从漆树木粉中提取具有抑制酪氨酸酶活性的硫磺菊素和紫铆花素的方法
【专利摘要】本发明涉及从漆树木粉中提取具有抑制酪氨酸酶活性的硫磺菊素和紫铆花素的方法，属于天然药物化学与化妆品的开发和应用领域。以漆树木粉为原料、经过提取、萃取、硅胶柱层析及中低压色谱可以快速有效地制备高含量的硫磺菊素和紫铆花素化合物。本发明制备的硫磺菊素和紫铆花素单体具有低浓度抑制酷氨酸酶的活性，对人体无毒害作用，在50μg/mL的浓度时，对酪氨酸酶的抑制率>95%，该制备过程快速简单，是开发潜在的天然酪氨酸酶抑制剂的良好来源，用于美白化妆品、预防和治疗由于人体黑色素过多导致的沉着性疾病，具有很好的商业前景。
【专利说明】
从漆树木粉中提取具有抑制酪氨酸酶活性的硫磺菊素和紫铆 花素的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及从漆树木粉中提取具有抑制酪氨酸酶活性的硫磺菊素和紫铆花素的 方法，属于天然药物、化妆品技术领域。
【背景技术】
[0002] 漆树（Rhus verni c i f 1 ua stoke s )，为漆树科（Anacardiaceae )漆树属 ((Toxicodendron)的一种落叶乔木。漆树是我国重要的特用经济林，生漆是天然树脂涂 料，素有"涂料之王"的美誉。它还是一种优良的药用木材，漆树的叶、花、根、皮、果实、干漆 和木心都可入药，有止咳、消癖、通经、杀虫、消肿等功效。漆树木质部位的多酚化合物是继 生漆漆酚、漆多糖后的主要活性物，大量的研究表明其具有优良的抗氧化性、抗肿瘤、抑菌 和免疫调节等作用。研究表明，硫磺菊素(3'，4'，7-trihydroxyaurone)具有抗氧化、降低氧 化应激、抗炎、抗血小板聚集、抗突变作用及预防帕金森。紫铆花素（7,3'，4'_ trihydroxydihydrof lavone)存在于几种中草药植物中，如零陵香豆、黄檀木、海红豆、斑鸠 菊及漆树中，具有美白、抗着床活性、抑制DNA氧化损伤及抗肿瘤和抗突变作用。
[0003] 据调研了解，我国化妆品市场以每年15%左右的速度增长，2011年已突破2000亿大 关，我国目前是全球第三大化妆品市场。根据市场研究公司Euromonitor的数据显示，在我 国的皮肤护理品市场中，美白产品占据了71%的份额。目前市场上销售的许多美白、祛斑产 品都是以抑制酪氨酸酶达到美白作用，从而促使了与酪氨酸酶抑制剂相关研究的蓬勃发 展。由于酪氨酸酶抑制剂在化妆品中的广泛使用，研究可以长期使用、安全、有效的药物将 成为人们要考虑的主要问题。世界各国植物资源丰富，天然资源因其药效温和、不良反应小 而被广泛认同，天然酪氨酸酶抑制剂的开发将成为化妆品领域一个备受瞩目的课题。
[0004] 我国是漆树的原产地，主要集中在陕西、四川、重庆、湖北、贵州、甘肃和云南七个 省，在镇雄、大方、毕节、赫章、北川、恩施等60多个县建立了漆树产业化种植基地，种植面 积达100万hm2,栽种漆树达150,000万株。但是目前漆树的产业主要集中在天然生漆涂料 的生产及开发，在漆籽的利用方面也比较薄弱，另外在漆树生长、利用过程中，大量的枝桠 茎材未得到利用，为了扩大漆树产业的规模化，延伸漆树资源的产业链，因此开展漆树多酚 具有抑制酪氨酸酶活性的化合物的提取制备研究，对于漆树资源的开发利用具有指导意 义。
【发明内容】
