一种固定化生物复合酶催化合成熊果苷的方法
【专利摘要】本发明公开了一种固定化生物复合酶催化合成熊果苷的方法，属于生物催化领域。本发明以白玉蜗牛为原料，提取酶液与纳米凹凸棒土复配制得固定化生物复合酶，用其催化对苯二酚和葡萄糖的合成反应，最终得到熊果苷。该方法工艺简便，不仅利用白玉蜗牛为原料，节约了生产成本，而且操作过程中未使用任何有毒试剂，利用固定化生物复合酶合成熊果酸，反应条件温和，缩短了生产周期，提高了熊果苷的产率，使得大规模生产熊果苷成为了可能。
【专利说明】
一种固定化生物复合酶催化合成熊果苷的方法
技术领域
[0001]本发明公开了一种固定化生物复合酶催化合成熊果苷的方法，属于生物催化领域。
【背景技术】
[0002]熊果苷具有显著的抑制酪氨酸酶活性，减少酪氨酸酶在皮肤中的沉积，对皮肤有漂白、防色变和祛斑的功效;是国际公认的正在极力推广的高效、安全的美白剂，是美白、祛斑、防晒化妆品理想的添加成份。
[0003]酶固定化技术是20世纪60年代发展起来的一门新兴生物技术，在化工、发酵生产、能源、医药等行业，实际应用效果显著。它是利用物理或化学的手段将游离酶定位于限定的空间区域，并使其保持活性反复利用的方法。酶固定化技术与传统的悬浮生物处理法相比，酶固定化有提高单位体积的酶密度，酶易回收，对环境的耐受力增强(如PH值、温度、有机溶剂、有毒物质等)等优点。
[0004]目前，熊果苷主要通过化学合成方法制备，该方法主要以葡萄糖和对苯二酚为原料，经乙酰化、溴代、缩合、脱乙酰基等一系列复杂反应制得。化学合成熊果苷存在工艺步骤复杂、反应条件苛刻、使用大量有毒溶剂，给环境造成严重污染。为了克服这些问题，许多研究开始转向采用酶法催化合成熊果苷，但目前普遍采用的糖苷酶存在成本高、酶活低的缺点，不利于工业化推广。
【发明内容】
[0005]本发明主要解决的技术问题:针对目前常用化学合成法制备熊果苷，不仅工艺步骤复杂，反应条件可靠，而且使用大量的有毒溶剂，对于环境污染严重，另外酶法催化合成熊果苷，存在成本高、酶活性低的现状，提供了一种以白玉蜗牛为原料，提取酶液与纳米凹凸棒土复配制得固定化生物复合酶，用其催化对苯二酚和葡萄糖的合成反应，最终得到熊果苷。该方法工艺简便，不仅利用白玉蜗牛为原料，节约了生产成本，而且操作过程中未使用任何有毒试剂，利用固定化生物复合酶合成熊果酸，反应条件温和，缩短了生产周期，提高了熊果苷的产率，使得大规模生产熊果苷成为了可能。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
(1)选取20?30只白玉蜗牛放入烧杯中，向烧杯中加水直至水深达到I?2cm，再向水中滴加5?1mL菜籽油，搅拌均匀后静置饥饿处理5?7天，再将处理后的蜗牛取出，去壳解剖取出消化腺；
(2)将上述得到的蜗牛消化腺和去离子水按固液比为1:8进行混合后放入超声振荡仪，以200?300W功率超声振荡20?40min，过滤分离去除滤渣，得到滤液，再将滤渣按前述步骤重新操作，分离得到滤液，合并两次滤液；
(3)将合并得到的滤液放入高速离心机，以10000?12000r/min转速离心处理10?15min，分离得到上清液，将上清液转入真空浓缩罐，减压至900?100Pa，浓缩至上清液原体积的1/3，得到粘稠浓缩液；
(4)称取40?50g凹凸棒土放入研钵研磨成粉，分别用浓度为0.2mol/L盐酸溶液和0.5mol/L氢氧化钠溶液冲洗I?2h，放入马弗炉于700?800 °C下煅烧2?4h，得到表面改性得纳米凹凸棒土；
