新型o-磷酸丝氨酸输出蛋白及使用其生产o-磷酸丝氨酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种新型分离的多肤，所述多肤具有输出0-憐酸丝氨酸（在下文中描 述为"OPS")的能力，所述OPS是k半脫氨酸的前体；编码该多肤的多核巧酸；包含该多核 巧酸的载体；生产OPS的微生物，所述微生物具有增强的多肤活性；使用该微生物生产OPS 的方法；W及制备半脫氨酸或其衍生物的方法，所述方法包括在0-憐酸丝氨酸硫化氨解酶 ((PS巧或表达0PSS的微生物的存在下，使由上述生产(PS的方法生产的(PS与硫化物进行 反应。
【背景技术】
[0002] 心半脫氨酸一-在所有活的有机体中的硫的代谢作用中起重要作用的氨基 酸一-不仅用于生物蛋白质诸如毛发角蛋白、谷脫甘肤、生物素、甲硫氨酸及其它含硫代谢 物的合成，也用作辅酶A生物合成的前体。
[0003] 利用微生物生产k半脫氨酸的已知方法包括利用微生物将化L-ATC生物转化 为k半脫氨酸的方法（Ryu0H等人，ProcessBiochem. , 32:201-209, 1997)。另一个已知 的方法是通过使用大肠杆菌直接发酵生产k半脫氨酸的方法巧P0885962B;WadaΜand TakagiΗ,Appl.Microbiol.Biochem. , 73:48-54, 2006)。同时，本发明人进行研究W开发新 的生产心半脫氨酸的方法，结果发现在某些微生物中从0-憐酸丝氨酸（OP巧合成k半脫 氨酸的酶（0-憐酸丝氨酸硫化氨解酶（0PSS))。基于该发现，本发明人开发了通过将(PS与 0PSS酶反应、通过培养突变微生物W在其中积累(PS而生产半脫氨酸的方法（韩国专利公 开号10-2012-004111)。为了W高产量生产半脫氨酸，仍需要生产过量的OPS。因此，本发 明人已做出大量的努力W发现合适的输出物（exporter),所述输出物使在生产OPS的菌株 中生产的0-憐酸丝氨酸能被顺利地从细胞释放。此外，基于不同类型的已知转运蛋白，本 发明人筛选出编码0-乙酷丝氨酸/半脫氨酸外排累蛋白（effluxpumpprotein)的ydeD、 编码0-乙酷丝氨酸/半脫氨酸外排通透酶的钟化(hankeI,ReschA,DasslerΤ,Maier ΤandBockA,J.Bacteriology, 185:1161-166, 2003)、编码高丝氨酸 / 高丝氨酸内醋外排 累蛋白的rh1:B狂akataevaNP,AleshinVV,TokmakovaIL,T;roshinPV,LivshitsVA阳BS Lett1999 ;452 (3) :228-32)等，并具体发现生产OPS的菌株中化巧的增强导致OPS的浓 度增加（韩国专利公开号10-2012-0041115)。然而，对于半脫氨酸更高产量的生产，仍需要 开发具有更高输出(PS能力的转运蛋白。
【发明内容】
[0004] 技术问题
[0005] 本发明人已做出大量的努力发现具有(PS输出活性的蛋白质，W能够进一步增加 OPS的生产，结果是，已鉴定出两种具有优异(PS输出活性的新型多肤，并发现该多肤可W 更有效地从生产OPS的菌株中输出0PS，从而完成本发明。
[000引解决方案
[0007] 本发明的一个目的是提供生产0-憐酸丝氨酸（0P巧的方法，其包括培养生产 0-憐酸丝氨酸的微生物，所述微生物具有增强的多肤活性，所述多肤具有SEQIDN0:1或2 的氨基酸序列，并且具有WS输出活性。
[0008] 本发明的另一个目的是提供一种新型分离的多肤，其具有SEQIDN0:1或2的氨 基酸序列，并且具有0-憐酸丝氨酸输出活性。
[0009] 本发明的又一个目的是提供编码该多肤的多核巧酸，W及包含该多核巧酸的载 体。
[0010] 本发明的又一个目的是提供一种具有增强的多肤活性的生产0-憐酸丝氨酸的微 生物，所述多肤具有SEQIDNO: 1或2的氨基酸序列，并且具有0-憐酸丝氨酸（0P巧输出 活性。
[0011] 本发明的又一个目的是提供生产半脫氨酸或其衍生物的方法，其包括在0-憐酸 丝氨酸硫化氨解酶（CPS巧或表达0PSS的微生物的存在下，使由上述生产0-憐酸丝氨酸的 方法所生产的0-憐酸丝氨酸与硫化物进行反应。
[0012] 发明的有利效果
[0013] 本发明的具有SEQIDNO: 1或2的氨基酸序列的新型多肤具有优异的(PS输出活 性，因而将该多肤应用于生产0-憐酸丝氨酸的微生物时，在该微生物中可W高效率地生产 0-憐酸丝氨酸。
[0014] 附图简述
[001引图1是显示在将OPS完全移除后通过高效液相色谱她LC)测量细胞内OPS的结 果的图解图，所述WS是从本发明的具有增强的Yg巧蛋白和MacB蛋白活性的重组微生物 的培养物中释放。
[0016] 图2是显示通过从0-憐酸丝氨酸的生物合成和微生物发酵积累0-憐酸丝氨酸并 将所积累的0-憐酸丝氨酸酶促地转化成k半脫氨酸而生产k半脫氨酸的方法的示意图。
[0017] 实施发明的最佳方式
[0018] 本发明的方面包括生产0-憐酸丝氨酸（0P巧的方法，其包括培养具有增强的多肤 活性的生产0-憐酸丝氨酸的微生物，所述多肤具有SEQIDN0:1或2的氨基酸序列，并且 具有0-憐酸丝氨酸（0P巧输出活性。
