具有抑制酪氨酸酶活性和清除自由基活性的拟青霉提取物及其用途
【专利摘要】本发明涉及具有抑制酪氨酸酶活性和清除自由基活性的拟青霉提取物及其用途。所述拟青霉提取物中含有30.0-99.0%拟青霉酮，拟青霉酮包括拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C。拟青霉提取物对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为13.5～37.7μg/mL；对DPPH自由基的半数清除浓度（DC50）为105.5～196.1μg/mL。拟青霉提取物纯化品抑制酪氨酸酶的活性和清除自由基的活性都远强于目前广泛用于化妆品的熊果苷，拟青霉提取物纯化品作为日用化学品的添加剂，具有增白、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎作用。
【专利说明】具有抑制酪氨酸酶活性和清除自由基活性的拟青霉提取物及其用途
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制品的提取制备【技术领域】，涉及具有酪氨酸酶抑制活性和自由基清除活性的拟青霉酮(包括拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C)提取、纯化和应用。
【背景技术】
[0002]拟青霉酮是从一种拟青霉(Paecilomyces sp.)培养物中分离制备得到的具有抑制酪氨酸酶活性和清除自由基活性的生物活性物质。
[0003]拟青霉(Paecilomycessp.)为麦角菌科(Clavicipitaceae)虫草属(Cordyceps)的真菌；在我国常见的有蝶拟青霉(Paecilomyces cicadae)、细脚拟青霉(Paecilomycestenuip)、古尼拟青霉(Paecilomyces gunnii)和虫甬拟青霉(Paecilomyces militari)等。其中蛹拟青霉感染昆虫后形成的虫菌复合体为蛹虫草(Cordyceps militari)被称作北虫草，并作为冬虫夏草的代用品，具有重要经济价值。上述菌种都可从被拟青霉感染的昆虫上分离得到或从土壤中分离得到。抑制酪氨酸酶活性:酪氨酸酶兼有加氧酶和氧化酶的双重功能，在黑色素合成过程中起关键作用。它能够把单酚催化成二酚，并把二酚氧化成醌；醌在非酶促条件下形成最终的反应产物黑色素。具有抑制酪氨酸酶活性的生物活性物质可通过抑制酪氨酸酶活性而抑制黑色素生成，因而可用来预防和治疗色素沉着和黑色素瘤等，在医药和日用化学品等领域有着广阔的应用前景。
[0004]清除自由基活性:自由基(free radical),从化学结构上看是指含未配对电子的基团、原子或分子。自由基具有高度化学活性。对于生命体来说，自由基是生命活动中多种生化反应的中间产物。在正常情况下，人体内的自由基是处于产生与清除的动态平衡之中。自由基是机体有效的防御系统，如不能维持一定水平的自由基则会对机体生命活动带来不利影响。但自由基产生过多或清除过慢，它通过攻击生命大分子物质及各种细胞器，会造成机体分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病。最新的研究表明，人类的衰老及许多疾病都与自由基损伤有关。具有清除自由基活性的物质能与自由基反应并使之还原成非自由基化合物，可清除机体代谢过程中产生的过多的自由基，是一种可增进人体健康的重要活性物质。自由基清除剂在非生命体系中有抗氧化作用，能够有效地阻止物质的氧化败坏，对于延长物品的保质期有着重要作用，被广泛用于食品、药品、日用化学品等中。
【发明内容】
[0005]为寻找新型天然高效的具有酪氨酸酶抑制活性和清除自由基活性的物质，发明人通过对中国的100余株昆虫病原真菌代谢物进行活性研究，发现了从拟青霉中提取的拟青霉提取物具有很强的抑制酪氨酸酶活性和清除自由基活性的作用。
[0006]本发明所述拟青霉提取物中含有30.0-99.0%拟青霉酮，所述拟青霉酮包括拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青 霉酮C，三者的结构式见下式:[0007]
【权利要求】
1.一种拟青霉提取物，其特征在于:所述拟青霉提取物中含有30.0-99.0%拟青霉酮，所述拟青霉酮包括拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C，三者的结构式见下式:
