专利名称：作为肺鳞状细胞癌标志物的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白b13的制作方法
作为肺鳞状细胞癌标志物的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13本发明涉及一种辅助评估鳞状细胞癌(=SCC)的方法。其公开了蛋白质丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13作为SCC标志物的应用。此外，其涉及一种评估从患有非小细胞肺癌 (=NSCLC)的患者中获得的组织样品中的肺癌以及将肺腺癌或大细胞癌与SCC区分开的方法。尽管在检测和治疗方面取得了进展，癌症仍然是主要的公众卫生挑战。在各种癌症类型中，LC在西方世界是常发癌症并且是癌症相关死亡率的最常见原因之一。它是美国男性和女性两者中癌症相关死亡的最常见原因。它主要是一种老年疾病发病率随年龄增加，> 65岁时达到482/100，000人，并且峰值为75岁，达到约502/100，000人。65岁的人形成肺癌的风险为25岁的人的50倍，并且是45-64岁的人的3_4倍。男性中大约90%以及女性中大约80%的肺癌病例都归因于吸烟。肺癌的风险与总吸烟年数有关，吸烟将吸烟者暴露于致癌物和促进剂中。由于细胞DNA修复的年龄相关性下降，风险在老年人中也会增加。从初次接触吸烟到临床症状，肺癌可能有15-20年的自然史。大部分LC肿瘤可分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，NSCLC又再分为三种主要的组织学肿瘤类型，即鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。SCLC占所有肺癌病例的约20-25%。SCLC是攻击性的神经内分泌型LC并且具有很差的预后，即使在早期检测出。SCLC极少顺应通过切除的根治性治疗。由于该疾病发展的速度，SCLC通常仅使用两个时期(即局限和广泛性疾病)而不用更复杂的 !分期系统 (见下面)来分类。大约75-80%的LC病例归类入NSCLC类，包括鳞状细胞癌(癌=CA)、腺CA (包括腺泡CA、乳头状CA、支气管肺泡肿瘤、实体瘤和混合亚型的亚类)，和大细胞癌(包括巨细胞瘤、透明细胞CA、腺鳞CA和未分化CA的亚类)。NSCLC，如果在晚期检测出，具有非常差的预后。癌症的分期依据程度、进展、细胞类型和肿瘤等级对疾病分类。它将癌症患者分组，使得可以作出关于预后和治疗选择的概括。今天， Μ系统是基于癌症解剖学程度的最广泛使用的分类系统。它代表国际认可、统一的分期系统。存在三个基本变量τ (原发性肿瘤的程度)、N(局部淋巴结的状态) 和M(有或没有远端转移)。
Μ标准由UICC(国际抗癌联盟)公布(Sobin，L. H.和Fleming， I. D. ,TNM Classification of Malignant Tumors (恶性肿瘤的 TNM分类)，第五版(1997)， 第 1803-1804 页)。原发性肿瘤的手术切除已被广泛接受为选择用于早期NSCLC的治疗。随着NSCLC 的发展，更具体地从 IIIa 期(T3mM0、TlN2M0、T2N2M0、T3N2M0)向 IIIb 期(T4N0M0、T4mM0、 T4N2M0)转变，促使医师方法的明显转变。但是，如果在更早期(Ia-IIIa ；优选最早T3mM0 期)检测出癌症，5年生存率在35%-80%之间变化。Ia期((T1N0M0)；肿瘤尺寸小、无转移)的检测明显地具有最好的预后，五年生存率高达80%。手术极少，如果有的话，用在NSCLC的Inb-IV期的处理中。IV期对应于远端转移，即疾病扩散到肺和局部淋巴结以外。较晚的III和IV期的5年生存率分别降至小于15% 和之间。尤其重要的是，NSCLC的早期诊断转化成好得多的预后。早在Ia(TlNOMO)、 Ib (T2N0M0)、IIa(TlNlMO)、lib (T3N0M0)和 IIIa(T3NlM0)期诊断出的患者，如果处理恰当， 诊断后5年具有高达80%的生存机会。这应与当远端转移已经存在时确诊的患者小于
的5年生存率比较。越早诊断出LC，长期生存的机会越大。如上所述，病理学家将肺癌分类为4种主要的组织学类型，S卩，鳞状细胞癌、腺癌、 大细胞癌(总称=NSCLC)和小细胞癌。但是，相当重要的是要注意通常，这些类型中的两种或多种同时出现并且组织学分类极度依赖于所负责的病理学家的技能。急需可有助于对多种类型肺癌进行更具重现性分类的另外的方法。特别是指示 NSCLC肿瘤组别内的SCC的标志物，表示辅助这种诊断的重要工具。已出乎意料地发现，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13标志物代表了评估肺癌的极好的工具。通过使用丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13标志物，例如可能将鳞状细胞癌与肺癌的其它组织学类型(例如腺癌)区分。发明概述在一个实施方案中，本发明涉及一种用于体外评估肺鳞状细胞癌(SCC)的方法， 包括(a)测定测试样品中的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及(b)将步骤(a)的测定结果用于评估肺鳞状细胞癌，其中丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的阳性测定结果指示肺鳞状细胞癌。还描述了一种用于体外评估肺鳞状细胞癌的方法，包括(a)测定测试样品中的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13，(b)测定对照样品中的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及(c)在评估肺鳞状细胞癌中比较步骤(a)和(b)的测定结果，其中与对照样品中的水平相比，所述测试样品中丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B水平升高指示肺鳞状细胞癌。