(5)将上述得到的纳米凹凸棒土浸入上述粘稠浓缩液中，放置在摇床上振荡浸渍过夜，再用喷雾干燥机喷雾干燥，得到固定化生物复合酶；
(6)按摩尔比为1:3将对苯二酚和葡萄糖混合均匀后装入陶瓷酶解罐中，加入两者总体积I?2倍的正丁醇和两者总质量2?5%上述制得的固定化生物复合酶，放置在摇床上在40?60°C下以200?300r/min转速振荡反应40?50h;
(7)将上述得到的反应液通过极性大孔树脂柱进行分离纯化得到流出液，把流出液放入真空干燥箱，在60?70°C和0.05?0.0SMPa的条件下干燥结晶，即得白色粉末状熊果苷。
[0007]所述的极性大孔树脂柱为大孔树脂柱S-8柱。
[0008]本发明的应用方法是:取3?5g本发明制得的熊果苷倒入100?120mL化妆乳液中，充分混合均匀，在每天早晚洁面后取3?5mL混合液涂抹在脸部，轻轻拍打直至完全吸收为止，长期使用，不仅可以减少酪氨酸酶在皮肤中的沉积，对皮肤有漂白、防色变功效，而且可以防晒，显著祛斑。
[0009]本发明的有益效果是:
(1)本发明操作简单易行，原料简单易得，利用白玉蜗牛为原料，节约了生产成本，且在制备的过程中对于环境无任何污染，完全属于绿色环保工艺；
(2)本发明工艺简便，制得的固定化生物复合酶活性高，后续用其合成熊果酸，反应条件温和，不仅缩短了生产周期，使得熊果苷产率提高了 50?60%，而且使得大规模生产熊果苷成为了可能。
【具体实施方式】
[0010]首先选取20?30只白玉蜗牛放入烧杯中，向烧杯中加水直至水深达到I?2cm，再向水中滴加5?1mL菜籽油，搅拌均匀后静置饥饿处理5?7天，再将处理后的蜗牛取出，去壳解剖取出消化腺;然后将上述得到的蜗牛消化腺和去离子水按固液比为1:8进行混合后放入超声振荡仪，以200?300W功率超声振荡20?40min，过滤分离去除滤渣，得到滤液，再将滤渣按前述步骤重新操作，分离得到滤液，合并两次滤液;随后将合并得到的滤液放入高速离心机，以10000?12000r/min转速离心处理10?15min，分离得到上清液，将上清液转入真空浓缩罐，减压至900?lOOOPa，浓缩至上清液原体积的1/3，得到粘稠浓缩液;接下来称取40?50g凹凸棒土放入研钵研磨成粉，分别用浓度为0.2mol/L盐酸溶液和0.5mol/L氢氧化钠溶液冲洗I?2h，放入马弗炉于700?800°C下煅烧2?4h，得到表面改性得纳米凹凸棒土;之后将上述得到的纳米凹凸棒土浸入上述粘稠浓缩液中，放置在摇床上振荡浸渍过夜，再用喷雾干燥机喷雾干燥，得到固定化生物复合酶;再按摩尔比为1:3将对苯二酚和葡萄糖混合均匀后装入陶瓷酶解罐中，加入两者总体积I?2倍的正丁醇和两者总质量2?5%上述制得的固定化生物复合酶，放置在摇床上在40?60 °C下以200?300r/min转速振荡反应40?50h;最后将上述得到的反应液通过极性大孔树脂柱进行分离纯化得到流出液，把流出液放入真空干燥箱，在60?70°C和0.05?0.08MPa的条件下干燥结晶，即得白色粉末状熊果苷。其中所述的极性大孔树脂柱为大孔树脂柱S-8柱。
[0011]实例I
