抑制酪氨酸酶的酶活性的适体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及脱色素或淡化皮肤化妆品和皮肤学应用领域。
【背景技术】
[0002] 在人类中，在皮肤、毛囊或眼睛中黑色素的合成和分布造成色素沉着。色素沉着是 遗传预先限定的。控制色素沉着的基因直接作用于色素细胞，或间接作用在色素细胞，尤其 是角质细胞的环境中。
[0003] 作用于色素细胞的许多基因已被得到鉴定和表征，其产物是控制黑色素合成的蛋 白、黑素体结构蛋白，或控制黑素体生物合成和运输的蛋白。
[0004] 在刺激黑色素生成的外源性因素中，紫外线排名第一。炎症和氧化胁迫（例如，如 由污染引发的那些）刺激黑色素合成。运些胁迫直接作用于黑素细胞，W及也通过激活角 质细胞使其随后释放因子如细胞因子或激素而间接地作用。运些因子（如白介素、α-MSH、 内皮素1和前列腺素Ε2)启动导致黑色素合成的反应的序列。运些与真皮-表皮交界的疾 病相关的重复刺激引起形成异质性皮肤色素沉着，例如，表现为雀斑，黑斑病或着色斑。
[0005] 由在皮肤中过量黑色素所引起的色素沉着过度，其由内在因素（如内分泌、代谢 或遗传因素）或外在的因素（如光敏、物理、化学或抗炎剂等等）所造成，内在因素和外在 因素有时是紧密联系的并难W确定。黑素细胞活性过度导致过度产生黑色素，造成了大多 数的色素沉着过度。运些色素沉着过度发生在面部或手部，W及显示为更暗或更深色的区 域或斑点，造成皮肤异质性色素沉着。
[0006] 所有黑色素来自共同合成途径，其设及氨基酸、酪氨酸和关键酶酪氨酸酶，酪氨酸 酶可W是游离的或W酪氨酸酶/酪氨酸-相关蛋白-1复合物的形式存在。酪氨酸酶将酪 氨酸转化为D0PA，继而将其转化为多己酿。从多己酿开始可能有两条途径，一条途径形成褐 黑素，另一条途径形成真黑色素。在真黑色素途径中，多己酿导致多己色素的形成。经由形 成二径基吗I噪或二径基吗I噪簇基，多己色素导致形成真黑色素。酪氨酸酶是在该反应顺序 中的关键酶，其通过在此顺序的若干反应中单独催化或者通过与酪氨酸酶-相关蛋白1形 成复合物来催化而导致黑色素的形成。
[0007] 因此，为了防止色素沉着过度和抑制黑色素生成，抑制或消除皮肤中的酪氨酸酶 的活性是非常重要的。
[0008] 黑素细胞表达酪氨酸酶。因此，已构想过开发特异性酪氨酸酶抑制剂。
[0009] 用于调节皮肤色素沉着的天然或合成的化学物质可W通过多种类型的机制起作 用：
[0010] ?通过角质细胞来阻断黑素细胞的刺激，或
[0011] ?通过在指定点阻断黑色素合成途径，或
[0012] ?通过阻断黑素体的转移，或
[0013] ?通过降低黑素细胞的数量。
[0014] 运些作用机制之中，脱色素剂可W是酪氨酸酶的酶活性的抑制剂。
[0015]用于调节皮肤色素沉着W及抑制酪氨酸酶的酶活性的第一活性剂是隶盐、氯化 隶、隶氯化胺。隶与铜竞争抑制酪氨酸酶活性，从而抑制黑色素合成的前两个阶段。然而， 隶是剧毒物质。已推荐氨酿、氨酿酸或衍生物。其通过竞争性抑制酪氨酸酶来起作用。然 而，它诱导线粒体改变W及具有副作用，如刺激或过敏。运些物质的毒理学研究显示出具有 皮肤癌和抑制精子发生的风险。
[0016]局部使用有效、无害的脱色素物质在化妆品和皮肤学领域是备受追捧的。运些物 质特别用于治疗由于黑素细胞机能亢进造成的区域性色素沉着过度（如特发性黑斑病）、 由于黑素细胞机能亢进造成的局部色素沉着过度（如称为晒斑和老年斑的色素沉着斑）、 意外色素沉着过度（如光敏作用或损伤后愈合），同时用于治疗白斑病如白齋风。在后者的 情况下，缺乏使皮肤重新着色的能力，则减弱稱色区周围的色素沉着W赋予皮肤更同质性 的颜色。
[0017] 脱色素物质也用作皮肤漂白剂（尤其是上述那些，其对紫外线高度反应性）W淡 化肤色（特别是脸和手）W便保持可能最浅的皮肤颜色，或减少紫外线的着色作用。
[0018] 本发明的目的是解决现有技术的技术中的上述问题，并提供对抑制酪氨酸酶的酶 活性特别有利的化妆品组合物。
【发明内容】
[0019] 本发明设及用于抑制黑色素生成的新的局部有效的酪氨酸酶抑制剂，其在化妆品 可接受的非刺激、非毒性和/或非过敏介质中是稳定的。
