丝氨酸蛋白酶衍生物及其在凝血功能障碍的预防或治疗中的用途的制作方法

专利名称：丝氨酸蛋白酶衍生物及其在凝血功能障碍的预防或治疗中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及因子X的激活肽及其在提高丝氨酸蛋白酶衍生物(特别是蛋白C、因子 IX和因子X衍生物)的半衰期和回收率中的用途，以及这些衍生物在蛋白C、因子IX和因子X相关病症(特别是凝血功能障碍)的预防或治疗中的用途。
背景技术：
凝血是在响应血管损伤而发生的主要和复杂的过程。它包括形成凝块以停止出血和开始修复受损血管其壁由含有血小板和血纤维蛋白的凝块覆盖。该过程几乎在损伤后立即开始。凝血过程包括两种类型的组分称为血小板的细胞组分和称为凝血因子的蛋白组分。血小板立即在损伤部位形成栓塞；这称为初级止血。同时发生次级止血称为凝血因子或凝固因子的血浆蛋白作出复杂级联响应，以形成强化血小板栓塞的血纤维蛋白丝。次级止血的凝血级联被分成两种途径，称为内源性途径或接触激活途径，和外源性途径，也称为组织因子途径。许多凝血因子以及辅因子和调节因子参与其中以恰当地维持该过程。例如，蛋白C是用于调节凝血的主要机制(称为“抗凝血剂途径”)的关键因子。 蛋白C的活性形式(激活的蛋白C)是丝氨酸蛋白酶，其在与另一种辅因子(蛋白幻结合时降解对凝血酶的大量产生必要的凝血级联的两种因子因子Va和Villa。这些因子的破坏负向调节所形成的凝血酶的量，导致抗凝血效应。特别是已知这种蛋白具有多效生物活性不仅具有抗血栓形成活性(Taylor等人，1987 ；Gruber等人，1990 ；Chesebro等人， 1992 ；Hanson 等人，1993 ；Arnl jots 等人，1994 ；Sakamoto 等人，1994，Jang 等人，1995，Kurz 等人，1997 ；Gresele 等人，1998 ；Mizutani 等人，2000 ；Bernard 等人，2001)，还具有抗炎活性(EmSOn，2000)、抗细胞凋亡活性(Joyce等人，2001)和促溶血纤活性(Comp等人，1981 ； Rezaie,2001)。因子IX(以下称为FIX)是凝血的一个关键丝氨酸蛋白酶。这种蛋白的缺失引起出血病症，称为B型血友病。在凝血期间，激活的FIX(FIXa)与其激活辅因子，因子VIIIa(以下称为FVIIIa)，结合，将其特定底物因子X(FX，以下称为FX)转换为其激活的衍生物，激活的因子X(以下称为FXa)。因子X是凝血级联的另一个关键因子。FX的激活形式(FXa)是能够在与其辅因子 (凝血因子Va)结合时将凝血酶原活化成凝血酶的唯一的丝氨酸蛋白酶。此外，长期被认为是被动旁观者的因子X目前表现为经由其两种主要受体(蛋白酶激活受体-I(PAR-I)和 PAR-2)的激活作用于各种各样细胞类型的直接参与者。最近的发现提示，PAR-2在纤维-增殖性疾病(例如纤维化、组织重建和癌症)中起着重要作用，并指因子X为协调凝血和疾病进展之间的分界的重要介质(Borensztajn等人，2008)。蛋白C、因子IX和因子X分别是肝脏中合成的62kDa、55kDa和59kDa的糖蛋白。在其分泌进入血浆前，其多肽链经过几次翻译后熟化以变成功能性酶原。两种酶原蛋白C和因子X由肽链裂解得到的氨基端轻链和羧基端重链组成，其中轻链和重链由二硫桥连接。酶原因子IX是单链糖蛋白。如同大多数丝氨酸蛋白酶前体一样，蛋白C、因子IX和因子X是缺乏催化活性的酶原。其激活是其重链中蛋白酶促裂解的结果。在蛋白C中，这种裂解发生在重链的N末端， 从而释放12个氨基酸的“激活”肽。在因子X中，这种裂解发生在酶原的Arg 193和Ile 194残基之间，从而也释放52个氨基酸的“激活”肽。在因子IX中，发生两个裂解，也从前体分子的内部区域释放分子量近似等于IlkDa的激活肽。血液凝因必须很好地控制以避免出血或凝血的任何危险。因此，凝血过程的失调导致严重的病症，例如出血(增加的出血危险)和血栓症(增加的凝血危险)。因增加的凝血危险导致的病理包括严重的病症，例如静脉或动脉血栓形成，特别是影响大口径血管的血栓形成、心肌梗死、血栓形成性疾病、肺栓塞、血管成形术或溶栓治疗后的冠状动脉再梗塞，以及患有影响蛋白C基因或凝血调节蛋白基因的遗传异常的患者的凝血异常。给予病人抗凝血剂以终止血栓形成(凝血不适当地存在于血管中)。这用于易感者中深静脉血栓形成、肺栓塞、心肌梗死和中风的初级和次级预防。出血是在血栓栓塞(thromoboembolic) 并发症的预防和治疗中口服使用抗凝剂的最严重的并发症。用华法令或肝素抗凝血的个体如果出血或需要手术时通常分别用特定的解毒药例如维生素K或鱼精蛋白治疗。不幸的是，华法令、肝素、维生素K和鱼精蛋白的治疗活性伴随不良的副作用，这使其使用复杂化。 相反，还没有用于逆转低分子量肝素(LMWH)或靶向因子fe(fXa)的新型口服抗凝血剂的抗凝血效应的特异性的和有效的解毒剂(参考综述，Harenberg, 2008, Bauer, 2008, Khoo等人，2009)。当使用这些新的抗凝疗法时，可能观察到大出血。因此，及时采取适当的机械的和系统的行动以控制出血是必要的。这包括停止抗凝血治疗以及，如有可能，使用可得到的特定逆转剂逆转抗凝血效应。目前需要针对这些抗凝血剂的特异性解毒药。另一方面，出血型的病理学特别地包括A或B型血友病(分别缺乏因子VIII和 IX)。这些严重疾病常常由于用于治疗的中和抗因子VIII或IX的同种抗体的“抑制剂”的存在而复杂化。目前有着改善这些病症的治疗的需要。第一种治疗策略是绕过凝血级联和调节的缺陷步骤。用于改善目前治疗的另一种策略是改善所使用化合物(主要是在血浆中易被中和的蛋白质)的半衰期。用于改善治疗的另一种途径是重建自动放大系统或逆控制。用于高凝性病症(例如蛋白C缺失)的治疗是蛋白C、激活的蛋白C、蛋白C衍生物……。目前用于血友病的治疗是对于A和B型血友病分别施用因子VIII或IX。这些治疗是昂贵的，特别是因为由于化合物的短半衰期而需要反复注射，而且这些治疗具有局限性，如抑制剂或中和抗通常用于治疗A和B型血友病的因子VIII或IX的同种抗体的的开发。此外，已观察到施用重组蛋白质(特别是因子IX)来治疗B型血友病， 由于较之施用血浆来源的产物具有更低的回收率而受到阻碍。已经提出潜在方法作为新的治疗策略。特别是，WO 03035861专利申请描述了蛋白C和因子X的凝血酶可酶解的嵌合衍生物。然而，这些化合物的短的半衰期限制了其在凝血功能障碍中的使用。本发明提出一种新的方法解决该技术问题。发明简述本发明涉及多肽PP，其包含SEQ ID NO 2的33到52位的氨基酸序列(因子X的激活肽)，其中39或49位的天冬酰胺是N-糖基化的。本发明也涉及所述多肽用于提高循环蛋白例如丝氨酸蛋白酶酶原，如因子IX、因子X、蛋白C，的半衰期和回收率的用途。本发明也涉及融合蛋白FP，其含有-第一多肽PP和-第二多肽，其包含SEQID NO 4的7到16位的氨基酸序列。本发明涉及因子X或蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中所述蛋白质的天然激活肽被融合蛋白FP取代。本发明涉及因子X或蛋白C的凝血酶可裂解衍生物，其中所述蛋白质的天然激活肽被融合蛋白FP取代。本发明还涉及因子X或蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其含有激活因子X 或蛋白C或其功能保守的变体和融合蛋白FP。本发明涉及编码本发明嵌合的凝血酶可裂解衍生物的核酸分子。本发明涉及本发明因子X的嵌合衍生物用于预防或治疗出血型的凝血病症的用途。本发明涉及本发明因子X的嵌合衍生物用于预防或治疗由低分子量肝素(LMWH) 或由靶向因子fe(fXa)的抗凝血剂引起的出血的方法。本发明也涉及本发明蛋白C的嵌合衍生物用于预防或治疗涉及高凝性的病症的用途。本发明涉及用于预防或治疗凝血障碍的包含本发明嵌合衍生物的药物组合物。发明详述通过对因子X的不同构造的研究，本发明人证明因子X的激活肽在因子X的清除过程及其回收中起着基本的作用。更具体地，他们观察到，这一激活肽的羧基末端的十九个氨基酸在因子X的清除动力学中有着主要作用。该十九个残基的序列包含对观察到的机制重要的两个N-糖基化位点。^X“功能保守的变体”是其中蛋白或酶中给定的氨基酸残基发生变化但不改变多肽的整体构象和功能的那些变体，包括但不限于，用具有类似性质(例如，极性、氢键键合潜力、酸性、碱性、疏水性、芳香性等)的氨基酸取代。除了显示为保守的那些氨基酸以外的氨基酸在蛋白质中可以不同，以便具有相似功能的任何两个蛋白之间的蛋白质或氨基酸序列的百分相似性可以改变，且可以是例如根据比对方案(例如通过群集法(Cluster Method))确定的70%到99%，其中相似性是基于MEGALIGN算法。“功能保守的变体”也包括由BLAST或FASTA算法确定的具有至少60%、优选至少75%、最优选至少85%、进一步优选至少90%的氨基酸同一性的多肽，且其与进行比较的天然或母蛋白(parent protein) 具有相同或基本上相似的性质或功能。