本发明还公开了一种用于在体外相对于其它非小细胞肺癌(NSCLC)鉴别诊断肺鳞状细胞癌的方法，包括(a)测定包含非小细胞肺癌细胞的测试样品中的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13，以及(b)利用步骤(a)的测定结果用于相对于其它NSCLC鉴别诊断鳞状细胞癌，其中丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的阳性测定结果指示肺鳞状细胞癌，而丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的阴性测定结果指示其它NSCLC。本发明还涉及丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13标志物在评估肺鳞状细胞癌以及将肺鳞状细胞癌与其它类型NSCLC(如肺腺癌)区分中的应用。发明详述在优选实施方案中，本发明涉及一种用于体外评估肺鳞状细胞癌的方法，包括 (a)测定测试样品中的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及(b)将步骤(a)的测定结果用于评估肺鳞状细胞癌，其中丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的阳性测定结果指示肺鳞状细胞癌。术语“测定”或“测量”涉及样品中丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的定性或定量测量。 在优选实施方案中，测量为定性或半定量测量，即确定丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13是存在还是不存在或者确定丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的浓度是高于还是低于截断值(cut-off value)。如本领域技术人员将理解的，在是(存在)或否(不存在)的测定中，通常设置测定灵敏度以匹配截断值。例如可从一组健康个体的测试中确定截断值。优选地，设置截断值以导致产生90%的特异性，还优选设置截断值以导致产生95%的特异性，或还优选设置截断值以导致产生98%的特异性。高于截断值的值的存在可例如指示肺鳞状细胞癌的存在。如果确定的值高于截断值，则将测定结果归类为阳性。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13蛋白(蛋白酶抑制剂13、HaCaT UV-阻遏型丝氨酸蛋白酶抑制蛋白、hurpin、headpin ；丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13 ；SWISS-PR0T检索号 Q9UIV8)是44. 3kDa的蛋白质并由391个氨基酸组成，由SEQ ID NO=I表征。由可变剪接产生的一种同工型(38.4kDa，339aa)在文献中报道(SEQ ID NO :2)。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白13属于广泛分布的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(丝氨酸蛋白酶抑制剂)的蛋白质超家族。通常，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白是利用构象变化来抑制靶标酶(主要为丝氨酸蛋白酶) 的蛋白酶抑制剂。具体而言，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13被报道分别抑制组织蛋白酶K 禾口 L(Welss，Τ.等，Biochemistry 42(2003)7381—7389 ；Jayakumar, Α.等，Arch. Biochem. Biophys. 409(2003)367-374)。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白13最初作为HaCaT细胞中的UV阻遏型基因被发现(Abts, H. F.等，J. Mol. Biol. 293 (1999) 29-39)。独立地，它被称为 “headpin” 并且相应的基因被其他作者绘图于染色体18q上(Spring，P.等，Biochem. Biophys. Res. Comm. 264(1999099-304)。在此研究中，RNA印迹分析和相关RT-PCR揭示，与正常鳞状上皮相比，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的mRNA表达在口腔鳞状细胞癌中被减量调节。基于RT-PCR分析的早期研究揭示，与未受影响的皮肤相比，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13在患银屑病患者受影响的皮肤中过量表达(Abts，H. F.等，J. Mol. Biol. 293 (199909-39)。在更近期的研究中，这些发现通过蛋白质印迹和IHC在蛋白水平上证实。在正常的皮肤中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13主要在基底层中表达(Moussali， H.等，Exp. Dermatol. 14(2005)420-428) 丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的分布和表达水平在银屑病皮肤中是不同的；已发现在颗粒层中表达最高。在相同的研究中，作者报道丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13在皮肤红斑狼疮和恶性肿瘤中过量表达。此外，这些作者用RT-PCR证实了他们的发现。在另一个研究中，分析了丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的表达与其靶标蛋白酶 Cat L 的关系(Bylaite, M.等，Exp. Dermatol. 15 (2006) 110-118)。