[0005] 为实现上述目的，发明了从漆树木粉中提取具有抑制酪氨酸酶活性的硫磺菊素和 紫铆花素的方法，其特征在于由以下步骤组成： 第一步 将漆树木粉，干燥去渣，按质量体积比为1:10~1:30(g:mL)，加入质量分数为50~95%的 乙醇水溶液或乙酸乙酯水溶液，减压回流提取2~3次，每次卜3h，过滤，滤液合并，于40~60°C 下减压蒸发除去溶剂，得到含水粗提液； 第二步 粗提液按质量比1:3~1:10 (g: mL)加入蒸馏水，搅拌溶解，加入石油醚萃取1~5次，分离， 在40~60°C下减压蒸发除去溶剂，得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯萃取1~5次，分 离，在40~60°C下减压蒸发除去溶剂，干燥得到乙酸乙酯萃取物； 第三步 将乙酸乙酯萃取物与硅胶填料按质量比1:15-50吸附，柱长50-150 cm，柱直径4-20 cm，采用不同比例石油醚与乙酸乙酯进行洗脱，收集抑制酪氨酸酶活性较高的石油醚：乙酸 乙酯体积比为6:4-5:5(V:V)的部位，真空浓缩，回收溶剂，得到富含硫磺菊素和紫铆花素的 提取物； 第四步 将富含硫磺菊素和紫铆花素的提取物与中低压色谱填料按质量比1:15-50吸附，中压 柱柱长20-80 cm，柱直径2-8 cm，采用不同比例的洗脱剂进行洗脱，柱压为0.5-10 MPa,检 测波长220-360 nm，流速3-50 mL/min，分别收集硫磺菊素和紫铆花素部位，真空浓缩，回收 溶剂，得到硫磺菊素和紫铆花素样品，将硫磺菊素和紫铆花素进行HPLC分析，含量为95%以 上； 第五步 硫磺菊素和紫铆花素进行抑制酪氨酸酶活性评价，通过紫外色谱检测多巴色素的生成 量，确定当硫磺菊素甲醇溶液浓度范围在1~50yg/mL，抑制率为31.5~100%，其IC50值为3.74 yg/mL;当紫铆花素甲醇溶液浓度范围在1~50yg/mL，抑制率为25~98.6%，其IC50值为4.32μ g/mL;通过对抑制酪氨酸酶活性的机理研究，硫磺菊素的抑制类型为竞争型，紫铆花素的抑 制类型为非克争型。
[0006] 中低压色谱填料为孔径为60 A，20-60 pm的ODS C18和C8材料中的一种，洗脱剂为 甲醇、乙醇和体积比0.5%-2%( ν: ν)的醋酸水中的一种或几种的混合溶液。
[0007] 冊^：分析条件为:4.6\250111111，5以111的(：18 6〇1(1八0反相柱，流动相为体积比为 50:50( ν: ν)的甲醇:体积比0.5-1%( v/v)醋酸水溶液，紫外检测器，检测波长为280和360nm， 流速为lmL/min〇
[0008] 本方法中采用醇溶液或乙酸乙酯溶液进行提取，经过萃取，硅胶柱层析与中低压 柱色谱分离得到硫磺菊素和紫铆花素，并经过MS、IR、1H-NMR和13C-NMR进行证实，两者的 结构为。
[0009]
本发明的有益效果： 本发明所提供的从漆树木粉中提取具有抑制酪氨酸酶活性的硫磺菊素和紫铆花素的 方法，还具有以下特点： (1) 本发明通过提取、萃取、硅胶柱层析及中低压色谱可以快速有效地制备高含量的硫 磺菊素和紫铆花素化合物； (2) 硫磺菊素和紫铆花素单体具有低浓度抑制酷氨酸酶的活性，对人体无毒害作用； (3) 本发明工艺操作简单，易实施，纯度高，活性高； (4) 漆树中的硫磺菊素和紫铆花素对酪氨酸酶具有显著的抑制作用，能够用于美白化 妆品、预防和治疗由于人体黑色素过多导致的沉着性疾病。
【附图说明】