两个氨基酸序列超过80 %、优选超过85 %、优选超过90 %的氨基酸相同，或超过约90%，优选超过95%的氨基酸相似(功能上相同)时是“基本上同源”或“基本上相似” 的。优选地，相似或同源的序列通过例如使用GCG(Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin)堆禾只禾呈序(piIeup program)的比对或任何序列比较算法例如BLAST、FASTA等来鉴别。根据本发明，术语“融合蛋白”或“嵌合蛋白”指的是通过连接两个或更多个基因或其片段(其原来编码分离的多肽)而生成的蛋白质。这种融合基因的翻译导致具有源自各原始多肽的功能性质的单个多肽。重组融合蛋白通过用于生物研究或治疗的重组DNA技术人工生成。重组融合蛋白是通过融合基因的基因工程生成的蛋白质。这通常包括去除编码第一蛋白的cDNA序列中的终止密码子，然后通过连接或重叠延伸PCR同框(in frame)附加第二蛋白的cDNA序列。然后该DNA序列由细胞表达为单个蛋白。该蛋白可以工程化以包括两个原始蛋白的全部序列，或仅任一个原始蛋白的一部分序列。术语“回收率”意指抗原或注射分子的活性水平相对于计算得到的理论或预期的抗原或活性的百分比。“循环蛋白”意指由身体器官细胞合成并在血流中输送的蛋白。循环蛋白的例子是凝血因子、蛋白激素。凝血因子通常是丝氨酸蛋白酶。也有一些例外。例如，因子VIII和因子V是糖蛋白，因子XIII是转谷氨酰胺酶。蛋白激素是分泌到血流中并在活动物体中具有内分泌功能的一类蛋白质。术语“丝氨酸蛋白酶酶原”具有本领域的一般含义并指丝氨酸蛋白酶的无活性前体，其需要裂解以使其变成活性酶。根据本发明，目标丝氨酸蛋白酶限于属于循环蛋白的那些。丝氨酸蛋白酶包括其中活性部位的氨基酸之一是丝氨酸的几种蛋白酶。根据本发明，目标丝氨酸蛋白酶可以是但不限于因子IX、因子X或蛋白C，且特别是因子X和蛋白C。根据本发明，术语“丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物”是通过将丝氨酸蛋白酶酶原或其片段与目标多肽连接而获得的融合蛋白。所得到的蛋白显示出所述丝氨酸蛋白酶的功能性质。特别地，术语“丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物”是通过激活的丝氨酸蛋白酶或其片段与目标多肽的融合而获得的融合蛋白。根据本发明，丝氨酸蛋白酶酶原的所述嵌合衍生物与天然丝氨酸蛋白酶酶原不同，但至少显示等同的活性。术语“因子X”具有本领域的一般含义并指参与凝血机制的分泌的丝氨酸蛋白酶。 因子X可以来自于任何来源，但通常是哺乳动物(例如，人和非人灵长类动物)因子X，更特别是人因子X。通常，人因子X的氨基酸序列由SEQ ID N0:1(图1)提供。存在不同的编号系统以定位因子X的氨基酸残基-参照由因子X的cDNA推导的序列的编号系统。-参照由分泌的蛋白质推导的序列的编号系统，分泌的蛋白包含轻链、激活肽和重链编号为1的氨基酸残基是轻链的氨基末端的第一氨基酸残基。使用了该编号系统。上游的氨基酸位置用负数标识原肽(pro-p印tide)的C末端氨基酸编号为-1，且翻译的蛋白的N末端氨基酸残基(其是前肽(pre-p印tide)的氨基末端氨基酸残基)编号为_40。如图1所示，因子X的序列分成五个不同的区域，其根据所使用的编号系统对应于-40到- 位之间的前肽(或信号肽)，—27到-1位之间的原肽，-1到142位之间的轻链，-143到194位之间的激活肽，-195到448位之间的重链。术语“因子X”或“FX”或“成熟FX”或“酶原FX”意指在由产生的肝细胞分泌后， 因子X的血液循环形式。信号肽由信号肽酶切除，原肽序列在成熟N-末端链的N-末端的前 11个谷氨酸残基发生Y羧化作用后切除。进一步的加工步骤通过在根据所使用编号系统的Argl42和krl43(图1，SEQ ID NO 1的182-183位)之间的裂解进行。这一加工步骤也伴随着导致三肽Argl40-Lysl41-Argl42(SEQ ID NO 1的180-182位)的缺失。所获得的分泌因子X酶原由139个氨基酸的N-端轻链和306个氨基酸的C-端重链组成，轻链和重链经由Cysl32和Cys302之间的二硫桥共价连接。进一步的翻译后加工步骤包括Asp63 的β -羟基化作用以及N-和0-型糖基化。术语“激活的因子X”或“FXa”意指在需要凝血活性(例如凝血酶产生)的情况中产生的循环因子X的酶学活性形式。在能够激活因子X的生理条件下，从krl43到Argl94 的52个氨基酸的所谓激活肽通过在Argl94处切割重链的羧基端而与分子的其余部分分开 (图 1)。根据本发明，术语“因子X”和“激活的因子X”包括天然存在的因子X和激活的因子X，也包括其功能保守的变体和修饰形式。特别地，本发明包括因子x(酶原或激活的形式)的所有已知的功能保守的变体，例如Camire等人，2000描述的变体(其中天然因子X 的原肽被凝血酶原的原肽替代，以获得更高产量的Y-羧化的成熟蛋白)，或Rudolph等人， 1997描述的变体(其中对应于因子X的残基-2的密码子(ACG，其对应于SEQ ID NO 1的 39位的苏氨酸)可以变成AGG(其对应于精氨酸)中以允许准确地切割原肽。术语“因子X的激活肽”具有其在本领域的一般含义并意指根据所使用的编号系统的因子X的143到194位的52个氨基酸的多肽(SEQ ID NO=I的183-234位)。该术语可包括天然存在的因子X激活肽和其功能保守的变体和修饰形式。本文定义的激活肽相当于因子X的人激活肽，但是也可以来自任何来源，然而通常是哺乳动物(例如，人和非人灵长类动物)因子X，更特别的是人因子X。人因子X的激活肽的氨基酸序列由SEQ ID NO 2 提供。在本发明中，因子X激活肽的羧基端部分的19个最后氨基酸的序列对应于目标多肽，其对应于SEQ ID NO :2的33到52位的氨基酸序列，或对应于根据所使用的编号系统的因子X的176到194位(图1)。该多肽也称为PA176-194。这一多肽在SEQ ID NO 2的39 和49位包含两个糖基化位点，对应于根据所使用编号系统的因子X的181和191位。术语“蛋白C”具有本领域的一般含义并意指参与调节凝血的主要机制(称为“抗凝血剂途径”)的分泌丝氨酸蛋白酶。蛋白C可以来自于任何来源，但通常是哺乳动物(例如，人和非人灵长类动物)蛋白C，更特别是人蛋白。通常，人蛋白C的氨基酸序列由SEQ IDN0:3提供。蛋白C的激活肽是序列SED ID NO 3的200到211位之间发现的十二个氨基酸的多肽。术语“蛋白C”或“PC”或“成熟PC”或“酶原PC”意指由肝产生细胞分泌后的蛋白 C的血液循环形式。信号肽由信号肽酶切除，原肽序列在成熟N-末端链的N-末端的前9个谷氨酸残基(始于序列SED ID NO :3的43位的丙氨酸)上发生、羧化作用后切除。进一步的加工步骤通过双联体Lysl98-Argl99(SED ID NO 3)的缺失发生。所获得的分泌蛋白 C酶原由155个氨基酸的N-末端轻链和262个氨基酸的C-末端重链组成，其由二硫桥共价连接。进一步的翻译后加工步骤包括Aspll3(SED ID NO 3)的β-羟基化作用以及N-型糖基化。术语“激活的蛋白X”或“PCa”意指在需要凝血活性(例如凝血酶产生)的情况下产生的循环蛋白C的酶学活性形式。在能够激活蛋白C的生理条件下，Asp200到Arg211 (SED ID NO 3)的12个氨基酸的所谓激活肽通过在Arg211 (SED ID NO 3)处裂解重链的羧基末端来而与分子的其余部分分开。根据本发明，术语“蛋白C”或激活的蛋白C”包括天然存在的蛋白C和激活的蛋白C，但也包括其功能保守的变体和修饰形式。特别是，本发明包括蛋白c(酶原或激活的形式)的所有已知的功能保守的变体，例如含有在Asn355和371处的取代的具有较高抗凝血活性的激活的蛋白C衍生物(美国专利讨5337；3)，以及具有降低的抗凝血活性同时具有所需的细胞保护性质(抗细胞凋亡、抗神经变性病症和抗中风的保护性质)的激活的蛋白 C的衍生物(参见，例如WO 2005/007820) 这些突变体例如是!3K3A-APC和M9/230-APC。术语“血纤维蛋白肽A”具有本领域的一般含义并意指通过凝血酶的作用从血纤维蛋白原的α-链的N-末端片段移去的16个氨基酸残基的小肽。该术语可以包括天然存在的血纤维蛋白肽A及其保守的功能变体和修饰形式。血纤维蛋白肽A可以来自任何来源， 但通常是哺乳动物(例如，人和非人灵长类动物)血纤维蛋白肽Α，更特别的是人血纤维蛋白肽Α。通常，人血纤维蛋白肽A的氨基酸序列由SEQ ID Ν0:4提供。根据本发明，术语“血纤维蛋白肽A凝血酶可裂解衍生物”意指含有血纤维蛋白肽 A或其片段和血纤维蛋白肽A的羧基末端部分的凝血酶可裂解位点的多肽。这种衍生物由因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物的序列的SEQID NO :5 (图3Α)或SEQ ID NO :6 (图3Β) 定义和由蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物的序列SEQ ID NO :13(图4Α)或SEQ ID NO 14(图4B)限定。根据本发明，术语“凝血酶可裂解位点”意指可被凝血酶(凝血的主要丝氨酸蛋白酶)识别和裂解的短的氨基酸序列。糖基化是将糖类连接到蛋白质上的酶过程。蛋白的糖基化通常是N-连接的。 “N-连接”意指糖部分连接到天冬酰胺残基的侧链上。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-χ-苏氨酸(其中X是除了脯氨酸外的任何氨基酸)是用于糖部分酶促连接到天冬酰胺侧链上的识别序列。因此，这些三肽序列的任何一个在多肽中的存在产生潜在糖基化位点。通常，与蛋白N-连接的寡糖由葡萄糖、甘露糖和2N-乙酰氨基葡萄糖分子组成，然后其可由多种不同的单糖(包括半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺、岩藻糖和唾液酸)延长。