作者再次显示，与正常组织相比，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的表达在皮肤恶性肿瘤中增加并重新分布；但是丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的表达与Cat L没有直接的关系。最近，ffalz,M.等人(Exp. Dermatol. 16(2007)715-723)产生了转基因小鼠，所述转基因小鼠除了表达内源性鼠丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以外还表达人丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13。这些转基因小鼠的特征在于化学致癌作用后腹部皮毛异常及皮肤癌易感性较高。这些发现暗示丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13在皮肤疾病发展中的重要作用。如对技术人员显而易见的，本发明不应解释为受限于SEQ ID NO 1的全长蛋白丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的生理学或人工片段、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的二次修饰以及丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的等位基因变体也被本发明包括。多肽的变体由相同的基因编码，但其等电点(=PI)或分子量(=MW)或两者可不同， 例如因选择性mRNA或前mRNA加工所致。变体的氨基酸序列与相应的标志物序列95%以上相同。人工片段优选包含合成或通过重组技术产生的肽，其至少包含一个诊断关注的表位，该表位由如从SEQ ID N0:1中公开的序列获得的至少6、7、8、9或10个连续氨基酸组成。 这种片段可有利地用于抗体的产生或作为免疫测定中的标准品。本文所用每个下面的术语都具有与其在该部分中有关的含义。冠词“一”和“一个”在本文中用于指一个或多于一个(即至少一个)冠词的语法宾语。举例来说，“标志物”意指一个标志物或多于一个标志物。术语“至少”用以表示任选地可存在一个或多个其它对象。表述“一个或多个”表示1-50个，优选1-20个，也优选2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或 15个。本文所用的术语“标志物”或“生化标志物”是指待用作用于分析患者测试样品的靶标的分子。在一个实施方案中，这种分子靶标的实例为蛋白质或多肽。在本发明中用作标志物的蛋白质或多肽考虑包括所述蛋白质天然存在的变体以及所述蛋白质或所述变体的片段，特别是，免疫学上可检测的片段。免疫学上可检测的片段优选包含所述标志物多肽的至少6、7、8、10、12、15或20个连续氨基酸。本领域技术人员将意识到，由细胞释放的或存在于细胞外基质中的蛋白质可被破坏，例如在炎症过程中，并可被降解或切割成这类片段。 某些标志物以非活性形式合成，随后可由蛋白酶解活化。如本领域技术人员将意识到，蛋白质或其片段也可作为复合体的部分存在。在本发明的意思内，这种复合体也可用作标志物。 另外或备选地，标志物多肽或其变体可带有翻译后修饰。优选的翻译后修饰为糖基化、酰化和/或磷酸化。优选通过利用特异性结合剂从样品中特异地测定标志物丝氨酸蛋白酶抑制蛋白 B13。特异性结合剂例如丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的受体，是结合丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的凝集素或丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的抗体。优选使用结合丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的两种同工型的特异性结合剂。特异性结合剂对其相应的靶标分子具有至少IO7I/ mol的亲和力。该特异性结合剂对其靶标分子优选具有IO8Vmol的亲和力或也优选IO9I/ mol的亲和力。如本领域技术人员将意识到，术语特异性用来表示存在于样品中的其它生物分子不显著地结合对丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13特异的结合剂。优选地，结合靶标分子以外的生物分子的水平导致结合亲和力，该结合亲和力最高分别为靶标分子亲和力的仅10% 以下、仅5%以下、仅2%以下或者仅以下。优选的特异性结合剂将同时符合上述关于亲和力和特异性的最低标准。特异性结合剂优选为与丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13反应的抗体。术语抗体是指多克隆抗体、单克隆抗体、这些抗体的抗原结合片段、单链抗体和包含抗体结合域的遗传构建体。可使用特异性结合剂的保留上述标准的任意抗体片段。抗体由现有技术方法产生，例如，如 Tijssen 所描述白勺方法(Tijssen，P.，Practice and theory of enzyme immunoassays(酶免疫测定的实践和原理)，11，Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam，整本书，尤其是第43-78页)。另外，技术人员熟知基于可用于抗体的特异性分离的免疫吸附剂的方法。通过这些方法，多克隆抗体的质量和从而其在免疫测定中的性能可得到提高(Ti jssen, P.，见上，第108-115页)。为获得如本发明所公开的成果，可使用在兔中产生的多克隆抗体。但是，同样清楚