[0010] 图1硫磺菊素的HPLC色谱图； 图2紫铆花素的HPLC色谱图； 图3硫磺菊素对酪氨酸酶的抑制作用； 图4紫铆花素对酪氨酸酶的抑制作用； 图5硫磺菊素对酪氨酸酶催化单酚底物的抑制作用； 图6紫铆花素对酪氨酸酶催化单酚底物的抑制作用； 图7硫磺菊素对酪氨酸酶催化二酸底物抑制作用的Lineweaver-Burk曲线； 图8紫铆花素对酪氨酸酶催化二酸底物抑制作用的Lineweaver-Burk曲线。
【具体实施方式】
[0011]以下实施例为本发明的一些举例，不应被看做是对本发明的限定。
[0012] 实施例1 第一步 将漆树木粉，干燥去渣，按质量体积比为1:10~1:30(g:mL)，加入质量分数为50~95%的 乙醇水溶液，减压回流提取2~3次，每次1~3h，过滤，滤液合并，于40~60°C下减压蒸发除去溶 剂，得到含水粗提液； 第二步 粗提液按质量比1:3~1:10 (g: mL)加入蒸馏水，搅拌溶解，加入石油醚萃取1~5次，分离， 在40~60°C下减压蒸发除去溶剂，得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯萃取1~5次，分 离，在40~60°C下减压蒸发除去溶剂，干燥得到乙酸乙酯萃取物； 第三步 将乙酸乙酯萃取物与硅胶填料按质量比1:15-50吸附，柱长50-150 cm，柱直径4-20 cm，采用不同比例石油醚与乙酸乙酯进行洗脱，收集抑制酪氨酸酶活性较高的石油醚：乙酸 乙酯体积比为6:4 (v:v)的部位，真空浓缩，回收溶剂，得到富含硫磺菊素的提取物； 第四步 将富含硫磺菊素的提取物与中低压色谱填料(孔径为60 Α，20-60 μπι的ODS C18)按质 量比1:15-50吸附，中压柱柱长20-80 cm，柱直径2-8 cm，采用不同比例的甲醇-0.5%的醋 酸水溶液进行洗脱，柱压为0.5-10 MPa，检测波长220-360 nm，流速3-50 mL/min，分别收 集硫磺菊素部位，真空浓缩，回收溶剂，得到硫磺菊素样品，将硫磺菊素进行HPLC分析，含量 为95%以上。
[0013] 冊^：分析条件为:4.6\250111111，5以111的(：18 6〇1(1八0反相柱，流动相为体积比为 50:50( v: v)的甲醇:体积比0.5-1%( v/v)醋酸水溶液，紫外检测器，检测波长为280和360nm， 流速为lmL/min〇
[0014] 经过MS、IR、1H-NMR和 13C-NMR鉴定为硫磺菊素。橙色粉末，ESI-MS (m/z):269[M- ΗΓ，C15H1Q05。盐酸-镁粉反应颜色无变化，三氯化铝反应颜色由橙色变成淡黄色，说明该化 合物为橙酮。IR:3321，1597，1516，1456，1370，1287，1134cm-1，UV/VisXmax(Me0H) :206， 257,387^1,11 NMR(300MHz，DMS0-d6)jll.l(lH，s，7-OH)，9.63(lH，s，4'-OH)，9.23(lH，s， 3'-OH)，7.68(lH，d，J=8.2Hz，H-5)，7.44(lH，d，J=1.9Hz，H-5'），7.26(lH，dd，J=8.4 and 2.0 Hz，H-6'），6.88(lH，d，J=8.2Hz，H-2'），6.74(lH，d，J=1.8Hz，H-8)，6.69(lH，dd，J=8.5 and 1.7抱，!1-6)，6.63(1!1，8，!1-2)。13(： MMR(300MHz，DMS0-d6)Jl81.1 (C-4)，167.3(C- 9)，166·0(C-7)，148·0(C-4'），145·6(C-3)，145·5(C-3'），125.7(C-6'），124.5(05)，123.3 (C-l'），117.9(C-5'），116.0(C-2'），113.2(C-10)，112.8(C-6)，111.9(C-2)，98.3(C-8)。