因此，术语“N-糖基化的”意指多肽在以上定义的至少一个天冬酰胺残基上的
N-糖基化。从广义上说，术语“预防”或“防止”意指在还未诊断为患有疾病或病症的患者中预防发生这种疾病或病症。从广义上说，术语“治疗”或“疗法”意指逆转、缓解、抑制该术语应用的疾病或病症的发展或者这种疾病或病症的一种或多种症状。术语“患者”意指患有凝血障碍或易患凝血障碍的任何受试者(优选人)。根据本发明，术语“蛋白C和因子X相关障碍”意指涉及因子X或蛋白C的任何病状，特别是凝血功能障碍。根据本发明，术语“凝血功能障碍”或“凝血障碍”意指由于凝血机制的失调而引起的任何病状。因此它包括涉及过度凝血和凝血不足的病症。涉及过度凝血或高凝性的病症包括但不限于静脉或动脉血栓形成、心肌梗死、血栓性疾病、肺栓塞、冠状动脉再闭塞和蛋白C缺乏。涉及凝血不足的病症称为出血病症，且特别地包括因子VIII、IX或XI缺乏。特别地，这些病症可以是A或B型血友病和由与另一种病症(例如自身免疫性疾病或癌症)有关的自身抗体的出现导致的血友病。源自因子X的激活肽的多肽本发明的第一个目的涉及多肽PP，其含有SEQ ID NO :2的33到52位的氨基酸序列，其中39或49位的天冬酰胺是N-糖基化的。
I-1 I-1 I-1 I-1 I-1 I-1 I-1 I-1 I-1 I-1 I-1
3 4 5 6 7 8 9 O 1 2 3 8 8 8 8 8 8 8 9 9 9 9
Ooo O O O O O O O O O O O O O O O O O
SSS 列 2,列
在ー个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO 2的23到52位的氨基酸序 列。在ー个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO 2的22到52位的氨基酸序 列。在ー个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO 2的21到52位的氨基酸序 列。在ー个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO 2的20到52位的氨基酸序 列。在ー个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO 2的19到52位的氨基酸序 列。在ー个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO 2的18到52位的氨基酸序 列。在ー个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO 2的17到52位的氨基酸序 列。在ー个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO 2的16到52位的氨基酸序 列。在ー个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO 2的15到52位的氨基酸序 列。在ー个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO 2的14到52位的氨基酸序 列。在ー个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO 2的13到52位的氨基酸序 列。在ー个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO 2的12到52位的氨基酸序 列。在ー个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO 2的11到52位的氨基酸序 列。在ー个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO 2的10到52位的氨基酸序 列。在ー个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO :2的9到52位的氨基酸序 列。在ー个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO :2的8到52位的氨基酸序 列。在ー个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQ ID N0:2的7到52位的氨基酸序 列。在ー个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO :2的6到52位的氨基酸序 列。在ー个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQ ID N0:2的5到52位的氨基酸序 列。在ー个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO :2的4到52位的氨基酸序列。在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQ ID N0:2的3到52位的氨基酸序列。在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQ ID N0:2的2到52位的氨基酸序列。在一个具体的实施方式中，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO :2。在可选的实施方式中，所述多肽不包含氨基酸序列SEQ ID NO :2。本发明的另一个目的涉及多肽PP用于提高酶原(特别是丝氨酸蛋白酶酶原)的半衰期的用途。源自因子X的激活肽的融合蛋白本发明的另一个目的涉及融合蛋白FP，其含有-由上述多肽PP构成的第一多肽和-包含SEQID NO 4的7到16位的氨基酸序列的第二多肽。本发明的另一个目的涉及融合蛋白FP，其含有-由上述多肽PP构成的第一多肽和-包含SEQID NO 4的7到16位的氨基酸序列的第二多肽，其中-对应于SEQID NO :4的14位残基的甘氨酸被缬氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸取代， 和/或-对应于SEQID NO 4的15位残基的缬氨酸被脯氨酸取代。在优选的实施方案中，本发明涉及所述融合蛋白，其中所述第一多肽的羧基端区域与所述第二多肽的氨基端区域融合。在一个具体的实施方式中，所述第二多肽包含SEQ ID NO :4的7到16位的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，所述第二多肽包含SEQ ID NO :4的6到16位的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，所述第二多肽包含SEQ ID NO :4的5到16位的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，所述第二多肽包含SEQ ID NO :4的4到16位的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，所述第二多肽包含SEQ ID NO :4的3到16位的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，所述第二多肽包含SEQ ID NO :4的2到16位的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，所述第二多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO :4。