6的是，也可使用来自不同物种(例如，大鼠或豚鼠)的多克隆抗体，以及单克隆抗体。由于可以以所需的任意量产生具有恒定性质的单克隆抗体，其代表了临床常规测定开发中的理想工具。针对丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的单克隆抗体的产生和使用以及其在本发明方法中的使用，分别代表了其它优选的实施方案。本文所用的术语“测试样品”是指用于体外评估目的而从个体获得的生物学样品。术语“评估肺鳞状细胞癌”用以表示，根据本发明的方法将(单独或与其它标志物或变量，例如由UICC给出的标准(见上面)一起)例如帮助医师建立或确定SCC的不存在或存在。如本领域技术人员将意识到的，在体外作出任何这种评估。然后丢弃患者样品。患者样品仅用于本发明的体外诊断方法，并且患者样品材料并不转移回患者体内。典型地，该样品为包含细胞的样品。免疫组织化学领域的技术人员将意识到，染料批次变化和某些环境条件例如相对湿度的差异性，可影响使用本发明方法在不同时间获得的结果。在本发明方法的某些实施方案中，试剂和批次间的差异性通过使用相同试剂对测试样品细胞和合适的对照样品细胞进行染色来控制。在优选实施方案中，本发明涉及一种体外评估SCC的方法，包括测定单个测试样品中的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及利用测定结果评估SCC。在一些情形中，除了从患者中获得测试样品外，提供对照样品也可能会有帮助。这类对照样品可为阴性对照样品、阳性对照样品或包含这些对照类型中的一种或多种的混合对照。阴性对照样品优选包含正常肺组织、多种亚型的肺癌如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺大细胞癌或其多种组合。阳性对照样品优选包含分类为肺鳞状细胞癌的组织。在优选实施方案中，本发明公开了一种用于体外评估肺鳞状细胞癌的方法，包括 (a)测定测试样品中的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13，(b)测定阴性对照样品中的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及(c)在评估肺鳞状细胞癌中，将步骤(a)和(b)的测定结果进行比较， 其中与阴性对照样品中的水平相比，所述测试样品中丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13水平升高指示肺鳞状细胞癌。如上面所指出，在某些情形中包含肺鳞状细胞癌的样品可用作阳性对照并且优选与待研究样品平行测定。在这种情形中，阳性对照样品中丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的阳性结果表明该测试程序在技术水平上起作用。在这些条件下测试样品对于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的阳性染色，测试样品指示潜在的恶性肿瘤为SCC。本发明的发明人令人意想不到地能够证明，标志物蛋白丝氨酸蛋白酶抑制蛋白 B13显示与肺鳞状细胞癌的强烈相关。考虑对不同类型肺癌(尤其是SCC)进行分类的不确定性，可能恰当的是，针对丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的染色可成为评估患有NSCLC的患者以及将其分类为SCC和其它“非SCC”肺癌的关键标准之一。用于评估特定临床(疾病)实体的理想情况会是以下情形，其中单一事件或过程将导致相应的疾病，如例如在大多数传染性疾病中。在所有其它情况中，正确的诊断可能非常困难，尤其是当疾病的病因学未被完全明白时，如LC的情形。如本领域技术人员将意识到，没有生化标志物对于既定多因素疾病例如对于LC的诊断有100%的特异性同时又具有 100%的灵敏度。但是，可将生化标志物例如CYFRA21-l、CEA、NSE、proGRP或本文所示的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13，用于以某种可能性或预测值评估例如疾病的存在、不存在或严重性。因此在常规临床诊断中，在评估潜在疾病时通常一起考虑各种临床症状和生物学标志物。有经验的病理学家可容易地将肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌两种主要种类。但是，难以进一步细分肿瘤亚型，尤其是对最初发现患有NSCLC的患者。如上所述， NSCLC被理解为包含三种主要的疾病亚群鳞状细胞癌、腺CA和大细胞癌。本发明公开了一种有助于将鳞状细胞癌与所有其它类型的NSCLC(即非SCC的NSCLC)区分的诊断方法。在另一个实施方案中，本发明公开了一种用于在体外相对于其它类型的NSCLC对鳞状细胞癌进行鉴别诊断的方法，包括(a)测定包含非小细胞肺癌细胞的测试样品中的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及(b)利用步骤(a)的测定结果用于相对于其它NSCLC对鳞状细胞癌进行鉴别诊断，其中丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的阳性测定结果指示肺鳞状细胞癌而丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的阴性测定结果则指示其它类型的NSCLC。在本发明方法中，测试样品或患者样品优选为包含细胞的样品，例如组织样品。优选地，测试样品为如通过活组织检查或手术获得的组织块。同样优选的是，这种测试样品为组织切片。备选地，细胞可通过进行支气管肺泡灌洗从肺中获得，它们可通过适于收集上皮衬液(包含细胞)的设备抽出，或可从唾液中获得细胞。在优选实施方案中，本发明和本文公开的各种方法因而涉及包含细胞的测试样品，所述细胞从支气管肺泡灌洗或上皮衬液中获得。包含细胞的测试样品可经历多种分析途径。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13将在原位即在测试样品的细胞或组织内进行测定；在另一个优选实施方案中，可溶解测试样品的细胞并在细胞或组织裂解液中测定丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13。对于原位测定丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13，优选将包含待研究细胞的测试样品装在显微镜载玻片上。在一个实施方案中，这种样品可为不用甲醛固定和没有包埋(例如没有包埋在石蜡中)的样品，例如技术人员已知分别为新鲜的组织样品或新鲜的冰冻组织样品的样品。