[0019] 具体地，根据本发明的W上方面所述的方法可W包括W下步骤：a)通过培养具有 增强的多肤活性的生产WS的微生物来生产0PS，所述多肤具有SEQIDNO: 1或2的氨基酸 序列，并且具有(PS输出活性；和b)从微生物的培养物中分离0PS，但不限于此。
[0020] 本发明方法的步骤a)是培养具有增强的多肤活性的生产(PS的微生物的步骤，所 述多肤具有SEQIDNO: 1或2的氨基酸序列，并且具有(PS输出活性。
[0021] 如本文所使用的，术语"0-憐酸丝氨酸（在下文中描述为"OPS")"是指丝氨酸和 憐酸的醋，其是许多蛋白质的组分。WS是k半脫氨酸的前体，并且可W在WS硫化氨解酶 (在下文中描述为"0PSS")的催化作用下通过与硫化物反应而转化成半脫氨酸。因此，其 是半脫氨酸的生产中提高WS生产率的重要因素，并因此需要开发出使细胞内WS能够从 生产OPS的菌株中有效分泌的转运蛋白。
[0022] 如本文所使用的，表述"具有0-憐酸丝氨酸（0P巧输出活性的多肤"是指具有OPS 输出活性的膜蛋白。具体地，该多肤是大肠杆菌巧.coli)膜蛋白。本发明人已鉴定出两种 大肠杆菌膜蛋白，该膜蛋白是能够将WS从细胞中输出并且衍生自可W在过量WS存在的 条件下生长的大肠杆菌的新型膜蛋白。具体地，具有WS输出能力的新型大肠杆菌膜蛋白 是具有SEQIDNO: 1的氨基酸序列的、经鉴定的Yg巧一一其为预测的内膜蛋白一一和具有 沈QIDN0:2的氨基酸序列的、经鉴定的MacB(MacAB-TolC大环内醋输出转运系统-膜亚 单元）。已知的是，SEQIDN0:1的Yg巧蛋白充当大肠杆菌内膜蛋白，而SEQIDN0:2的 MacB蛋白充当大环内醋转运蛋白，但在本发明之前该蛋白的OPS输出活性并非是已知的， 并且是由本发明人首次鉴定。此外，本发明多肤的范围不仅涵盖具有SEQIDN0:1或2的 氨基酸序列的多肤，而且涵盖具有与SEQIDN0:1或2的氨基酸序列具有至少70%、具体地 至少80%、更具体地至少90%、甚至更具体地至少95%、甚至更具体地至少98%W及最具 体地至少99%同源性的氨基酸序列，并且基本上具有与SEQIDN0:1或2的多肤相同或相 当的WS输出活性的膜蛋白。此外，明显的是，只要具有上述同源性且基本上具有WS输出 活性，包含SEQIDNO: 1或2的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基的缺失、修饰、取代或 添加的多肤变体都落在本发明的范围内。
[0023] 如本文所使用的，术语"同源性"是指两个多核巧酸或多肤部分之间的同一性的百 分比。从一种形式至另一种形式的序列间的对应关系可W通过本领域已知的技术确定。例 如，同源性可W通过对两个多肤分子之间的序列信息进行直接比较而测定，所述比较通过 比对序列信息并使用容易获得的计算机程序进行。可选地，同源性可W通过如下测定：在同 源区域之间形成稳定双链体的条件下多核巧酸的杂交，然后用单链特异性核酸酶的消化W 及消化片段的尺寸测定。
[0024] 如本文所使用的，所有语法形式和拼写变型的术语"同源的"是指蛋白之间的关 系，所述蛋白具有"共同的进化起源"，包括来自超家族的蛋白质化及不同物种的同源蛋白。 运种蛋白（及其编码基因）具有由其高程度的序列相似性反映的序列同源性。然而，在通 常使用和本发明中，当用形容词如"非常高"修饰时，术语"同源的"可W是指序列相似性， 而不是共同的进化起源。
[0025] 如本文所使用的，术语"序列相似性"是指可W或可W不共享共同的进化起源的 蛋白质的核酸或氨基酸序列之间的同一性或对应关系的程度。在一个实施方式中，当多肤 的至少约21% (具体地至少约50%，并且最具体地至少约75%、90%、95%、96%、97%或 99% )在氨基酸序列的限定长度上匹配时，两个氨基酸序列是"基本上同源的"或"基本上 相似的"。基本上同源的序列可W通过使用序列数据库中可用的标准软件来比较序列而鉴 定，或者例如在针对该具体系统所限定的严格条件下通过DNA杂交实验进行鉴定。限定适 当的杂交条件是在本领域的技术范围内（例如，参见Sambrook等人，1989,in化a)。
[0026] 在本发明的实施例中，显示出，相比作为比较组的具有增强的rhtB、emrD或ycaD 的菌株（实施例3)，具有SEQIDN0:1的氨基酸序列的多肤的增强活性或具有SEQIDN0:2 的氨基酸序列的多肤的增强活性的菌株具有优异的(PS分泌活性。
[0027] 如上所述，本发明的多肤具有优异的(PS输出活性，并因此当培养具有增强的多 肤活性的微生物时，可W有效生产OPS。
[0028] 只要是可W增强多肤的活性，增强多肤活性的方法并不受具体地限制。该方法的 实例包括增加编码多肤的基因的细胞内复制数目的方法、将突变引入编码多肤的染色体基 因的表达调控序列的方法、用具有强活性的序列置换编码多肤的染色体基因的表达调控序 列的方法、用经突变W增加多肤活性的基因取代编码多肤的染色体基因的方法、W及将突