本发明的嵌合衍生物如上所述的本发明的多肽和融合蛋白可以与丝氨酸蛋白酶酶原或其活性形式或片段融合以提高所述丝氨酸蛋白酶酶原的半衰期和回收率。本发明人证明，因子X的激活肽和更特别是含有其最后的十九个氨基酸的其片段在因子X的长半衰期和注入的分子的良好回收率方面起主要作用。他们也证明，因子X的激活肽或含有其最后的十九个氨基酸的其片段可用于增加其他蛋白质(例如循环蛋白)的半衰期和回收率。因此，本发明的另一个目的涉及含有目标蛋白和上述多肽PP的嵌合蛋白。所述目标蛋白可以是在血液中具有短的半衰期的酶或其他蛋白。特别地，它可以是循环蛋白，例如丝氨酸蛋白酶或蛋白激素。通常，所述目标蛋白可以是蛋白C、因子VII、激活的因子VII、因子IX、胰岛素、促红细胞生成因子、可溶性P-选择素糖蛋白配体…，但它不是天然因子X。所述蛋白可以其酶原形式或以其激活形式使用。在一个具体的实施方式中，本发明涉及所述蛋白，其中所述多肽PP在羧基末端、 氨基末端与目标蛋白融合或融合到目标蛋白的氨基酸序列中。在一个具体的实施方式中，本发明涉及所述嵌合蛋白，其中所述多肽PP在羧基末端、氨基末端中与目标蛋白融合或融合到目标蛋白的氨基酸序列中。在一个具体的实施方式中，本发明涉及所述嵌合蛋白，其中目标酶原的激活肽被多肽PP取代。在另一个具体的实施方式中，本发明涉及所述嵌合蛋白，其中所述多肽PP在目标蛋白的天然激活肽的定位部位与目标蛋白的激活形式融合。在一个具体的实施方式中，本发明涉及所述嵌合蛋白，其中所述多肽PP由SEQ ID NO 2的33到52位的氨基酸序列组成，其中39或49位的天冬酰胺是N-糖基化的。通常，本发明涉及所述嵌合蛋白，其中所述多肽PP包含SEQ ID NO :2的33到52 位的氨基酸序列(其中39或49位的天冬酰胺是N-糖基化的)且其最大长度为19个氨基酸、20、25、30、35、40、45 或 50 个氨基酸。在一个具体的实施方式中，本发明涉及所述嵌合蛋白，其中所述多肽PP不是由因子X的天然激活肽(SEQ ID NO 2)组成。在一个具体的实施方式中，本发明涉及所述嵌合蛋白，它不是专利申请WO 2006018204中描述的蛋白之一。 在一个具体的实施方式中，本发明涉及含有蛋白C和多肽PP的嵌合蛋白，条件是所述肽的序列不是由SEQ ID NO 2的氨基酸序列组成的。在更特别的实施方式中，本发明涉及含有蛋白C和多肽PP的嵌合蛋白，其中所述多肽由SEQ ID NO 2的33到52位的氨基酸序列组成，其中39或49位的天冬酰胺是N-糖基化的。在一个具体的实施方式中，本发明涉及含有蛋白C的嵌合蛋白，其中蛋白C的激活肽被多肽PP取代，条件是所述肽的序列不是由SEQ ID NO :2的氨基酸序列组成的。在更特别的实施方式中，本发明涉及含有蛋白C的嵌合蛋白，其中蛋白C的激活肽被由SEQ ID NO 2的33到52位的氨基酸序列组成的多肽PP取代，其中39或49位的天冬酰胺是N-糖基化的。在一个具体的实施方式中，本发明涉及含有激活的蛋白C和多肽PP的嵌合蛋白， 条件是所述肽的序列不是由SEQ ID NO 2的氨基酸序列组成的。在更特别的实施方式中，本发明涉及含有激活的蛋白C和由SEQ ID NO 2的33到52位的氨基酸序列组成的多肽PP的嵌合蛋白，其中39或49位的天冬酰胺是N-糖基化的。优选地，其中39或49位的天冬酰胺被N-糖基化的SEQ ID NO 2的33到52位的氨基酸序列融合在激活的蛋白C的重链N末端部分上。本发明涉及含有多肽PP的丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物。特别地，所述丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物是蛋白C和因子X的嵌合衍生物。特别地，使用记载在WO 03035861专利申请或Louvain-Quintard等人，2005中的嵌合凝血酶可裂解衍生物并进行修饰。因此，本发明涉及因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中所述蛋白的天然激活肽被上述融合蛋白FP取代。根据本发明，本发明也包括本发明因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物的功能保守的变体。在一个具体的实施方式中，本发明还涉及因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其中对应于天然因子X的重链的前三个残基(Ile-Val-Gly，SEQ ID NO=I的235-237位) 的氨基酸可根据iToso R等人，2008及专利申请WO 03035861和WO 04005347中描述的修饰方法进行修饰。特别地，本发明涉及所述因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中-对应于SEQID NO 1的235位残基的异亮氨酸可被丙氨酸、丝氨酸或亮氨酸取代；-对应于SEQID NO=I的236位残基的缬氨酸可被苯丙氨酸或丙氨酸取代。在另一个具体的实施方式中，本发明还涉及因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中对应于血纤维蛋白肽A的最后三个残基的氨基酸(Gly-Val-Arg，SEQ ID NO :4的 14-16位)也可根据Gustafsson D等人，2004和专利申请WO 04005347中描述的修饰方法进行修饰。特别地，本发明涉及所述因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中-对应于SEQID NO 4的14位残基的甘氨酸可被缬氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸取代；-对应于SEQID NO 4的15位残基的缬氨酸可被脯氨酸取代。根据本发明，所述修饰用于提高凝血酶的切割或激活的因子X的效力，且不改变本发明嵌合的凝血酶可裂解衍生物的活性。因此，本发明涉及因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中所述蛋白的天然激活肽被融合蛋白取代，所述融合蛋白含有-多肽PPJP-由氨基酸序列SEQID NO 5或SEQ ID NO 6定义的血纤维蛋白肽A凝血酶可裂解衍生物。在一个实施方式中，所述因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物的特征在于所述多肽是因子X的天然激活肽(SEQ ID NO :2)。在另一个实施方式中，所述因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物的特征在于所述血纤维蛋白肽A凝血酶可裂解衍生物由选自SEQ ID NO 7,SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :11和SEQ ID NO :12的氨基酸序列选择的氨基酸序列限定。
在一个具体的实施方式中，本发明涉及所述因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中-所述多肽是因子X的天然激活肽(SEQID N0:2)，和-所述血纤维蛋白肽A凝血酶可裂解衍生物由氨基酸序列DFLAEGGGVRIVG(SEQ ID NO 7)定义。本发明也涉及蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中所述蛋白的天然激活肽被融合蛋白FP取代。根据本发明，本发明也包括本发明蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物的功能保守的变体。在一个具体的实施方式中，在所述蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物中，对应于天然蛋白C的重链的前三个残基的氨基酸(Leu-Ile-Asp，SEQ ID NO 3的212-214位) 可以根据专利申请WO 03035861中描述的改性法改性。特别是，在本发明蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物中-对应于SEQID NO :3的212位残基的亮氨酸可被丙氨酸或丝氨酸取代；-对应于SEQID NO :3的213位残基的异亮氨酸可被苯丙氨酸取代；-对应于SEQID NO 3的214位残基的天冬氨酸可被甘氨酸取代。在另一个具体的实施方式中，本发明还涉及蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中对应于血纤维蛋白肽A的最后三个残基的氨基酸(Gly-Val-Arg，SEQ ID NO :4的 14-16位)也可以根据Gustafsson D等人，2004和专利申请WO 04005347中描述的修饰方法进行修饰。特别地，本发明涉及所述因子X的嵌合凝血酶可裂解衍生物，其中-对应于SEQID NO 4的14位残基的甘氨酸可被缬氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸取代；-对应于SEQID NO 4的15位残基的缬氨酸可被脯氨酸取代。根据本发明，所述修饰用于提高凝血酶的切割或激活的蛋白C衍生物的效力，且不改变本发明嵌合的凝血酶可裂解衍生物的活性。本发明还涉及蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中所述蛋白的天然激活肽被融合蛋白取代，所述融合蛋白含有-多肽PPJP-由氨基酸序列SEQID NO 13或SEQ ID NO 14定义的血纤维蛋白肽A凝血酶可裂解衍生物。在一个实施方式中，所述多肽是因子X的天然激活肽(SEQ ID NO 2)。在另一个实施方式中，所述血纤维蛋白肽A凝血酶可裂解衍生物由选自SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25 禾口 SEQ ID NO 26