但是，在临床常规中，优选包含细胞的样品接受标准化的固定和/或包埋程序。在优选方式中，本发明的方法基于已用福尔马林固定和石蜡包埋的测试样品来实施。对技术人员来说显而易见的是，先前已固定和包埋的样品必须经过预处理以至少除去包埋材料。 如果进一步需要，在免疫组织化学领域，多种方法处于可用于重新获得例如免疫可检测表位的情况(stake)。这类方法被技术人员统称为抗原恢复的方法。如果必须研究可能包含或怀疑包含肺赘生性细胞的测试样品，则无疑应使用本发明的方法。在优选实施方案中，本发明用被怀疑含有赘生性细胞的测试样品来实施。每当要原位(在细胞表面或内部、在组织切片中等等)测定丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13时，这样的测定中使用的方法将优选为任何合适的免疫组织化学方法。在优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13通过免疫染色方法进行测定。癌症诊断，在治疗之前、期间或之后的疾病的最初诊断和病程的后续监测两者，传统上通过对从患者中移除的细胞或组织样品的组织学检查来确定。临床病理学家需要能够准确地测定这类样品是良性还是恶性，以及对被视为恶性的肿瘤样品的攻击性进行分类，因为这些测定常形成选择合适的患者治疗过程的基础。类似地，病理学家需要能够检测癌症已经生长程度，或尤其由于治疗(最特别地用用化疗剂或生物制剂的治疗)所致进入缓解的程度。组织学检查传统上需要组织染色程序，该程序使得样品的形态学特征在光学显微镜下容易观察。在检查染色样品后，病理学家通常作出肿瘤样品是否为恶性的定性决定。但是，仅通过样品的组织学检查难以确定肿瘤的攻击性，因为肿瘤的攻击性常为肿瘤内细胞的生物化学结果，例如蛋白质的表达或阻抑以及蛋白质活化，其可能会或不会受到样品的形态学影响。因此，能够评估肿瘤样品内细胞的生物化学是重要的。另外，期望能够对肿瘤相关基因或蛋白两者分别进行观察和定量。在本发明方法的实施中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13可用自身可检测地标记的特异性试剂(最优选抗体)进行检测，或利用未标记的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13特异性抗体和可检测地标记并识别丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13特异性抗体的第二抗体来进行检测。 通常在显微镜下由有经验的病理学家评估染色的细胞或组织样品。在本发明方法的优选实施方案中，使用双组分免疫组织化学染色系统来区别地染色丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13和组织或细胞样品，使得染色的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13 可以更容易地与复染的组织或细胞样品区分。免疫组织化学染色后，优选由计算机辅助图像分析系统生成的组织或细胞样品的光学图像，接着在光学显微镜下放大并分成图像对。 分开的图像用一对光学过滤器增强，一个过滤器具有与着色剂相应的最大吸收而另一个过滤器具有与复染剂相应的最大吸收，从而在两种着色剂之间提供最佳的区别。本领域已知的自动(计算机辅助)图像分析系统可增强样品的目视检查。在典型的系统中，将细胞或组织样品暴露于对特定生物学标志物特异的可检测地标记的试剂中，然后细胞的放大图像由计算机进行处理，该计算机自电荷耦合器件(CCD)或照相机(例如电视摄象机)接收图像。这种系统可用来检测和测定样品中的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的水平。这种方法论提供了更准确的癌症诊断和更佳地表征在组织学鉴定的癌细胞中的基因表达。组织样品的定量免疫组织化学图像分析的示例性程序的描述可大体上参见WO 01/519 和WO 01/51928，两者均通过引用以其整体结合到本文中。举例来说，定量图像分析可在从 Becton Dickinson Company, Mountain View, Calif■购买的 Cell Analysis Systems Model 200 (细胞分析系统模型200)上进行。如本发明所包括的，定量图像分析可在来自其它厂商的系统上进行，例如但不限于ChromaVision Medical Systems (Chroma Vision 医学系统)(San Juan Capistrano, Calif.)。在某些实施方案中，本发明方法利用如下的图像分析系统来实施。在如上所述的免疫组织化学染色后，可通过数字化染色样品的显微图像，以及将数字化图像的每个图像元素(像素)的光强度值转化为对应染色细胞组分(例如核)百分比的光密度值，来定量测定表达细胞的百分比。更具体地，使用数字灰度图像，计算机化的图像分析可用以确定具有特定染色的细胞量。灰度图像代表了光增强因子(例如色原)的量，光学增强因子结合正在研究的特定靶标，从而使靶标可光学放大和显像。在第一步中，细胞中任何表达的靶标蛋白如下鉴定通过加入对靶标蛋白特异的可检测地标记的第一抗体，或备选地未标记的第一抗体和对第一抗体特异的可检测地标记的第二抗体。抗体与样品温育一段时间以形成复合体，如果这些抗原存在的话。接着通过直接检测标记，或者如果可检测标记为酶，则将该部分与化合物例如色原在合适条件下进行温育，来使复合物可见。例如，第一抗体可用过氧化物酶标记，随后使用色原DAB。在第二步中，将组织用另一光学增强因子复染，例如但不限于乙绿。尽管使用过氧化物酶和乙绿的染色技术堪称模范，但是其它着色剂和光学增强因子也是合适的。例如，其它色原可与过氧化物酶使用，包括但不限于3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)，其产生红色和4-氯-1萘酚。另外，可用于标记第一抗体的其它酶由本发明包括，包括但不限于碱性磷酸酶。可与碱性磷酸酶使用的色原的实例，包括但不限于固红、固绿和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐/氮蓝四唑 (BCIP/NBT)。