首先选取20只白玉蜗牛放入烧杯中，向烧杯中加水直至水深达到I Cm，再向水中滴加5mL菜籽油，搅拌均匀后静置饥饿处理5天，再将处理后的蜗牛取出，去壳解剖取出消化腺；然后将上述得到的蜗牛消化腺和去离子水按固液比为1:8进行混合后放入超声振荡仪，以200W功率超声振荡20min，过滤分离去除滤渣，得到滤液，再将滤渣按前述步骤重新操作，分离得到滤液，合并两次滤液;随后将合并得到的滤液放入高速离心机，以lOOOOr/min转速离心处理1min，分离得到上清液，将上清液转入真空浓缩罐，减压至900Pa，浓缩至上清液原体积的1/3，得到粘稠浓缩液;接下来称取40g凹凸棒土放入研钵研磨成粉，分别用浓度为0.2mol/L盐酸溶液和0.5mol/L氢氧化钠溶液冲洗lh，放入马弗炉于700°C下煅烧2h，得到表面改性得纳米凹凸棒土;之后将上述得到的纳米凹凸棒土浸入上述粘稠浓缩液中，放置在摇床上振荡浸渍过夜，再用喷雾干燥机喷雾干燥，得到固定化生物复合酶;再按摩尔比为1:3将对苯二酚和葡萄糖混合均匀后装入陶瓷酶解罐中，加入两者总体积I倍的正丁醇和两者总质量2%上述制得的固定化生物复合酶，放置在摇床上在40 °C下以200r/min转速振荡反应40h;最后将上述得到的反应液通过极性大孔树脂柱进行分离纯化得到流出液，把流出液放入真空干燥箱，在60°C和0.05MPa的条件下干燥结晶，即得白色粉末状熊果苷。其中所述的极性大孔树脂柱为大孔树脂柱S-8柱。
[0012]本实例操作简便，使用时，取3g本发明制得的熊果苷倒入10mL化妆乳液中，充分混合均匀，在每天早晚洁面后取3mL混合液涂抹在脸部，轻轻拍打直至完全吸收为止，长期使用，不仅可以减少酪氨酸酶在皮肤中的沉积，对皮肤有漂白、防色变功效，而且可以防晒，显著祛斑。
[0013]实例2
首先选取25只白玉蜗牛放入烧杯中，向烧杯中加水直至水深达到1.5cm，再向水中滴加SmL菜籽油，搅拌均匀后静置饥饿处理6天，再将处理后的蜗牛取出，去壳解剖取出消化腺；然后将上述得到的蜗牛消化腺和去离子水按固液比为1:8进行混合后放入超声振荡仪，以250W功率超声振荡30min，过滤分离去除滤渣，得到滤液，再将滤渣按前述步骤重新操作，分离得到滤液，合并两次滤液;随后将合并得到的滤液放入高速离心机，以I lOOOr/min转速离心处理13min，分离得到上清液，将上清液转入真空浓缩罐，减压至950Pa，浓缩至上清液原体积的1/3，得到粘稠浓缩液;接下来称取45g凹凸棒土放入研钵研磨成粉，分别用浓度为
0.2mol/L盐酸溶液和0.5mol/L氢氧化钠溶液冲洗1.5h，放入马弗炉于750°C下煅烧3h，得到表面改性得纳米凹凸棒土;之后将上述得到的纳米凹凸棒土浸入上述粘稠浓缩液中，放置在摇床上振荡浸渍过夜，再用喷雾干燥机喷雾干燥，得到固定化生物复合酶;再按摩尔比为1:3将对苯二酚和葡萄糖混合均匀后装入陶瓷酶解罐中，加入两者总体积1.5倍的正丁醇和两者总质量4%上述制得的固定化生物复合酶，放置在摇床上在50°C下以250r/min转速振荡反应45h;最后将上述得到的反应液通过极性大孔树脂柱进行分离纯化得到流出液，把流出液放入真空干燥箱，在65°C和0.07MPa的条件下干燥结晶，即得白色粉末状熊果苷。其中所述的极性大孔树脂柱为大孔树脂柱S-8柱。
[0014]本实例操作简便，使用时，取4g本发明制得的熊果苷倒入IlOmL化妆乳液中，充分混合均匀，在每天早晚洁面后取4mL混合液涂抹在脸部，轻轻拍打直至完全吸收为止，长期使用，不仅可以减少酪氨酸酶在皮肤中的沉积，对皮肤有漂白、防色变功效，而且可以防晒，显著祛斑。
[0015]实例3
