階色素的种类适当地设定，只要是可W特 异性地吸收甲目寶色素的波长就无特别的限定，通常设定在340~700nm的范围内。更具体 地，使用WST-8作为四挫盐时，测定450皿下的吸光度即可。
[0064] 此外，本发明的测定方法中，在使用例如MTT、NTB等四挫盐时，在水中生成了不溶 性或难溶性的甲贈色素。在生成了运种不溶性或难溶性的甲贈色素的体系中，只要用异丙 醇等有机溶剂将甲，輕色素溶解后进行吸光度的测定即可。 阳〇化]测定甲月寶色素的浓度时，测定培养开始前甲.繼色素的吸光度（吸光度A)与培养 结束时甲體色素的吸光度（吸光度B)，从吸光度B减去吸光度A后的值成为与所生成的甲 月寶色素浓度相对应的吸光度。例如，若是在包含样品的溶液中添加四挫盐之后添加硫酸醋 酶的情况，则在包含样品的溶液中添加四挫盐之后测定甲目營色素的吸光度（吸光度A)，然 后，在添加硫酸醋酶并培养之后，测定甲，贈色素的吸光度（吸光度B)，将从吸光度B减去吸 光度A而算出的值作为与所生成的甲It色素浓度相对应的吸光度。
[0066] 此外，若预先使用已知浓度的径基吗I噪硫酸测定所生成的甲耀色素浓度，制作校 正曲线，则也可W定量地测定出样品中的径基吗I噪硫酸的浓度。
[0067] 2.辫基呵吸硫酸的测定用试剂念 本发明进一步地提供一种含有硫酸醋酶和四挫盐的径基吗I噪硫酸的测定用试剂盒。本 发明的试剂盒用于实施所述径基吗I噪硫酸的测定方法。 阳068] 本发明的试剂盒中，硫酸醋酶和四挫盐可W是1剂构成（Singlecomponent configuration),另外也可[^是 2 剂构成（two-component configuration)。目P，本发明的 试剂盒，可W是包含含有硫酸醋酶和四挫盐的试剂下，有时也记为"1剂构成试剂"。）， 但优选为分别包含含有四挫盐的第1试剂（W下，有时也记为"2剂构成第1试剂"。）与含 有硫酸醋酶的第2试剂（W下，有时也记为"2剂构成第2试剂"。）的形态。 W例所述1剂构成试剂、2剂构成第1试剂、W及2剂构成第2试剂既可W是液状、另外 也可W是冻结干燥状态等固体形状。
[0070] 此外，所述1剂构成试剂、2剂构成第1试剂、W及2剂构成第2试剂中，视需要也可 W含有W下被添加于所述反应液中的添加剂：缓冲剂、电子载体、抗坏血酸氧化酶（AS0D)、 表面活性剂、馨合剂（例如乙二胺四醋酸巧DTA)等）、pH调节剂、稳定剂、防腐剂（例如叠 氮化钢等）等。进一步地，本发明的试剂盒中，除了所述1剂构成试剂、2剂构成第1试剂、 W及2剂构成第2试剂之外，还可W含有用于样品的前处理或反应促进等的各种添加剂的 第3试剂。
[0071] 此外，本发明的试剂盒中还可W包含白蛋白。当本发明的试剂盒具有包含2剂构 成的第1试剂与2剂构成的第2试剂的2剂构成、且含有白蛋白时，白蛋白可W被包含在2 剂构成的第1试剂与2剂构成的第2试剂中的任一种之中，但优选被包含在2剂构成的第 1试剂之中。
[0072] 进一步地，本发明的试剂盒中还可W含有阴离子性表面活性剂和/或硫醇化合 物。当本发明的试剂盒具有包含2剂构成的第1试剂与2剂构成的第2试剂的2剂构成、 并且在含有阴离子性表面活性剂和/或硫醇化合物时，阴离子性表面活性剂和/或硫醇化 合物可W分别被包含在2剂构成的第1试剂与2剂构成的第2试剂中的任一种之中。关于 阴离子性表面活性剂，优选被包含在2剂构成的第1试剂之中。
[0073] 进一步地，本发明的试剂盒中，还可W包含用于制作校正曲线而使用的浓度已知 的径基吗I噪硫酸、用于稀释样品等的稀释液等。此外，本发明的试剂盒中，还可W包含显示 所述径基吗I噪硫酸的测定条件的测定顺序书。