[0015] 实施例2 第一步 将漆树木粉，干燥去渣，按质量体积比为1:10~1:30(g:mL)，加入质量分数为50~95%的 乙酸乙酯水溶液，减压回流提取2~3次，每次1~3h，过滤，滤液合并，于40~60°C下减压蒸发除 去溶剂，得到含水粗提液； 第二步 粗提液按质量比1:3~1:10 (g: mL)加入蒸馏水，搅拌溶解，加入石油醚萃取1~5次，分离， 在40~60°C下减压蒸发除去溶剂，得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯萃取1~5次，分 离，在40~60°C下减压蒸发除去溶剂，干燥得到乙酸乙酯萃取物； 第三步 将乙酸乙酯萃取物与硅胶填料按质量比1:15-50吸附，柱长50-150 cm，柱直径4-20 cm，采用不同比例石油醚与乙酸乙酯进行洗脱，收集抑制酪氨酸酶活性较高的石油醚：乙酸 乙酯体积比为5:5(V:V)的部位，真空浓缩，回收溶剂，得到富含紫铆花素的提取物； 第四步 将富含紫铆花素的提取物与中低压色谱填料(孔径为60 Α，20-60 μπι的ODS C8)按质量 比1:15-50吸附，中压柱柱长20-80 cm，柱直径2-8 cm，采用不同比例的甲醇-2%的醋酸水溶 液进行洗脱，柱压为0.5-10 MPa,检测波长220-360 nm，流速3-50 mL/min，分别收集紫铆 花素部位，真空浓缩，回收溶剂，得到紫铆花素样品，将紫铆花素进行HPLC分析，含量为95% 以上。
[0016] 冊^：分析条件为:4.6\25〇111111，5以111的(：18 6〇1(1八〇反相柱，流动相为体积比为 50:50( v: v)的甲醇:体积比0.5-1%( v/v)醋酸水溶液，紫外检测器，检测波长为280和360nm， 流速为lmL/min〇
[0017] 经过MS、IR、1H-NMR和13C-NMR鉴定为紫铆花素。淡黄色粉末，ESI-MS (m/z): 271 [Μ-ΗΓ，&5Η1205。盐酸-镁粉反应呈紫红色，硼氢化钠反应由蓝变成紫红，说明该化合物为二 氢黄酮。IR:3300,2966,1638,1594,1557,1514,1444,1354,1235,1315,1148 cm-Suv/Vis λ max (Me0H):221，261，371nm。咕 NMR(300MHz，Me0H-d4)J7.95(lH，d，J=8.7Hz，H-5)，7.75 (lH，d，J=1.7Hz，H-2'），7.56(lH，d，J=8.2Hz，H-5'），7.12(lH，dd，J=8.2 and 1·8Ηζ，Η-6'）， 6.80(lH,ddJ=8.7 and 2.2 Hz ,H-6) ,6.43( lH,dJ=2.1Hz ,H-8) 013C NMR(300MHz,Me0H- d4):Sl94.0(C-4)，168.0(07)，166.8(C-9)，147.3(C-3'），146.6(C-4'），133.8(C-1'）， 129.0(C-5)，124.1(C-6，），118.8(05,），116.3C-10)，113.2(02,），109.6(06)，104.3 (C-8)0
