选物和源自轮10的候选物灯10. 1、τ. 10. 1A、T10. 1B、T10. 1C、T10. 1D)进行处 理72小时后，确定酪氨酸酶的酶活性。在四个递增的浓度：4、20、100和200nM测试每个适 体。
[0181] 将细胞用PBS冲洗，然后将50μ1的TritonX100(0. 5% )加入到每个孔中，将板 在4°C下振荡1小时。通过加入50μ1底物（lOmML-D0PA，Sigma)至各孔启动反应。在稳 定的振荡中，在37°C下每2分钟在450nm处测量多己色素的表观持续1小时。由此得到的 反应速率W0D单位/分钟表示。
[0182] 使用BMGPOLARstar板读数器分光光度计在巧0°C下监测吸光度（450nm)随时间 的变化。绘制表示吸光度（吸光度单位）作为时间（分钟）函数的曲线。
[0183] 反应的初始速率由通过原点计算切线的斜率来确定。V。表示在没有效应物时的初 始速率，W及V康示在存在效应物时的运种速率。计算比率（Vi/V。）X100 :如果运种比率等 于100,效应物对酶活性没有作用；如果低于100,则效应物是酶活性的抑制剂；如果在100 W上，则其为活化剂。运种测量的结果示于图3。
[0184] 在图3显示的结果表示每个测试的候选物对酪氨酸酶活性都具有抑制作用。除了 在缩短最多的候选物T10. 1D的最低浓度（4和20nM)中W外，运种作用对每个测试条件都 是显著的。
[0185] 不管W何种浓度进行测试，构成轮10的候选物的组在酪氨酸酶活性上具有显著 作用，在75%W上。未观察到剂量依赖性作用。对于T10.1候选物获得类似结果。
[0186] 缩短的候选物T10. 1A和T10. 1B也都是酪氨酸酶活性的抑制剂。然而运种抑制弱 于全长轮10候选物和T10. 1的抑制，特别是在最低浓度（4和20nM)时。
[0187] 无论测试浓度如何，候选物T10. 1C都具有抑制运种酶的良好能力。特别地，当此 候选物W200nM的浓度使用时，注意到近95%酪氨酸酶活性的抑制。没有其它测试候选物 在此浓度具有如此高的活性。
[018引无论测试浓度如何，缩短最多的候选物T10. 1D具有最低的抑制活性。
[0189] 运些结果表明适体T10. 1D的结构中不存在对抑制酪氨酸酶活性重要的区域。
[0190] 示例性制剂
[0191] 实施例A:淡化面部肤色的化妆粉末
[0192]
阳19引该粉末具有双重作用。它清洁皮肤，此外通过若干天的经常使用来淡化肤色。它 可一天两次施加到面部皮肤上。
[0194] 实施例B:乳液-凝胶形式的化妆脱色素日霜
[0195]
[0196] 一些人暴露至相对强烈的日光照射中、或者甚至是阳光直射中，他们希望保持浅 肤色W及避免色素斑的出现。使用上述乳液-凝胶将有可能实现此目的。运种组合物通常 在早晨时施加至面部。它既用于预防又用于治疗面部无论均匀与否的色素沉着。
[0197] 实施例C:化妆液防晒组合物（SPF30)
[0198]
[0199] 运种组合物在暴露于强烈的阳光之前使用。它可W防止易患色素沉着斑的人出现 运种现象。应当指出的是，高浓度防晒的存在补偿了天然保护的减少，导致黑色素水平的降 低。
[0202]
[0200] 实施例D:用于治疗由病理或外伤造成的皮肤色素沉着过度的皮肤霜[0201]
[020引使用此霜剂W减弱由病理或创伤造成的皮肤色素沉着过度。此霜还减弱在白齋风 的情况下稱色区域周边的颜色对比。
[0204] 实施例E:用于淡化肤色的化妆面部洗剂
[0205]
阳20引运种用于淡化肤色的洗剂在卸妆和清洁皮肤后使用。
[0207] 实施例F:用于面部的化妆淡化精华液 [020引
[0209] 通常在施用面霜前将一滴运种高浓缩的精华液组合物施用至面部。运种精华液通 常用在一至两周的治疗中W获得或保持淡化的肤色。
[0210] 实施例G:用于淡化体毛的化妆洗剂
[0211]
邮1引运种洗剂施用至待淡化的毛发区域（特别是手臂）足够长一段时间W获得毛发逐 渐变淡。
[021引实施例Η:用于手部的防止斑点的化妆霜剂凝胶[0214]
[〇引引运种霜剂应直接施用至手部斑点（太阳斑和/或老年斑）W减弱斑点的颜色。
【主权项】