此外，荧光染料的使用由本发明方法所包括。荧光染料的非限制性实例为荧光素(异硫氰酸荧光素或FITC)和罗丹明。此外，乙绿的使用是复染剂的模范，但其它复染剂可用在本发明方法中。例如，另外的复染剂的非限制性名单包括苏木精、固红、甲基绿。基于可获得的光谱分离选择复染剂用于特定的染色，使得在两个独立的波长处可获得过滤。例如，乙绿提供与DAB沉淀物良好的光谱分离，如下面更详细的描述。提供良好色谱分离的着色剂/复染剂对的其它实例包括但不限于固红和苏木精、AEC和苏木精以及FITC和德克萨斯红(Texas Red)。本领域技术人员认可的是，此着色剂和复染剂名单仅为示范性的，因此不起限制本发明的作用。如上所述，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13也可从测试样品中测定，其中细胞已溶解或以其它方式处理以释放丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13。在优选实施方案中，测试样品经处理以释放丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13，并通过免疫测定程序测定丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13。 丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13可在溶解的样品中测定的优选免疫测定方法为酶联免疫吸附测定(ELISA)、基于化学发光的免疫测定(例如来自Roche的Elecsys )或蛋白质印迹。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13标志物在评估肺鳞状细胞癌中的应用代表了本发明的另一个优选实施方案。也优选的是，在来自先前被分类为患有非小细胞肺癌的患者的组织样品中，使用丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13标志物将肺鳞状细胞癌与其它类型肺非小细胞癌区分开患者。提供以下实施例、序列表和图来帮助理解本发明，其真实范围在所附权利要求中给出。应理解，可对给出的方法作出修改而不背离本发明的精神。序列表的描述SEQ ID NO 1 显示了丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13蛋白的氨基酸序列3kDa ； 391 个氨基酸；SWISS-PR0T 检索号Q9UIV8)。SEQ ID NO 2显示了由可变剪接产生的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13蛋白同工型的氨基酸序列(38. 4kDa, 339个氨基酸)。SEQ ID NO 3 正向引物LC5for_EcoRI (用于EcoRI克隆位点、核糖体结合位点和 N-末端肽突出端(其示于SEQ ID NO :5中)的特征)。SEQ ID NO 4 反向引物 LC5rev-HindIII。SEQ ID NO 5 N-末端肽突出端。
图1分别显示了 10名SCC患者和10名腺Ca患者的蛋白质印迹的结果(对丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13进行免疫染色)。明显地，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的信号强度在全部10名分类为SCC的患者的肿瘤组织裂解液中增加，而在腺Ca中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13蛋白仅在1名患者中可检测到或根本不存在。图2将来自分类为患有SCC的肺癌患者的组织切片与从分类为患有肺腺Ca的肺癌患者中得到的组织切片进行比较。所示分别为3名不同的SCC患者(面板A)和3名不同腺Ca患者(面板B)的组织切片结果。强烈的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13特异性染色在所有SCC样品中观察到，而在腺Ca切片中没有可见的染色。正常肺组织(例如SCC中的肿瘤组织附近)是丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13阴性的。实施例1针对丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的抗体的产生产生丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的多克隆抗体，用于在免疫检测测定例如蛋白质印迹法和IHC中，进一步使用抗体。a)大肠杆菌中重组蛋白的表达为了产生针对丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的抗体，在大肠杆菌中产生重组抗原。因此，利用正向引物LC5for-EcoRI和反向引物LC5rev-HindIII，从获得自German Resource Center for Genome Research (德国基因组研究资源中心)(RZPD，Berlin, Germany)的全长cDNA克隆DKFZp686E1318Q2中PCR扩增丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13编码区从，所述 LC5for-EcoRI 为 5，ATGCGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGAGGATCGCATCACCA TCACCATCACATTGAAGGCCGTGATTCACTTGGCGCCGTCAGCACTC(SEQ ID NO 3) (EcoRI-位点和起始密码子加下划线)，所述 LC5rev-HindIII 为 5，GCATAAGCTTTCATTAAGGAGAAGAAAATCTGCCGAAG AAG (SEQ ID NO 4) (HindIII 位点加下划线)。