的氨基酸序列中选择的氨基酸序列限定。在一个具体的实施方式中，本发明涉及所述蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中-所述多肽是因子X的天然激活肽(SEQID N0:2)，和
-所述血纤维蛋白肽A凝血酶可裂解衍生物由氨基酸序列DFLAEGGGVRLID(SEQ ID NO 15)定义。本发明的另一个目的涉及蛋白C的嵌合衍生物，其中多肽PP在天然蛋白C的激活肽的氨基末端部分融合。本发明的另一个目的涉及丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物，其特征在于它含有所述激活的丝氨酸蛋白酶或其功能保守的变体和多肽PP。特别地，本发明涉及目标丝氨酸蛋白酶的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其特征在于它包含所述激活的丝氨酸蛋白酶或其功能保守的变体和融合蛋白FP。在一个具体的实施方式中，本发明涉及因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其包含激活的因子X或其功能保守的变体和融合蛋白FP。在优选的实施方式中，本发明涉及因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其含有激活的因子X或其功能保守的变体和融合蛋白FP，其中融合蛋白FP的羧基末端部分与激活的因子X的重链的氨基末端部分融合。根据本发明，一些氨基酸可以被取代、删除或添加以提高本发明因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物的活性。特别是，对应于血纤维蛋白肽A的最后三个氨基酸(氨基酸序列SEQ ID NO 4的14到16位)和对应于激活的因子X的重链的前三个氨基酸(氨基酸序列SEQ ID NO 1的235到237位)的氨基酸可如上所述进行修饰。特别地，本发明涉及所述的本发明因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中-对应于SEQID NO 1的235位残基的异亮氨酸可被丙氨酸、丝氨酸或亮氨酸取代；-对应于SEQID NO=I的236位残基的缬氨酸可被苯丙氨酸或丙氨酸取代。-对应于SEQID NO 4的14位残基的甘氨酸可被缬氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸取代；-对应于SEQID NO 4的15位残基的缬氨酸可被脯氨酸取代，根据本发明，所述修饰用于提高凝血酶的切割或激活的因子X衍生物的效力，且不改变本发明嵌合的凝血酶可裂解衍生物的活性。在一个具体的实施方式中，本发明涉及含有激活的蛋白C的蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物或其功能保守的变体和融合蛋白FP。在优选的实施方式中，本发明涉及含有激活的蛋白C的蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其或其功能保守的变体和融合蛋白FP，其中所述融合蛋白FP的羧基末端部分与激活的蛋白C的重链的氨基末端部分融合。根据本发明，一些氨基酸可以被取代、删除或添加以改进本发明蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物。特别是，对应于激活的蛋白C的重链的前三个氨基酸(SEQ ID NO 3 的212-214位)的氨基酸可如上所述进行修饰。特别地，在本发明蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物中-对应于SEQID NO :3的212位残基的亮氨酸可被丙氨酸或丝氨酸取代；-对应于SEQID NO :3的213位残基的异亮氨酸可被苯丙氨酸取代；-对应于SEQID NO 3的214位残基的天冬氨酸可被甘氨酸取代；-对应于SEQID NO 4的14位残基的甘氨酸可被缬氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸取代；-对应于SEQID NO 4的15位残基的缬氨酸可被脯氨酸取代。根据本发明，所述修饰用于提高凝血酶的切割或激活的蛋白C衍生物的效力，且不改变本发明嵌合的凝血酶可裂解衍生物的活性。核酸、载体和重组宿主细胞本发明的另一个目的涉及编码本发明多肽和嵌合衍生物的核酸分子。在一个实施方式中，本发明涉及编码上述因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物的核酸分子。在另一个实施方式中，本发明涉及编码上述蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物的核酸分子。“编码序列”或“编码”表达产物(例如RNA、多肽、蛋白质或酶)的序列是被表达时产生RNA、多肽、蛋白质或酶的核苷酸序列，也就是说，核苷酸序列编码该多肽、蛋白质或酶的氨基酸序列。蛋白质的编码序列可以包括起始密码子(通常是ATG)和终止密码子。这些核酸分子可以通过本领域技术人员熟知的常规方法获得，特别是通过编码天然蛋白的基因的定点诱变获得。通常，所述核酸是DNA或RNA分子，其可以包括在适当的载体中，例如质粒、粘粒、 附加体、人工染色体、噬菌体或病毒载体。因此，本发明的另一个目的涉及载体和表达盒，其中本发明的核酸分子与用于控制转录的适当元件(特别是启动子、增强子和任选的终止子)和任选地控制翻译的元件结合，且也涉及本发明核酸分子插入其中的重组载体。例如，这些重组载体可以是克隆载体或表达载体。术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”意指DNA或RNA序列(例如外源基因)可以通过其引入宿主细胞中的媒介体，从而使宿主转化并促进所引入序列的表达(例如转录和翻译)。可以使用用于动物细胞的任何表达载体，只要编码本发明多肽或嵌合衍生物的基因可以被插入和表达。适合的载体例子包括PAGE107 (Miyaji H等人，1990)、 pAGE103 (Mizukami T 等人，1987)、pHSG274 (Brady G 等人，1984)、pKCR(0' Hare K 等人， 1981)、pSGl beta d2~4~ (Miyaji H 等人，1990)等。质粒的其他例子包括含有复制原点的复制质粒或整合质粒，例如pUC、pcDNA、pBR寸。病毒载体的其他例子包括腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒和AAV载体。这种重组病毒可由本领域已知的技术制备，例如通过转染包装细胞或通过辅助质粒(helper plasmid) 或病毒瞬时转染。病毒包装细胞的典型实例包括PA317细胞、PsiCRIP细胞、GPenv+细胞、 293细胞等。用于制备这种复制-缺陷型重组病毒的详细方案例如可从WO 95/14785、WO 96/22378、US 5，882，877、US 6，013，516、US 4，861，719、US 5，278，056 和 WO 94/19478 中找到。用于动物细胞的表达载体中使用的启动子和增强子的例子包括SV40的早期启动子和增强子(Mizukami Τ.等人，1987)、莫洛尼小鼠白血病病毒的LTR启动子和增强子 (Kuwana Y等人，1987)、免疫球蛋白H链的启动子(Mason JO等人，1985)和增强子(GilliesSD等人，1983)等。本发明也包括含有本发明核酸分子的基因传递系统(gene delivery system)，其可用于体内或体外的基因治疗。