[0018] 实施例3 第一步 将漆树木粉，干燥去渣，按质量体积比为1:10~1:30(g:mL)，加入质量分数为50~95%的 乙酸乙酯水溶液，减压回流提取2~3次，每次1~3h，过滤，滤液合并，于40~60°C下减压蒸发除 去溶剂，得到含水粗提液； 第二步 粗提液按质量比1:3~1:10 (g: mL)加入蒸馏水，搅拌溶解，加入石油醚萃取1~5次，分离， 在40~60°C下减压蒸发除去溶剂，得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯萃取1~5次，分 离，在40~60°C下减压蒸发除去溶剂，干燥得到乙酸乙酯萃取物； 第三步 将乙酸乙酯萃取物与硅胶填料按质量比1:15-50吸附，柱长50-150 cm，柱直径4-20 cm，采用不同比例石油醚与乙酸乙酯进行洗脱，收集抑制酪氨酸酶活性较高的石油醚：乙酸 乙酯体积比为6:4 (v:v)的部位，真空浓缩，回收溶剂，得到富含硫磺菊素的提取物； 第四步 将富含硫磺菊素的提取物与中低压色谱填料(孔径为60 Α，20-60 μπι的ODS C8)按质量 比1:15-50吸附，中压柱柱长20-80 cm，柱直径2-8 cm，采用不同比例的乙醇-2%的醋酸水溶 液进行洗脱，柱压为0.5-10 MPa,检测波长220-360 nm，流速3-50 mL/min，分别收集硫磺 菊素部位，真空浓缩，回收溶剂，得到硫磺菊素样品，将硫磺菊素进行HPLC分析，含量为95% 以上。
[0019] 实施例4 第一步 将漆树木粉，干燥去渣，按质量体积比为1:10~1:30(g:mL)，加入质量分数为50~95%的 乙醇水溶液，减压回流提取2~3次，每次1~3h，过滤，滤液合并，于40~60°C下减压蒸发除去溶 剂，得到含水粗提液； 第二步 粗提液按质量比1:3~1:10 (g: mL)加入蒸馏水，搅拌溶解，加入石油醚萃取1~5次，分离， 在40~60°C下减压蒸发除去溶剂，得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯萃取1~5次，分 离，在40~60°C下减压蒸发除去溶剂，干燥得到乙酸乙酯萃取物； 第三步 将乙酸乙酯萃取物与硅胶填料按质量比1:15-50吸附，柱长50-150 cm，柱直径4-20 cm，采用不同比例石油醚与乙酸乙酯进行洗脱，收集抑制酪氨酸酶活性较高的石油醚：乙酸 乙酯体积比为5:5(V:V)的部位，真空浓缩，回收溶剂，得到富含紫铆花素的提取物； 第四步 将富含紫铆花素的提取物与中低压色谱填料(孔径为60 Α，20-60 μπι的ODS C18)按质 量比1:15-50吸附，中压柱柱长20-80 cm，柱直径2-8 cm，采用不同比例的乙醇-1%的醋酸水 溶液进行洗脱，柱压为0.5-10 MPa，检测波长220-360 nm，流速3-50 mL/min，分别收集紫 铆花素部位，真空浓缩，回收溶剂，得到紫铆花素样品，将紫铆花素进行HPLC分析，含量为 95%以上。
[0020] 实施例5 将不同浓度硫磺菊素和紫铆花素对酪氨酸酶活性的抑制作用如图3和图4所示。硫磺菊 素和紫铆花素对酪氨酸酶活性的抑制作用对浓度呈现依赖性，随着浓度的增大，其抑制率 增加，对不同浓度的硫磺菊素与酪氨酸酶抑制率的变化规律进行线性拟合，可以得到拟合 方程为： y = 6.506x + 25.65 (1) 式中：y=硫磺菊素对酪氨酸酶活性的抑制率，％; χ=硫磺菊素的质量浓度，yg/mL。