首先选取30只白玉蜗牛放入烧杯中，向烧杯中加水直至水深达到2cm，再向水中滴加1mL菜籽油，搅拌均匀后静置饥饿处理7天，再将处理后的蜗牛取出，去壳解剖取出消化腺；然后将上述得到的蜗牛消化腺和去离子水按固液比为1:8进行混合后放入超声振荡仪，以300W功率超声振荡40min，过滤分离去除滤渣，得到滤液，再将滤渣按前述步骤重新操作，分离得到滤液，合并两次滤液;随后将合并得到的滤液放入高速离心机，以12000r/min转速离心处理15min，分离得到上清液，将上清液转入真空浓缩罐，减压至100Pa，浓缩至上清液原体积的1/3，得到粘稠浓缩液;接下来称取50g凹凸棒土放入研钵研磨成粉，分别用浓度为0.2mol/L盐酸溶液和0.5mol/L氢氧化钠溶液冲洗2h，放入马弗炉于800 °C下煅烧4h，得到表面改性得纳米凹凸棒土;之后将上述得到的纳米凹凸棒土浸入上述粘稠浓缩液中，放置在摇床上振荡浸渍过夜，再用喷雾干燥机喷雾干燥，得到固定化生物复合酶;再按摩尔比为1:3将对苯二酚和葡萄糖混合均匀后装入陶瓷酶解罐中，加入两者总体积2倍的正丁醇和两者总质量5%上述制得的固定化生物复合酶，放置在摇床上在60 °C下以300r/min转速振荡反应50h;最后将上述得到的反应液通过极性大孔树脂柱进行分离纯化得到流出液，把流出液放入真空干燥箱，在70°C和0.0SMPa的条件下干燥结晶，即得白色粉末状熊果苷。其中所述的极性大孔树脂柱为大孔树脂柱S-8柱。
[0016]本实例操作简便，使用时，取5g本发明制得的熊果苷倒入120mL化妆乳液中，充分混合均匀，在每天早晚洁面后取5mL混合液涂抹在脸部，轻轻拍打直至完全吸收为止，长期使用，不仅可以减少酪氨酸酶在皮肤中的沉积，对皮肤有漂白、防色变功效，而且可以防晒，
显著祛斑。
【主权项】
1.一种固定化生物复合酶催化合成熊果苷的方法，其特征在于具体制备步骤为: (1)选取20?30只白玉蜗牛放入烧杯中，向烧杯中加水直至水深达到I?2cm，再向水中滴加5?1mL菜籽油，搅拌均匀后静置饥饿处理5?7天，再将处理后的蜗牛取出，去壳解剖取出消化腺； (2)将上述得到的蜗牛消化腺和去离子水按固液比为1:8进行混合后放入超声振荡仪，以200?300W功率超声振荡20?40min，过滤分离去除滤渣，得到滤液，再将滤渣按前述步骤重新操作，分离得到滤液，合并两次滤液； (3)将合并得到的滤液放入高速离心机，以10000?12000r/min转速离心处理10?15min，分离得到上清液，将上清液转入真空浓缩罐，减压至900?100Pa，浓缩至上清液原体积的1/3，得到粘稠浓缩液； (4)称取40?50g凹凸棒土放入研钵研磨成粉，分别用浓度为0.2mol/L盐酸溶液和0.5mol/L氢氧化钠溶液冲洗I?2h，放入马弗炉于700?800 °C下煅烧2?4h，得到表面改性得纳米凹凸棒土； (5)将上述得到的纳米凹凸棒土浸入上述粘稠浓缩液中，放置在摇床上振荡浸渍过夜，再用喷雾干燥机喷雾干燥，得到固定化生物复合酶； (6)按摩尔比为1:3将对苯二酚和葡萄糖混合均匀后装入陶瓷酶解罐中，加入两者总体积I?2倍的正丁醇和两者总质量2?5%上述制得的固定化生物复合酶，放置在摇床上在40?60°C下以200?300r/min转速振荡反应40?50h; (7)将上述得到的反应液通过极性大孔树脂柱进行分离纯化得到流出液，把流出液放入真空干燥箱，在60?70°C和0.05?0.0SMPa的条件下干燥结晶，即得白色粉末状熊果苷。2.根据权利要求1所述的一种固定化生物复合酶催化合成熊果苷的方法，其特征在于:所述的极性大孔树脂柱为大孔树脂柱S-8柱。
【文档编号】C12P19/44GK105925644SQ201610492214
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】郭舒洋, 张明, 林茂平
【申请人】郭舒洋