2.具有抑制酪氨酸酶活性和清除自由基活性的拟青霉提取物的用途，其特征在于:根据权利要求1所述的拟青霉提取物在制备具有抑制酪氨酸酶活性和清除自由基活性的日用化学品中的应用；所述拟青霉提取物具有以下特性:(1)对酪氨酸酶的半数抑制浓度(IC50)为:13.5~37.7 yg/mL J^DPPH自由基的半数清除浓度(DC5tl)为:105.5~196.1 u g/mL ；(2)权利要求1所述的拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C对酪氨酸酶的半数抑制浓度(IC5tl)分别为:13.3 ~ 29.1 u g/mL、16.8 ~40.6 y g/mL 和 10.3 ~20.2 y g/mL ;拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C对DPPH自由基的半数清除浓度(DC5tl)分别为:93.5 ~165.3 u g/mL、161.4 ~265.5 u g/mL 和 61.5 ~113.6 u g/mL。
3.制备权利要求1或2所述的拟青霉提取物方法，其特征在于:具体操作步骤如下: .1)拟青霉(Paecilomycessp.)菌种选择 所用的拟青霉(Paecilomyces sp.)为蝶拟青霉(Paecilomyces cicadae)或古尼拟青霉(Paecilomyces gunnii)或虫甬拟青霉(Paecilomyces militari)； .2)菌株培养 培养方法为液固混合培养，具体工序如下: .2.1)斜面种子培养 将保藏的拟青霉菌株接种于萨氏(SDAY)斜面培养基，于20~30°C恒温、培养4~7d,得到一级菌种； . 2.2) 二级液体种子培养 将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养； 液体摇瓶培养基:葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉10g/L，蒸馏水定容； 在大于等于100ml三角瓶中加入30~50%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种I~3支斜面菌种，接种后置于全温振荡培养箱，温度20~30°C、转速100~200rpm，培养3~7d，即得到二级菌种； .2.3)三级液体种子培养 将二级菌种接种到大于等于IOL的发酵罐，所装液量为罐体积的50~80%，接种量5~10%，通气量按体积比1:1 (v/v)，压力0.1MPa, 20~30°C恒温通气培养2~5天，得到三级菌种；发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基； .2.4)固体培养 将三级液体菌种拌入固体培养基中，接种量为固体料量的5~10%，20~30°C恒温通气培养10~20天，得到发酵物；所述固体培养基为蒸煮过的大米或小麦，蒸煮后的大米或小麦含水率为40~80% ； . 3)培养物中有效成分的提取和精制 . 3.1)培养物的预处理 将固体培养物在30~150°C干燥到含水率小于等于20%，然后粉碎到20~120目，用乙醇提取；料液比为1:1~5、提取时间为I~48小时；提取结束后在转速大于等于1000转/分钟条件下离心，或真空抽滤；滤液在温度小于等于100°c浓缩到原体积的1/2~1/10，得到浓缩脱醇液，同时回收乙醇，浓缩液用于进一步的色谱法精制； .3.2)提取物的制备和精制 .3.2.1)拟青霉提取物的制备 将前述乙醇提取物经过逆流色谱法初步纯化，得到权利要求1所述拟青霉提取物；逆流色谱法的溶剂系统按体积比为正己烷:乙酸乙酯:甲醇:乙酸:水=3~5:4~6:2~4:.0~1:4~6 ;每5分钟收集一管；合并含有拟青霉酮A、拟青霉酮B和拟青霉酮C的收集管；在小于等于100°C温度下将收集物浓缩到到原体积的1/2~1/10，并将浓缩物在不高于170°C条件下干燥得到权利要求1所述拟青霉提取物； 不同批次拟青霉提取物外观为浅黄绿色到棕黄色；经高效液相分析发现各批次拟青霉提取物中含拟青霉酮30.0~99.0% ;总拟青霉酮中，拟青霉酮A占10.0~20.0%，拟青霉酮B占10.0~30.0%，拟青霉酮C占50.0~80.0% ;各成分的结构式如下:
【文档编号】A61K8/35GK103655215SQ201310582413
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月19日 优先权日:2013年11月19日
【发明者】胡丰林, 鲍官虎, 陆瑞利, 刘肖肖 申请人:安徽农业大学