将编码N-末端MRGSHHHHHHIEGR(SEQ ID NO 5)肽突出端的正向引物特征(除了 EcoRI克隆位点和核糖体结合位点)寡核苷酸，符合读框地引入丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13 多肽。将 EcoRI/Hindlll 消化的 PCR 片段连接到相应 pQE-30 (Qiagen，Hilden，Germany)载体片段内，所述载体片段随后转化到大肠杆菌XLl-blue感受态细胞中。分析序列后，按照制造商的说明书，将质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，用于在pQE载体系列的IPTG 诱导型T5启动子下表达。为纯化MRGSHHHHHHIEGR-丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13融合蛋白，将11诱导过夜的细菌培养物通过离心沉淀，将细胞沉淀通过重悬于PH 8. 0的IOOmM磷酸钠缓冲液、7M盐酸胍、5mM咪唑、20mM硫代甘油中裂解。通过离心沉淀不溶物质并将上清液加入镍-氨基三乙酸(Ni-NTA)金属亲和层析中用数个柱床体积的裂解缓冲液洗涤柱，然后用以下溶液冲洗a) IOOmM磷酸钠缓冲液，pH 8. 0, IOmM Tris-HCl,pH 8. 0，8M脲，20mM硫代甘油；b) IOOmM 磷酸盐缓冲液，PH 8. 0,0. 5%十二烷基硫酸钠(SDS)，20mM硫代甘油；和c) IOOmM磷酸钠缓冲液，pH 8.0,0. SDS，20mM硫代甘油。最后，用IOOmM磷酸钠缓冲液，pH 5.0,0. 1% SDS, 20mM硫代甘油在酸性条件洗脱结合的抗原，并贮存于4°C相同缓冲液中。b)多克隆抗体的产生免疫制备蛋白质溶液(100μ g/ml丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13蛋白)和完全弗氏助剂按1 1的比例的新鲜乳液，用于免疫。每只兔用Iml乳液在1、7、14和30、60、90天进行免疫。抽血，得到的抗丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13血清用于如实施例2和3所描述的进一
11步试验。实施例2利用实施例1中描述的多克隆抗体在人肺癌组织中检测丝氨酸蛋白酶抑制蛋白 B13的蛋白印迹组织制备将0.8-1. 2g冰冻组织切成小块，转移到混合器球磨机的冷冻研磨罐中并用液氮完全冷冻。组织在球磨机中被粉碎，溶于10倍体积(w/v)的裂解缓冲液(40mM柠檬酸钠， 5mM MgCl2,1% Genapol X-080，0. 02%叠氮化钠，无EDTA 的 Complete [Roche Diagnostics GmbH,Mannheim, Germany,目录号1873580])中，接着在Wheaton 玻璃勻菜机中勻菜(20 X 松散配合，20X紧密配合)。将勻浆进行离心(5000X g，10分钟)，上清液转移到另一小瓶中并再次离心O0000Xg，15分钟)。所得上清液包含可溶蛋白并用于进一步分析。SDS-PAGE和蛋白质印迹法利用hvitrogen，Karlsruhe, Germany的试剂和仪器进行。对每一个经测试的组织样品，用还原性NuPAGE anvitrogerOSDS样品缓冲液稀释15 μ g组织裂解液，并在95°C加热lOmin。在4-12%的NuPAGE 疑胶(Tris-甘氨酸) 上在MES运行缓冲系统中跑样。凝胶分离的蛋白混合物用^witrogen XCell II Blot Module(Invitrogen)和NuPAGE 转移缓冲系统点到硝酸纤维素膜上。膜在PBS/0. 05% Tween-20 中洗 3 次并用 Roti _Block 封闭缓冲液(A151. 1 ；Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany)封闭池。第一抗体多克隆兔抗丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13血清(产生在实施例2 中描述)，以1 30，000用Roti -BloCk封闭缓冲液稀释并与膜温育lh。膜在PBS/0. 05% Tween-20中洗6次。特异性结合的第一兔抗体用POD-缀合的多克隆绵羊抗兔IgG抗体标记，用0. 5XRoti -BloCk封闭缓冲液稀释至10mU/ml。温育Ih后，膜在PBS/0. 05 % Tween-20中洗6次。为检测结合的POD-缀合的抗兔抗体，将膜与Lumi-Lightpuis蛋白质印迹底物(定购号 2015196，Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)温育并暴露于放射自显影膜。10名SCC患者和10名腺Ca患者分别用WB进行分析(图1)。显然，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的信号强度在所有10名患者的肿瘤组织裂解物中增加，而在腺Ca中丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的表达仅在1名患者中可检测到。因此，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13 在肿瘤组织中的SCC特异性过量表达由蛋白质印迹分析明确地显示。实施例3利用实施例1描述的多克隆抗体检测人肺癌组织中的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13 的免疫组织化学(IHC)分析将石蜡包埋的组织切成2μπι的系列切片，在二甲苯中去除石蜡(3X5min)并通过一系列梯度乙醇再水化，然后用去离子水和PBS进行两个冲洗步骤(lXanin)。抗原恢复用 Retrivit pH4. O (Innogenex)在 97 °C-100 °C 进行 20min。将切片冷却 20min 并用 PBS (2 X Imin)漂洗。通过含3 % H2O2的PBS中中温育5min阻断内源性过氧化物酶的活性，然后将切片用PBS漂洗2次，接着用TBS+Tween 20 (LabVision 1666789)漂洗1次达 3min。