[0021] 该拟合方程（1)的相关系数R为0.993，说明，这组数据的线性拟合是有效的。根 据方程可以计算硫磺菊素的IC50为3.74yg/mL。
[0022] 对不同浓度的紫铆花素与酪氨酸酶抑制率的变化规律进行线性拟合，可以得到拟 合方程为： y = 6.436x + 22.18 (2) 式中：y=紫铆花素对酪氨酸酶活性的抑制率，％; x=紫铆花素的质量浓度，yg/mL。
[0023] 该拟合方程（1)的相关系数R为0.984,说明，这组数据的线性拟合是有效的。根据 方程可以计算硫磺菊素的IC50为4.32yg/mL。
[0024] 实施例6 以L-酪氨酸的浓度为lmmol/L，测定不同浓度的硫磺菊素和紫铆花素对酪氨酸酶单酚 酶抑制作用的变化曲线，如图5和6所示。当紫铆花素和硫磺菊素的浓度为0.185 mmol/L和 O.lllmmol/L时，在30min内，多巴色素几乎没有明显增加，表明，酪氨酸酶的活性几乎被紫 铆花素和硫磺菊素完全抑制。
[0025]酪氨酸酶催化L-酪氨酸具有迟滞效应，主要是酪氨酸酶对L-酪氨酸进行羟基化 时，由于酪氨酸酶的自身结构特点使该反应过程受到较大的空间位阻，这个是酪氨酸酶的 单酚酶的特点。因此对不同浓度化合物存在下的酪氨酸酶反应动力学曲线的反应初始阶段 做切线，切线与X轴的截距为迟滞时间。从表1可以看出随着漆黄素、紫铆花素和硫磺菊素浓 度的增大，酶催化反应的迟滞时间延长;没有化合物存在下迟滞时间为lmin，当漆黄素浓度 为0 · 524 mmol/L时，迟滞时间延长至11 · 2min;当紫铆花素的浓度为0 · 185 mmol/L时，迟滞 时间延长至26min;当硫磺菊素的浓度为0.1 ll mmol/L时，迟滞时间延长至6min。在催化反 应过程中，酪氨酸酶以还原型、氧化型和脱氧型3种形式存在。在单酚活性催化反应过程中， 还原型与氧化型的酪氨酸酶即可以与二酚底物结合，也可以与单酚底物结合，进入正常的 催化循环反应，而还原型的酪氨酸酶与单酚底物结合后，不能正常进入催化循环反应，从而 导致了催化反应进入稳态所需时间的延长。而高浓度的漆黄素、紫铆花素和硫磺菊素存在 时，因其化学结构中含邻苯二酚结构，与二酚底物相近，可以竞争性地与酪氨酸酶结合。因 此，迟滞时间的延长表明高浓度化合物的存在使L-酪氨酸更难与酪氨酸酶活性位点结合。
[0026]表1化合物浓度对酪氨酸酶迟滞时间的影响
实施例7 在测定体系中，酪氨酸酶的浓度和用量固定，通过改变底物L-多巴的浓度，测定不同浓 度化合物对酪氨酸酶活力的影响。采用Lineweaver-Burk即双倒数作图法，以L-多巴浓度的 倒数1/[S]为X轴，反应速度的倒数1/V为y轴作图，KjPVm可以从曲线的斜率和截距获得[25]。 紫铆花素的浓度为7.4、18.5、185以111111〇1/1，硫磺菊素的浓度为1.85、14.8、111.1以臟〇1/1， 双倒数曲线如图7和图8所示。随着紫铆花素浓度的增大，直接横轴截距基本不变，即Km不随 着浓度发生变化，V?值变小，符合非竞争性抑制的特征。随着硫磺菊素(c)浓度增大，直线 纵轴截距基本不变，即Vm不随着浓度发生变化，而Km值增大，符合竞争性可逆抑制类型的特 征。前期研究发现漆树乙酸乙酯部位具有一定的抑制酪氨酸酶活性，其抑制类型为混合型。 漆黄素、紫铆花素和硫磺菊素为漆树乙酸酯部位中的主要黄酮类化合物，大量的研究表明 黄酮类化合物具有优良的抑制酪氨酸酶的作用[23,26]，其抑制类型主要为竞争型和非竞争 型。硫磺菊素对酪氨酸酶二酚催化活性显示为竞争型，表明其能够竞争性地与酪氨酸酶结 合，从而消弱L-多巴的催化氧化反应。而紫铆花素对酪氨酸酶二酚催化活性显示为非竞争 型，说明紫铆花素即可与酪氨酸酶结合，也可以与底物进行结合，两者的解离常数相等。