[0020] 本发明还设及作用在黑色素生成过程中的新的脱色素试剂，其一方面在基本上同 质性色素沉着的情况下用于漂白皮肤、头发或体毛，即用于减少其色素沉着，W及在另一方 面当皮肤的色素沉着是异质性时用于防止皮肤色素沉着过度。
[0021] 令人惊讶的是，本发明人观察到耐受核酸酶的DNA(法文ADN)适体，其能够特异性 结合到酪氨酸酶并抑制酪氨酸酶活性而满足所有运些标准。特别是，它可W穿透皮肤细胞。
[0022] 为分离抗-酪氨酸酶的适体，发明人使用憐酸二醋寡核巧酸序列（与天然DNA相 同的组合物）的序列文库。W定向方式进行选择W鉴定、分离和表征可特异性与酪氨酸酶 相互作用的序列。
[0023] 然后，对运些适体测试其抑制酪氨酸酶活性的能力。
[0024] 本发明的第一目的因此设及能够抑制酪氨酸酶的酶活性W及将酪氨酸转化成 L-D0PA和多己酿的DNA适体，优选耐受核酸酶。
[00巧]本发明的第二目的设及根据本发明的适体抑制酪氨酸酶的酶活性的用途。
[0026] 本发明的第Ξ目的设及化妆品或药物组合物，其含有足W抑制酪氨酸酶的量的根 据本发明的适体作为活性剂，W及一种或更多种药学上可接受的赋形剂。
[0027] 本发明的第四目的设及根据本发明的适体的化妆品用途。
[0028] 本发明的第五目的设及根据本发明的适体作为药物。
[0029] 本发明的第六目的设及用于选择根据本发明的适体的方法，包括W下步骤：
[0030]-通过SELEX方法在DNA文库中选择针对酪氨酸酶催化位点的适体，
[0031]-评估在前述步骤中所鉴定的适体抑制酪氨酸酶的酶活性的潜能，
[0032]-克隆和测序由此选择的适体。
【附图说明】
[0033] 图1:适体T10. 1及其截短形式的预测的二级结构。
[0034] 图2泡体T10. 1酪氨酸酶复合物的传感图。
[0035] 图3:来自轮10的各种适体的酪氨酸酶活性调节的测量。
[0036] 图4 :(巧=f(t)曲线，在产物（P)的表观和时间（t)之间的关系。
【具体实施方式】
[0037] 因此，本发明的第一目的设及DNA适体，优选耐受核酸酶，其能够抑制将酪氨酸转 化成L-D0PA的酪氨酸酶蛋白的酶活性。
[0038]"适体"是指对蛋白具有高亲和性的配体特异性DNA或RNA(法文为ARN)分子。因 此，运意味着包括"天然"适体和化学修饰类似物。
[0039] 通过选择/扩增的交替来选择适体，运能够W达尔文式的方式指导群体的进化： 在群体中，选择出最"适（apt)"的分子，因此运也是对源自选择的具有所需特征的寡核巧酸 命名为"适体"的原因。标准的基因工程技术（克隆、测序、表达）可W很容易地鉴定出运 些适体个体，然后将其表征W大量生产。
[0040] 可W通过优化的体外选择操作规程，称为指数富集（SELE讶的配体系统进化，来 选择适体（W0 91/19813)。
[0041]SELEX方法使得能够产生极高亲和性和特异性的大量配体。此方法依赖于将祀分 子暴露在潜在配体的文库中。解吸/选择循环的系统使得能够富集到与祀分子最特异地相 互作用的配体群体。然后分离和表征所得到的最终群体，W允许其大规模重新合成。
[0042] 虽然SELEX方法已被建立为用于选择适体的通用技术，对任何祀标而言它既不是 预测性的也不是标准化的。与此相反，SELEX方法必须进行优化来适于每个特定的祀标。对 于每个祀标而言，SELEX方法是没有保证的。
[0043] 选择适体时有几个重要因素。例如，祀标分子在每个SELEX循环中必须是稳定的 并容易再现，因为SELEX方法中设及结合、选择和扩增的若干次循环。此外，显示出特异性 结合祀标的核酸必须呈现在初始文库中。因此，有必要产生高度多样化的初始核酸文库。
[0044] 通过SELEX方法的方式选择适体是不可预知的。即使所有的因素对选择适体而言 是最佳的，SELEX方法并不总是对于每个祀标都能获得可行的适体。
[0045] 初始候选物文库是由化学合成的DNA序列所组成，所述每个DNA序列都包括η个 核巧酸的长可变区，在其3'和5'末端两侧为对文库的所有候选物都相同的恒定区。运些 恒定区允许中央部分在SELEX过程中特别是通过PC