这例如包括病毒转移载体，例如源自逆转录病毒、腺病毒、 腺伴随病毒、慢病毒属的那些，它们常规地用于基因治疗。这也包括含有本发明核酸分子和非病毒基因传递媒介的基因传递系统。非病毒基因传递媒介的例子包括脂质体和聚合物 (例如聚乙烯亚胺、环糊精、组氨酸/赖氨酸(HK)聚合物等)。本发明的主题也涉及用至少一种本发明的核酸分子遗传转化的原核或真核宿主细胞。术语“转化”意指将“外源”(即外来的或细胞外的)基因、DNA或RNA序列引入宿主细胞中以使宿主细胞表达所引入的基因或序列，从而生成所需物质，通常是由引入的基因或序列编码的蛋白质或酶。接受和表达所引入的DNA或RNA的宿主细胞已被“转化”。优选地，为表达和生成多肽和嵌合衍生物，特别是本发明的蛋白C和因子X衍生物，选择真核细胞，特别是哺乳动物细胞，更特别是人细胞。通常，可以使用细胞系例如CH0、BHK-21、C0S-7、C127、PER. C6或HEK293，因为其对衍生物进行正确的翻译后修饰的能力。本发明也包括带有包含本发明表达盒的至少一种转基因的转基因动物，特别是转基因非人类哺乳动物。所述转基因动物可用于制备本发明的嵌合蛋白，如例如早已由Brink 等人，2000所描述的。本发明的表达载体的构建、宿主细胞的转化和转基因动物的产生可以使用常规的分子生物学技术完成。本发明的嵌合衍生物，特别是蛋白C或因子X衍生物，例如可以通过培养本发明的遗传转化细胞并从培养基中回收由所述细胞表达的所述衍生物获得。如有必要，它们随后可通过本领域技术人员本身已知的常规方法纯化，例如通过分级沉淀(特别是硫酸铵沉淀)、电泳、凝胶过滤、亲和层析等。特别地，用于制备和纯化重组蛋白的常规方法可用于制备本发明的蛋白质。例如， 为制备本发明的蛋白C衍生物，可以使用例如美国专利4992373或美国专利4981952中描述的方法。治疗方法和用途本发明的第三个目的涉及本发明的嵌合衍生物在蛋白C和因子X相关疾病特别是凝血功能障碍的预防或治疗中的用途。在一个实施方式中，本发明涉及作为促凝血剂的本发明因子X的嵌合衍生物。在一个具体的实施方式中，本发明涉及因子X的嵌合衍生物在特别地由因子 VIII、IX或XI缺乏产生的出血型的凝血病症的预防或治疗中的用途。这些病症可以特别是A或B型血友病，其可以是或不是因抑制剂(中和抗常规用于治疗的因子VIII或IX的同种抗体)的存在而复杂化；它们也可以是由于与另一种病症 (自身免疫性疾病、癌症、淋巴增生综合症、特发性障碍等)相关的自身抗体的出现而引起的获得性血友病。在一个具体的实施方式中，本发明涉及用于A或B型血友病的预防或治疗的因子 X的嵌合衍生物。在另一个实施方式中，本发明涉及用于B型血友病的预防或治疗的因子IX的嵌合衍生物。在另一个实施方式中，本发明涉及用于纤维增生性疾病例如纤维化组织重建和癌症的预防或治疗的因子X的嵌合衍生物。本发明涉及用于由低分子量肝素(LMWH)或由靶向因子Xa(fXa)的抗凝血剂引起出血的预防或治疗的方法中的本发明因子X的嵌合衍生物。靶向因子)(a的抗凝血剂是公知的(参见综述Harenberg，2008，Bauer, 2008, Kho 等人，2009)。靶向因子的抗凝血剂的例子是利伐沙班和贝曲沙班。在优选的实施方式中，对应于SEQ ID NO=I的419位残基的所述因子X的嵌合衍生物的丝氨酸被丙氨酸取代。在另一个实施方式中，分别对应于SEQ ID NO 1的387、391和419位残基的所述因子X的嵌合衍生物的精氨酸、赖氨酸和丝氨酸被丙氨酸取代。本发明的这些因子X的嵌合衍生物进行修饰，以使它们直接或间接地与因子叙抑制剂结合。在结构上，这些衍生物被修饰以不提供促凝血活性或降低促凝血活性，且对于后一实施方式来说不组装成凝血酶原酶复合物。在另一个实施方式中，本发明涉及作为抗血栓形成剂、抗炎剂、抗神经变性剂和抗细胞凋亡剂的蛋白C的嵌合衍生物。在一个具体的实施方式中，本发明涉及用于包括高凝性的病症的预防或治疗的蛋白C的嵌合衍生物。这样的病症包括但不限于静脉或动脉血栓形成，特别是影响大口径血管的血栓形成、心肌梗死、血栓性疾病、肺栓塞、血管成形术或溶栓治疗后的冠状动脉再闭塞、中风以及患有影响PC基因或血栓调节蛋白基因的基因异常的患者的凝血异常。在一个具体的实施方式中，本发明涉及用于A或B型血友病的预防或治疗的蛋白 C的嵌合衍生物。在另一个实施方式中，本发明涉及用于呼吸和炎性疾病的预防或治疗的蛋白C的嵌合衍生物。优选地，所述嵌合衍生物以治疗有效量给药。“治疗有效量”意指以适用于任何医学治疗的合理的利益/风险比治疗或预防蛋白 C和因子X相关疾病的足够量的本发明嵌合衍生物。可以理解，本发明化合物和组合物的总的日用量由主治医师在合理医学判断范围内决定。用于任何特定患者的具体治疗有效剂量将取决于多种因素，包括被治疗的病症和病症的严重性；所使用的具体化合物的活性；所使用的具体组合物；患者的年龄、体重、 总体健康、性别和饮食；给药时间、给药途径和所使用的具体化合物的排泄率；治疗持续时间；与所使用的具体多肽联合使用或同时使用的药物；以及医学领域公知的类似因素。例如，本领域公知所述化合物的起始剂量应低于达到预期治疗效果所要求的剂量水平和逐步增加剂量直到达到预期效果。然而，该产品的日剂量可以在每成人每天0. 01到1，OOOmg的宽范围内变化。优选地，组合物包含 0. 01,0. 05,0. 1,0. 5,1. 0,2. 5,5. 0,10. 0,15. 0,25. 0、 50. 0、100、250和500mg的活性成分以对症调整待治疗患者的症状的剂量。通常，药物含有约0. Olmg到约500mg的活性成分，优选Img到约IOOmg的活性成分。药物的有效量通常每天0. 0002mg/kg体重到约20mg/kg体重，优选每天约0. OOlmg/kg体重到7mg/kg体重剂量水平提供。药物组合物本发明的另一个目的涉及用于蛋白C和因子X相关疾病(特别是凝血功能障碍) 的预防或治疗的含有本发明嵌合衍生物的药物组合物。“药学上”或“药学上可接受的”意指当适当地给药于哺乳动物特别是人时，不产生不利的、过敏的或其他不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂意指非毒性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或任何类型的制剂辅剂。在一个实施方式中，本发明涉及用于上文详述的出血型、纤维增生性凝血病症的治疗的含有因子χ的嵌合衍生物的药物组合物。在另一个实施方式中，本发明涉及用于上文详述的涉及高凝性的病症、炎症或呼吸道疾病的预防或治疗的含有蛋白C的嵌合衍生物的药物组合物。丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物可以与药学上可接受的赋形剂和任选的持续释放基质(例如可生物降解的聚合物)组合以形成治疗组合物。在用于经口、舌下、皮下、肌肉内、静脉内、透皮、局部或直肠给药的本发明药物组合物中，单独使用或与另一种有效成分组合使用的有效成分可以单位给药形式，作为与常规药物载体的混合物，给药于动物和人类。适合的单位给药形式包括口服途径形式(例如片剂、胶囊、粉末、颗粒和口服悬浮液或溶液)、舌下和口腔给药形式、气雾剂、植入物、皮下、 透皮、局部、腹膜内、肌肉内、静脉内、真皮下、透皮、鞘内和鼻内给药形式及直肠给药形式。优选地，所述药物组合物包含用于能够注射的制剂的药学上可接受的载体。这些可以特别是等渗、无菌的盐溶液(磷酸二氢钠或磷酸氢二钠，氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)、或干燥的(特别是冻干的)组合物，，其在加入无菌水或生理盐水(根据情况)时允许构成可注射溶液。适于注射使用的药物形式包括无菌水性溶液或分散体；含有芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂；和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下， 该形式必须是无菌和必须是达到易注射的程度的流体。它在制备和贮存条件下必须是稳定的，且必须抗微生物(例如细菌和真菌)污染。含有作为游离碱或药学上可接受盐的本发明化合物的溶液可以在与表面活性剂 (例如羟丙基纤维素)适当地混合的水中制备。分散体也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中以及在油中制备。在常规贮存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以阻止微生物生长。本发明的丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物可配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(由蛋白质的游离氨基形成)，且其与无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。