，例如可W列举出：生物体来源试样、实 验样品等。特别是，由于已知生物体内的径基吗I噪硫酸量与肾功能之间的相关性，因此作为 样品的优选例子，可W列举出用于检查肾功能而采集的生物体来源试样。作为运种生物体 来源试样，具体可W列举出：血液、血清、血浆、尿等。运些当中，从更加正确地反映出肾功能 的状态的观点而言，优选为血液、血清、血浆，进一步优选为血清、血浆。关于该生物体来源 试样的来源，并无特别地限定，例如可W举出哺乳动物，优选为人。
[0015] 此外，在向本发明的测定方法提供样品时，视需要，还可W进行除去夹杂物等的前 处理。 硫酸酷酶 作为本发明中使用的硫酸醋酶，只要是具有催化水解鞋基嘲噪硫酸使硫酸基游离出来 的反应的活性的酶即可，并无特别的限定，例如优选为芳基硫酸醋酶巧C3. 1.6. 1).
[0017] 此外，本发明中使用的硫酸醋酶，就提高鞋基嘲噪硫酸的测定精度的观点而言，优 选Km值小、且兼具作用地值从中性到弱碱性的特征。因为要求生物体来源试样中的鞋基 嘲噪硫酸的浓度是微量、高夷敏度，所W只要Km值越小，越可W提高测定精度。此外，本发 明的测定方法中，因为四蜂盐的反应地是从中性到弱碱性，所W由于硫酸醋酶的作用地与 四口坐盐的反应地几乎相同，可^高效地生成甲潛色素。
[0018] 关于本发明中使用的硫酸醋酶的来源，并无特别地限定，可W列举出：微生物、软 体动物等。
[0019] 作为产生本发明中使用的硫酸醋酶的微生物，例如，可W列举出：属于假单胞 菌属、分枝杆菌属、不动杆菌属、链霉菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属、梓樣酸 杆菌（Citrobacter)、埃希氏菌属、迪茨氏菌属（梦工子7属）、加rash;Lkora(少号シ 号属）、革自氨醇单胞菌属（Sphingomonas)、威克汉姆酵母属（Wickermomyces)、交替 假单胞菌巧3611(1〇3^61'011101133)、革自脂菌属（5口11；!_11容〇13；!_加1)、16化71化；!_加1属等的细菌 类；曲霉菌属、念珠菌属、子囊菌属（Arthroderma)、发癖菌属（Trichophyton)、青霉属 巧enicillium)、Uncinocarpus(夕シ丰y力；1/7°只属）、裂權菌属（Schizophyllum)、 外瓶霉属巧xophiala)、化赤壳属（Nectria)、大角间座壳属（Magnaporthe)、篮状菌属 (Talaromyces)、Scheffersomyces属、壳球抱属（Macrophomina)、镶抱属（Fusarium)、 克鲁维酵母属化luyveromyces)、Lachancea、接合酵母属（Zygosaccharomyces)、木霉属 (Trichoderma)、洛德酵母属（Xodderomyces)、Meyerozyma、葡萄抱盘菌属化otiyotinia)、 节担菌属（Wallemia)、中国炭痘菌属（Colletotrichum)、Spathaspora(只八号只术号属）、 虫草属（Cordyc邱s)、新萨托菌属（Neosartorya)、德己利酵母属Oebaryomyces)、轮枝抱 属（Verticillium)、西萍著霉属（Yarrowia)、黑粉菌属（Ustilago)等真菌类D
[0020]作为属于曲霉菌属的真菌，具体可列举出：米曲霉（Aspergillusoryzae)、黑 曲霉（Aspergillusniger)、构巢曲霉（Aspergillusnidulans)