[0074] 此外，如上所述地，众所周知，生物体内的径基吗I噪硫酸浓度与肾功能障碍具有相 关性，因此，本发明的试剂盒可W用作肾功能的诊断用试剂盒，特别适合用作伴随肾功能的 下降的疾病的诊断用试剂盒。作为伴随肾功能的下降的疾病，具体可举例为肾功能不全 (急性肾功能不全、慢性肾功能不全）、尿毒症等。运些当中，肾功能不全、特别是慢性肾功 能不全被认定为患者血中的径基吗I噪硫酸浓度高，并且血中径基吗I噪硫酸浓度与症状的程 度之间具有高度相关性。因此，本发明的试剂盒用于诊断肾功能不全、特别是慢性肾功能不 全，有用性高。 阳0巧]3.腎功能的粉·杳方法 进一步地，本发明还提供了一种利用所述径基吗I噪硫酸的测定方法的肾功能的检查方 法。
[0076] 如上所述，血液、血清、血浆、尿等生物体来源试样中的径基吗I噪硫酸浓度反映肾 功能，在检查伴随肾功能的下降的疾病的指标方面可W作为指标，所W所述径基吗I噪硫酸 的测定方法可W用于肾功能的检查。
[0077] 本发明的肾功能的检查方法，其特征在于，包括W下工序：使硫酸醋酶和四挫盐作 用于从生物体采集的样品，测定所生成的甲.贈色素。
[0078] 本发明的肾功能的检查方法中，所使用的样品只要是从有必要检查肾功能的人中 采集的样品即可，例如可W是血液、血清、血浆、尿等，优选为血液、血清、血浆，进一步优选 为血清、血浆。
[0079] 此外，本发明的肾功能的检查方法，其通过从生成的甲色素求得样品中所包含 的径基吗I噪硫酸浓度，并与从健康人中采集的样品中的径基吗I噪硫酸浓度相比较，从而可 W检查肾功能。具体地，样品中的径基吗I噪硫酸浓度如果是比健康人的情况高，则判定为肾 功能低下；如果是与健康人的情况相同的程度，则判定为肾功能正常。
[0080] 此外，本发明的肾功能的检查方法，特别适用于伴随肾功能的下降的疾病的检查 方法。关于伴随肾功能的下降的疾病的具体例子，如上文所述。
[0081] 由本发明的肾功能的检查方法所得到的结果，在进行伴随肾功能下降的疾病的有 无的判定、该疾病的治疗效果的判定、该疾病的患者的预后的推测、该疾病患者中饮食疗法 的处方食物的选定等方面能够成为指南。 実施例
[0082]W下，列举试验例等进一步地详细说明本发明，但本发明并不限定于此。
[0083] 制推例1 :夹源于绿滕巧荫的硫酸酷酶的调制 (1)硫酸醋酶基因的克隆 通过W来源于绿脈杆菌（Pseudomonasaeruginosa)的基因组DNA(NBRC106052G)为 模板进行聚合酶链式反应（PCR)，扩增硫酸醋酶基因。基于数据库的硫酸醋酶基因序列信息 来设计PCR用引物。引物的序列分别表示为序列表的序列号1 (正向引物，ForwardPrimer) 和序列号2(反向引物，ReversePrimer)。另外，在序列号1的引物中导入了限制性内切酶 EcoRI识别序列，在序列号2的引物中导入了Sail的识别序列。
[0084]PCR反应使用PrimeSTARDNA聚合酶（宝酒造株式会社制），通过i切cler@ioRAD 公司制），将进行30个循环的W下步骤：在98°C下热变性10秒；在53°C下退火15秒；在 72°C下延伸反应50秒。其结果，扩增为目的大小约1620bp的片段（化agment)。关于所扩 增的片段一进行测序（Sequencing)之后，确认了该PCR产物的碱基序列与数据库的绿脈杆 菌硫酸醋酶基因序列相同。