由游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)以及有机碱(例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。载体也可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，其适合的混合物及植物油。例如，可通过使用包衣(例如卵磷脂)，在分散体的情况下通过保持所需粒径以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。微生物活动的预防可由各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如，糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延缓吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，来实现。无菌注射溶液通过以下步骤制备将所需量的活性多肽与以上列举的几种其他成分(根据需要)一起加入适当的溶剂中，然后过滤除菌。通常，分散体通过以下步骤制备 将各种无菌活性成分加入无菌载体中，所述载体含有基础分散介质和所需的以上列举的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥和冻干技术，其从先前的无菌过滤的溶液得到活性成分加上任何其他所需成分的粉末。在制剂时，将溶液以与剂型相容的方式和以治疗有效的量给药。该制剂容易以多种给药形式给药，例如上述的可注射溶液类型，但也可以使用药物缓释胶囊等。对于以水性溶液形式的肠胃外给药，例如，应将所述溶液适当缓冲(如有必要)并首先利用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水性溶液尤其适于静脉内、 肌肉内、皮下和腹膜内给药。关于这一点，根据本发明的公开，可使用的无菌水性介质对于本领域技术人员是已知的。例如，一剂药物可以溶解在Iml的等渗NaCl溶液中，并加入到 IOOOml皮下输注液体中或在建议的输注部位注射。根据被治疗受试者的状况，进行一些剂量的变化将是必要的。无论如何，负责给药的人将决定单个受试者的适当剂量。本发明的丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物可在配制成治疗混合物以包含每剂约 0. 0001到1. 0毫克、或约0. 001到0. 1毫克、或约0. 1到1. 0或甚至约10毫克左右。也可多剂量给药。除了配制成用于肠胃外给药(例如静脉内或肌肉内注射)的本发明化合物外， 其他药学上可接受的形式例如包括用于口服的片剂或其他固体；脂质体制剂；延时释放胶囊；和任何其他目前使用的形式。


图1 因子X酶原氨基酸序列的不同部分的图示。mfflt (或信号肽)由-40到-18位之间的氨基酸序列定义，且^^由-17到_1 位之间的氨基酸序列定义。轻链对应于1到142位氨基酸之间的序列，重链对应于195到 448位氨基酸之间的序列。激活肽(143到194位)加框，且关注的N-糖基化位点用*标记。所用的编号系统显示在与序列相同的行上，其他参照系统在序列下的行上以灰色显示。图2 对于因子X的凝血酶可裂解衍生物的血纤维蛋白肽A凝血酶可裂解衍生物的图示。A.所述血纤维蛋白肽A凝血酶可裂解衍生物包含血纤维蛋白肽A的氨基酸序列， 其中14或15位的氨基酸可以根据图示修饰。在羧基末端部分，增加3个另外的氨基酸以形成带有血纤维蛋白肽A(或衍生物)的最后3个氨基酸的6个氨基酸的凝血酶可裂解位
点οB.在本发明的优选方式中，仅使用血纤维蛋白肽A的最后10个氨基酸，并与3个氨基酸的肽融合以形成凝血酶可裂解位点。图3 对于蛋白C的凝血酶可裂解衍生物的血纤维蛋白肽A凝血酶可裂解衍生物的图示。A.所述血纤维蛋白肽A凝血酶可裂解衍生物包含血纤维蛋白肽A的氨基酸序列，且在羧基末端部分增加3个氨基酸以形成带有血纤维蛋白肽A(或衍生物)的最后3个氨基酸的6个氨基酸的凝血酶可裂解位点。B.在本发明的优选方式中，仅使用血纤维蛋白肽A的最后10个氨基酸，并与3个氨基酸的肽融合以形成凝血酶可裂解位点。图4 :FX变体构建体的图示。有七个重组因子X(FX)蛋白。蛋白结构域如下轻链是灰色，激活肽(AP)是白色， 因子X的催化域(catalytic domain)是黑色。激活肽是不同变体间的差异位点。FpA相当于由SEQ ID NO 7定义的血纤维蛋白肽A凝血酶可裂解衍生物，ap对应于FX激活肽的羧基末端的残基176-194，黑线表示FX激活肽中N181A和W91A的突变位点。图5 蛋白C变体构建体的图示。有三个重组蛋白C蛋白。蛋白结构域如下轻链是灰色，激活肽(AP)是白色，和蛋白C的催化域是黑色。FpA相当于由SEQ ID NO :7定义的血纤维蛋白肽A凝血酶可裂解衍生物，PP对应于FX激活肽的羧基末端的残基176-194。图 6 wt-FX 从血菜的双相清除(biphasic clearance)。将纯化wt-FX静脉内注射到小鼠体内(10 μ g/小鼠)。在指定时点采集血样。血浆中残留wt-FX抗原的量用ELISA(参见“实验过程”)定量。血浆中的残留抗原相对于注射后aiiin时存在的量的百分比对于注射后的时间作图。源自这些数据的药代动力学参数概括于表I中。数据表示各时点3只小鼠的平均值士S. D.。图7 :FX/deIAP-FpA从血浆的单相清除。将纯化FX/delAP-FpA静脉内注射到小鼠体内(10 μ g/小鼠)。在指定时点采集血样。血浆中残留FX/delAP-FpA抗原的量用ELISA(参见“实验过程”)定量。注射后血浆中残留抗原相对于注射后anin时存在的量百分比对于注射后的时间作图。源自这些数据的药代动力学参数概括于表I中。数据表示各时点3只小鼠的平均值士S. D.。图8 :FX/AP-FpA从血浆的双相清除。将纯化的FX/AP-FpA静脉内注射到小鼠体内(10 μ g/小鼠)。在指定时点采集血样。血浆中残留FX/AP-FpA抗原的量用ELISA (参见“实验过程”)定量。注射后血浆中残留抗原相对于注射后anin时存在量的百分比对于注射后的时间作图。源自这些数据的药代动力学参数概括于表I中。数据表示各时点3个小鼠的平均值士S. D.。图9 FX/API76-194从血浆的双相清除。将纯化的FX/AP176-194静脉内注射到小鼠体内(10μ g/小鼠)。在指定时点采集血样。血浆中残留FX/AP176-194抗原的量用ELISA(参见“实验过程”)定量。注射后血浆中残留抗原相对于注射后aiiin时存在量的百分比对于注射后的时间作图。源自这些数据的药代动力学参数概括于表I中。数据表示各时点3只小鼠的平均值士S. D.。图 10 :FX/AP176-194-N181A-N191A 从血浆的单相清除。将纯化的FX/AP176-194-N181A-N191A静脉内注射到小鼠体内(10μ g/小鼠)。在指定时点采集血样。血浆中残留FX/AP176-194-N181A-N191A抗原的量用ELISA(参见“实验过程”)定量。血浆中残留抗原相对于注射后anin时存在量的百分比对于注射后的时间作图。源自这些数据的药代动力学参数概括于表I中。数据表示各时点3只小鼠的平均值士 S. D.。
图11 :FX/AP176-194_N181A 从血浆的双相清除。将纯化的FX/AP176-194-N181A静脉内注射到小鼠体内(10 μ g/小鼠)。在指定时点采集血样。血浆中残留FX/AP176-194-N181A抗原的量用ELISA(参见“实验过程”)定量。血浆中残留抗原相对于注射后aiiin时存在量的百分比对于注射后的时间作图。源自这些数据的药代动力学参数概括于表I中。数据表示各时点3只小鼠的平均值士S. D.。图12 :FX/AP176-194-N191A 从血浆的单相清除。将纯化的FX/AP176-194-N191A静脉内注射到小鼠体内(10 μ g/小鼠)。在指定时点采集血样。血浆中残留FX/AP176-194-N191A抗原的量用ELISA(参见“实验过程”)定量。血浆中残留抗原相对于注射后aiiin时存在量的百分比对于注射后的时间作图。源自这些数据的药代动力学参数概括于表I中。数据表示各时点3只小鼠的平均值士S. D.。