室温下用含马血清的PBS(Horse-Blocking Serum,Vectastain ABC试剂盒，Elite Universal,Vector PK6200)阻断免疫球蛋白的非特异性结合20min。按照制造商的说明书， 用生物素阻断系统(Dako X0590)阻断内源性生物素。为了对丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13特异性染色，将切片与0.5 μ g/ml用抗体稀释剂(Dako S2022)稀释的多克隆抗体在4°C下温育过夜。载玻片用TBS+Tween 20(LabVision 1666789)冲洗(3X ^iiin)，接着与生物素化的第二抗体(1 滴于 5ml PBS+1%马血清中)(Vectastain ABC 试剂盒，Elite Universal, Vector PK6200)在室温下温育30min。用TBS+Tween 20冲洗(3Χ^ η)后，将切片与ABC 试剂(1滴试剂A加1滴试剂B于5ml PBS中)在室温下温育30min。载玻片用TBS+Tween 20(2X2min)冲洗，最后与二氨基联苯胺色原溶液(DAB plus, Dako K3467)反应5min，在用蒸馏水漂洗后，将其用苏木精复染并固定。兔IgG片段(Dako X0903)用作阴性对照。
将来自SCC的组织切片与从腺Ca获得的组织切片进行比较。示例性地，图2分别显示了来自3名不同SCC患者(面板A)和来自3名腺Ca患者(面板B)的切片的结果。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13特异性染色在所有SCC样品中观察到，而在腺Ca切片中则没有染色。因而，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13在SCC肿瘤组织中的特异性表达由IHC分析明确地证实。
权利要求
1.一种用于体外评估肺鳞状细胞癌的方法，包括a)测定测试样品中的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及b)将步骤(a)的测定结果用于评估肺鳞状细胞癌，其中丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的阳性测定结果指示肺鳞状细胞癌。
2.一种用于体外评估肺鳞状细胞癌的方法，包括a)测定测试样品中的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13，b)测定对照样品中的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及c)在评估肺鳞状细胞癌中，比较步骤(a)和(b)的测定结果，其中与所述对照样品中的水平相比，所述测试样品中的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B的水平升高指示肺鳞状细胞癌。
3.一种用于在体外相对于其它非小细胞肺癌(NSCLC)鉴别诊断肺鳞状细胞癌的方法，包括a)测定包含非小细胞肺癌细胞的测试样品中的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及b)将步骤(a)的测定结果用于相对于其它NSCLC鉴别诊断鳞状细胞癌，其中丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的阳性测定结果指示肺鳞状细胞癌，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的阴性测定结果指示其它NSCLC。
4.权利要求1-3之一的方法，其中所述测试样品为通过活组织检查获得的组织块。
5.权利要求4的方法，其中所述测试样品为组织切片。
6.权利要求1-3之一的方法，其中所述测试样品为支气管肺泡灌洗或细胞外衬液。
7.权利要求4-6中任一项的方法，其中所述测试样品固定在显微镜载玻片上。
8.权利要求7的方法，其中所述测试样品已用福尔马林固定和石蜡包埋。
9.权利要求1、3-8中任一项的方法，其中所述测试样品怀疑或已知含有赘生性细胞。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13通过免疫染色方法测定。
11.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述测试样品经处理以释放出丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13并且丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13通过免疫测定方法测定。
12.权利要求11的方法，其中所述免疫测定方法选自ELISA或蛋白质印迹。
13.丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13标志物在评估肺鳞状细胞癌中的用途。
14.丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13标志物的用途，用于在来自患者的组织样品中将肺鳞状细胞癌与肺腺癌区分，所述患者先前已被分类为患有非小细胞肺癌。
全文摘要
本发明涉及一种辅助评价鳞状细胞癌(＝SCC)的方法。其公开了蛋白质丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13作为SCC标志物的应用。另外，其涉及一种用于评估从患有非小细胞肺癌(＝NSCLC)患者中获得的组织样品中的肺癌的方法以及用于将SCC与肺腺癌或大细胞癌区分的方法。
文档编号G01N33/574GK102341709SQ201080010654
公开日2012年2月1日 申请日期2010年3月2日 优先权日2009年3月4日
发明者L·曼托瓦尼-恩德尔, M·塔克, M·罗斯勒 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司