[00化](2)重组载体（Vector)的制作和转化体的调制 制作含有编码硫酸醋酶基因的基因的重组载体。使用限制性内切酶EcoR1(宝酒造 株式会社制）和限制性内切酶Sail(宝酒造株式会社制）切断由所述（1)取得的PCR产物 的DNA片段。另一方面，将质粒载体pTrc99a用相同的限制性内切酶进行切断，通过琼脂 糖凝胶电泳进行分离，并使用Ge址lute凝胶回收试剂盒（Ge址luteGelExtractionKit) (SIGMA-ALDRICH公司制）来回收分子量大的DNA片段。然后，使用Ligationhi曲试剂盒 (东洋纺株式会社制）在16°C下使运些DNA片段反应15分钟W连接，获得包含来源于绿脈 杆菌的硫酸醋酶基因的重组载体。
[0086] 之后，将重组载体导入至EscherichiacoliD册α的感受态细胞（东洋纺株式会 社制）中，并将其涂布于包含100μg/ml的氨节西林（Ampicillin)的LB琼胶培养基之后， 在37°C下培养整夜从而获取转化体。从该转化体中提取质粒，提纯，取得重组载体。
[0087] 所获得的重组载体由于在硫酸醋酶基因的起始密码子之前具有起始密码子，因此 在硫酸醋酶基因的N末端上添加有多余的氨基酸序列。因此，通过W所获得的重组载体为 模板进行反向PCR，由此删除多余的序列。反向PCR中使用的引物的碱基序列如序列表的 序列号3(正向引物）和序列号4(反向引物）所示。PCR反应进行12个循环的W下步骤： 98°C下热变性10秒；53°C下退火15秒；72°C下延伸反应4分钟。通过用化nl对所获得的 PCR产物进行限制性内切酶处理W切断模板DNA，使用T4多核巧酸激酶将所扩增的DNA片 段的5'末端进行憐酸化。然后，使用Ligationhi曲试剂盒（东洋纺株式会社制）使该DNA 片段在16°C下反应15分钟使之连接之后，将其导入至EscherichiacoliD册α的感受态 细胞（东洋纺株式会社制）中，并通过与上述相同的方法获得转化体。从该转化体提取质 粒、提纯，取得重组载体。将所获得的重组载体命名为pTrc-SFT。进一步地，将pTrc-SFT导 入至Escherichiacoli化21的感受态细胞中，获得转化体。 阳〇8引 （3)从转化体制造硫酸醋酶的 将所获得的转化体化21 (P化C-SFT)接种于30ml的LB液体培养基（1. 0%多聚蛋白腺 (Polyp巧tone)、0. 5%酵母抽提物、0. 5%化Cl、100yg/ml氨节西林）中，在37°C下培养16 个小时，变为种子培养液。将该培养液全部接种于1.化的4XYT(化发酵缸；3. 2%多聚蛋 白腺、2. 0%酵母抽提物、0. 5%化C1、1. 0%丙；醇、pH7.W中，在30°C下进行68小时的通气 揽拌培养。培养结束时培养液的硫酸醋酶活性约为6.OU/ml。另外，硫酸醋酶活性的表示， 1U定义为化is-盐酸缓冲液（P册.0)中37°C下在1分钟内水解1微摩尔的对硝基苯基硫 酸的量。
[0089] 通过离屯、分离回收菌体后，将其悬浮于20mM的Tris-盐酸缓冲液（P册.0)中，使 用超声波破碎仪将菌体破碎，从而获得粗酶液。将该粗酶液上样于用20mM的Tris-盐酸缓 冲液（P册.0)进行平衡化的DEAE-Se地arose柱中，通过0~80%的氯化钟浓度梯度对其进 行洗提W回收硫酸醋酶活性成分（活性画分）。在下述试验例1和2中，将通过本法所分 离?提纯的硫酸醋酶用作提纯酶标准品。
[0090] 连施例1 :辫基呵吸硫酸测定用试剂念的调制-1 调制下述组成的第1试剂和第2试剂作为径基吗I噪硫酸测定用试剂盒。
[0091] 第1试剂 Tris-盐酸缓冲液（pH8. 0) :100mM WST-8 ：0.5mM 邸ΤΑ:lmM 叠氮化钢：〇. 1% 第2试剂 Tris-盐酸缓冲液（pH8. 0) :100mM 制造例1中获得的来源于绿脈杆菌的硫酸醋酶：l〇KU/L 邸ΤΑ:lmM 叠氮化钢：〇. 1% 阳側 连施例2 :将含有尸1知浓麼的辫基