【主权项】
1. 从漆树木粉中提取具有抑制酪氨酸酶活性的硫磺菊素和紫铆花素的方法，其特征在 于由以下步骤组成： 第一步 将漆树木粉，干燥去渣，按质量体积比为1:10~1:30(g:mL)，加入质量分数为50~95%的 乙醇水溶液或乙酸乙酯水溶液，减压回流提取2~3次，每次1~3h，过滤，滤液合并，于40~60 °C 下减压蒸发除去溶剂，得到含水粗提液； 第二步 粗提液按质量比1:3~1:10 (g: mL)加入蒸馏水，搅拌溶解，加入石油醚萃取1~5次，分离， 在40~60°C下减压蒸发除去溶剂，得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯萃取1~5次，分 离，在40~60°C下减压蒸发除去溶剂，干燥得到乙酸乙酯萃取物； 第三步 将乙酸乙酯萃取物与硅胶填料按质量比1:15-50吸附，柱长50-150 cm，柱直径4-20 cm，采用不同比例石油醚与乙酸乙酯进行洗脱，收集抑制酪氨酸酶活性较高的石油醚：乙酸 乙酯体积比为6:4-5:5(V:V)的部位，真空浓缩，回收溶剂，得到富含硫磺菊素和紫铆花素的 提取物； 第四步 将富含硫磺菊素和紫铆花素的提取物与中低压色谱填料按质量比1:15-50吸附，中压 柱柱长20-80 cm，柱直径2-8 cm，采用不同比例的洗脱剂进行洗脱，柱压为0.5-10 MPa,检 测波长220-360 nm，流速3-50 mL/min，分别收集硫磺菊素和紫铆花素部位，真空浓缩，回收 溶剂，得到硫磺菊素和紫铆花素样品，将硫磺菊素和紫铆花素进行HPLC分析，含量为95%以 上； 第五步 硫磺菊素和紫铆花素进行抑制酪氨酸酶活性评价，通过紫外色谱检测多巴色素的生成 量，确定当硫磺菊素甲醇溶液浓度范围在1~50yg/mL，抑制率为31.5~100%，其IC50值为3.74 yg/mL;当紫铆花素甲醇溶液浓度范围在1~50yg/mL，抑制率为25~98.6%，其IC50值为4.32μ g/mL;通过对抑制酪氨酸酶活性的机理研究，硫磺菊素的抑制类型为竞争型，紫铆花素的抑 制类型为非克争型。2. 根据权利要求所述从漆树木粉中提取具有抑制酪氨酸酶活性的硫磺菊素和紫铆花 素的方法，其特征在于第四步中低压色谱填料为孔径为60 Α，20-60 μπι的ODS C18和C8材料 中的一种，洗脱剂为甲醇、乙醇和体积比〇.5%-2%(V:V)的醋酸水中的一种或几种的混合溶 液。3. 根据权利要求1所述的从漆树木粉中提取具有抑制酪氨酸酶活性的硫磺菊素和紫铆 花素的方法，其特征在于冊^：分析条件为:4.6\250臟，5以111的(：18 6〇1(1八0反相柱，流动 相为体积比为50:50(V:V)的甲醇:体积比0.5-1%(v/v)醋酸水溶液，紫外检测器，检测波长 为280和360nm,流速为lmL/min。
【文档编号】C07D311/40GK105837540SQ201610154869
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年3月18日
【发明人】王成章, 陈虹霞
【申请人】中国林业科学研究院林产化学工业研究所