1. 一种能够抑制酪氨酸酶的酶活性用于将酪氨酸转化成L-DOPA和多巴醌的DNA适体。2. 根据权利要求1所述的适体，能够以高亲和性结合至酪氨酸酶。3. 根据权利要求1或2所述的适体，其耐受核酸酶。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的适体，其包含序列SEQIDNO:5。5. 根据权利要求4所述的适体，其包含选自SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、 SEQIDNO:4 和SEQIDNO:6 的序列。6. 根据权利要求4所述的适体，其包含SEQIDNO:6的至少10个连续核苷酸，在其5' 侧接序列SEQIDNO:7从其3'端开始的一个或更多个连续核苷酸，和/或在3'侧接序列 SEQIDNO:8从其5'端开始的一个或更多个连续核苷酸。7. 根据权利要求6所述的适体，其包含SEQIDNO:6,在所述SEQIDNO: 6的5'侧接 序列SEQIDNO:7从其3'端开始的一个或更多个连续核苷酸，和/或在所述SEQIDNO:6 的3'侧接序列SEQIDNO:8从其5'端开始的一个或更多个连续核苷酸。8. 根据权利要求1至3中任一项所述的适体，其包含下列序列： XlXnX(n+l) XmX(m+l) XpX (p+1) ^(r+l)X〇X(o+l) ^(s+l) 其中每个X是核苷酸 1彡η彡5 n+1 <m<η+5 m+1ρm+5 p+1 <r<p+10,优选p+2 <r<p+8,在特别优选的方式中r=p+5 r+1or+5 o+l<s< 0+5 s+1 <t<s+5 t-s=n o-r=p-m n、m、p、r、〇、s、t均为整数并表示核苷酸的位置， 核苷酸Xn以及X(s+1)至X屬A、T、G或C，优选G或C，前提是它们是配对的，从而 形成茎， 核苷酸至Xp以及Xμ至X。是A、T、G或C，优选G或C，前提是它们是配对的，从 而形成茎， 核苷酸&+1)至X"以及X(。+1)至X3是A、T、G或C且不配对从而形成环， 核苷酸Χ(ρ+1)至X1^是A、T、G或C且不配对从而形成环。9. 根据前述权利要求中任一项所述的至少一种适体在抑制酪氨酸酶的酶活性中的用 途。10. -种化妆品或药物组合物，其含有足以抑制酪氨酸酶的酶活性的量的根据权利要 求1至8中任一项所述的适体作为活性剂，以及一种或更多种化妆品上/药学上可接受的 赋形剂。11. 根据权利要求10所述的组合物，其特征在于其包含占组合物重量的从〇. 00001 % 至10%，优选从0. 00005%至5%，更优选从0. 001 %至1 %的一种或更多种适体。12. 根据权利要求1至8中任一项所述的适体的化妆品用途，优选用于脱色素或淡化皮 肤、体毛和/或头发。13. 根据权利要求1至8中任一项所述的适体，其作为药物。14. 根据权利要求1至8中任一项所述的适体，用于治疗或预防由于黑素细胞机能亢进 所引起的区域色素沉着过度如特发性黑斑病、由于良性黑素细胞机能亢进和增殖所引起的 局部色素沉着过度如年龄或肝斑（老年斑）、意外色素沉着过度如光敏或与疤痕相关的色 素沉着过度、以及用于治疗某些白斑病如白癜风。15. 用于选择根据权利要求1至8中任一项所述的适体的方法，包括以下步骤： -通过SELEX方法在DNA文库中选择针对酪氨酸酶的适体， -评估在前述步骤中鉴定的适体抑制酪氨酸酶的酶活性的潜能， -克隆和测序由此选择的适体。
【专利摘要】本发明涉及可抑制酪氨酸酶的酶活性的用于将酪氨酸转化成L-DOPA和多巴醌的DNA适体，及其皮肤学和化妆品用途。
【IPC分类】A61Q19/02, A61K31/7088, A61P17/00, C12N15/115
【公开号】CN105264075
【申请号】CN201380073500
【发明人】J·H·科沙尔, R·库菲尔斯特, S·施内博特, E·多斯, J-J·图尔梅
【申请人】Lvmh研究公司, 国家健康科学研究所
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2013年12月20日
【公告号】EP2935587A1, US20150329863, WO2014102213A1