具体实施例方式实施例材料和方法材料幼仓鼠肾脏(BHK)来自于ATCCOtockville，美国)。胎牛血清(FCS)和牛血清蛋白 (无BSA蛋白酶)从PAA实验室(Les Mureaux，法国)购买。Dulbecco' s改良Eagle' s/ F12培养基、青霉素/链霉素、两性霉素(两性霉素B脱氧胆酸盐)从^witrogen(Cergy Pontoise,法国)获得。苯甲脒和苯基磺酰氟(PMSF)来自于Calbiochem(Meudon，法国)。氨甲喋呤、维生素 K1、聚乙二醇 8000 (PEG)从 Sigma (Saint Quentin Fallavier, 法国)购买。N-苄氧基羰基-D-精胺酰基-L-精氨酸-对-硝基酰替苯胺-二盐酸化物(N-a-Z-D-Arg-Gly-Arg-p-NA)产品名 S-2765 来自于 Chromogenix( Mijlndal,瑞典)。 L- α -磷脂酰基-L-丝氨酸(来自牛脑)和L- α -胆碱磷脂(来自蛋黄)来自于Avanti Polarlipids(Alb￡ister，__ ) 。 QAE Sephadex A-50> HiTrapTM Q Heparin HiTrap fe 得自 GE Healthcare (Orsay，法国)。抗蛋白 C 亲合性基质从 Roche Diagnostics (Meylan, 法国)购买。重组FX衍生物的构建含有人因子X cDNA的哺乳动物表达质粒pKG5 (Christophe等人，2001)、含有人胰岛素cDNA的质粒和含有人蛋白C cDNA的质粒用作标准PCR诱突的模板，以产生分别编码全长人因子X、全长人胰岛素和带有C-末端HPC-4标签的全长人蛋白(残基EDQVDPRLIDGK， SEQ ID NO 27)白勺 cDNA。 i^M ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Reaction Kit v3. 1 (Applied Biosystems Applera，Courtaboeuf，法国)在ABI PRISM 310 DNA测序仪上根据厂商的说明通过DNA序列分析检查克隆到表达载体pNUT中的突变的全长cDNA。 FX构建体用作标准PCR诱变的模板(参见引物表I)，以产生编码在激活肽中具有部分缺失和特定突变的因子X变体的cDNA，所述变体称为FX/AP176-194、FX/delPA-FpA、FX/AP-FpA、 FX/AP176-194-m81A、FX/AP176-194-N191A 和 FX/AP176-194-N181A-N191A(图 4)。胰岛素构建体用作标准PCR诱突的模板，以产生编码包含SEQ ID NO :2(因子X的激活肽)的33 到52位的氨基酸序列的含有多肽PP的胰岛素变体的cDNA。类似地，蛋白C构建体用作模板以产生编码蛋白C变体的cDNA(图5)。克隆到pNUT-表达载体中的构建体的被完全测序。表I 用于产生不同因子X变体的引物
突变引物〃序列(5，■ 3，有义)FX/AP17b iy4 有乂CTGGAACGCCGGAAGAGGGACCTGCTTGACTTCAACCAGACGCAG (SEQ ID NO; 28)FX/ΛΡ 6 94 反义GTTGAAGTCCAGCAGGTCCCTCTTCCGACGTTCCAGTGTCTGTTT (SEQ ID NO: 29)FX/delAP,FpA 有义_GACTTTCTAGCTGAAGGAGGAGGCGTGCGTATCGTGGGAGGCCAGGAATG C (SEQ ID NO: 30)FX/delAP-FpA 反又CCTCCTCCTTCTGCTAGAAAGTCTCTCTTTCTGCGTTCCAGGGTCTGTTT (SEQ ID NO: 31)FX/AP-FpA 有义GACTTTCTAGCTGAAGGAGGAGGCGTGCGTATCGTGGGAGGCCAGGAATG C (SEQ ID NO: 30)FX/AP-FpA 反义CCTCCTCCTTCTGCTAGAAAGTCCCTGGTCAGGTTGTTGTCG (SEQ ID NO: 32)FX/AP176'194"n181a 有义CTTGACTTCGCCCAGACGCAGCCT (SEQ ID NO: 33)FX/AP176"194_n181A 反义AGGCTGCGTCTGGGGGAAGTCAAG (SEQ ID NO: 34)FX/AP176-194_NI91A 有义GGCGACAATGCTCTCACCAGGATCGT (SEQ ID NO: 35)FX/APlw"1M"Hl5lA 反义GATCCTGGTGAGAGCATTGTCGCCCCT (SEQ ID NO: 36)表达重组衍生物的细胞系的获得按照供应商的说明使用jetPEI反应物(Qbiogen，Ozyme,法国)将pNUT-构建体转染到幼仓鼠肾脏细胞(BHK)中。用含有浓度为ΙΟΟμΜ的氨甲喋呤(Sigma)的培养基选择转染细胞后，在选择培养基中挑选并增殖单克隆以获得稳定的细胞系。使用从 Dako (Dakopatts，Glostrup，丹麦)获得的抗与辣根过氧化酶偶联或不偶联的因子X的多克隆抗体，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)分析因子X抗原的产生。来自Kordia(Leiden，荷兰)的纯化人血浆源因子X(Pd-FX)用作参照。通过来自Dako的人胰岛素ELISA试剂盒分析胰岛素的产生。利用用于涂层的亲合纯化的小鼠单克隆抗体(Roche，Meylan，法国)和来自Dako的抗与辣根过氧化酶偶联的蛋白的多克隆抗体通过两位点ELISA分析蛋白C的产生。选择产生因子X、胰岛素和蛋白C的细胞系。重组因子X、胰岛素和蛋白C衍生物的制备和纯化将产生重组因子X、胰岛素和蛋白C衍生物以及野生型因子X、胰岛素和蛋白C的稳定细胞系保持在300cm2烧瓶中用于在补充有10% FCS、50 μ M氨甲喋呤、100U/ml青霉素、 100 μ g/ml链霉素和5 μ g/ml维生素Kl (不用于胰岛素)的DMEM/F-12中产生蛋白。每48 小时收集含有目标蛋白的培养基。加入苯甲脒和PMSF到最终浓度分别为10和2mM，培养基离心(6000g)，通过醋酸纤维素膜(0.45μπι)以除去细胞碎片，并在使用前在-20°C下储存。在37°C解冻条件培养基。加EDTA到最终浓度为5mM。在蒸馏水和Tris (pH 7.4)中稀释培养基以分别获得iTris和NaCl的最终浓度25和60mM。然后混合物在室温下与QAE Sephadex A-50珠搅拌30min以使最终浓度达到0. 25% (wt/v)。洗涤珠子，然后用50mMTris (pH 7.4)、500mM NaCl和IOmM苯甲脒洗脱。洗脱馏分中所包含的重组蛋白(ELISA)立即用含有IOmM的苯甲脒的25mM Tris (pH 7.4)和IOOmM NaCl透析，并在使用前在_20°C储存。在37°C解冻浓缩的蛋白。加钙到最终浓度为5mM。按照供应商的说明使用HPC-4-琼脂糖(RochhMeylan，法国)通过亲合色谱进行重组蛋白质的纯化。在作为酶原使用前lh，因子X衍生物与ImM PMSF —直孵育以中和可能在重组蛋白的制备和纯化期间产生的任何痕量的激活的因子X。相同的处理应用于蛋白C衍生物。对照实验表明在Tris-HCl缓冲液中 30min后，PMSF完全水解且不会干扰其他反应。在还原(IOOmM二硫苏糖醇，最终浓度)和非还原条件下使用重组蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，然后用Coomassie Brilliant Blue R-250染色评估蛋白纯度。在还原纯化的重组蛋白并负载到10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上后，进行因子X、胰岛素和蛋白C的鉴定。将溶解的蛋白转移到Immobilon膜上并用抗与辣根过氧化物酶偶联的因子X、胰岛素和蛋白C的多克隆抗体(DakopattGlostrup，丹麦) 染色。等分纯化的衍生物并在使用前储存在_80°C下。等分试样的浓度以其在^Onm的吸光率估计，取因子X、胰岛素和蛋白C的消光系数(E280nm 0. )为1. 16、1.05和1.45。/hS整个研究使用C57BL/6背景的野生型雄性小鼠(JanVier，Le Genest-M-Isle，法国)，其为8至9周大。按照法国规章和欧洲共同体的试验指南所推荐的进行饲养和实验。 24只小鼠用于各清除率调查。/丨、鼠,Φ附X#〒物白彻佘物躺将非麻醉小鼠置于约束器中，其尾部在40°C水浴中浸:3min。然后，将在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以50yg/ml稀释的200μ1因子X衍生物注射入小鼠尾静脉中。在不同的时间点(注射后2、6、10和30min及1、2、4和8h)，通过腹膜内注射戊巴比妥钠(60mg/ kg ；Ceva SanteAnimale, Libourue，法国)麻醉小鼠并从眼球后静脉丛将血液收集到含有柠檬酸三钠(9体积的血对1体积的0. 138M柠檬酸三钠)的塑料管中。每个时间点用三只小鼠，每个小鼠仅流血一次。为了获得贫血小板的血浆，在室温下IOOOg离心血样20分钟。使用在碳酸盐缓冲液(PH 9.6)中涂覆的称为HPC-4的小鼠单克隆抗体(Roche)和辣根过氧化物酶偶联的抗人因子X的多克隆抗体(Dako)，通过免疫吸附试验测定血浆中因子X衍生物的浓度。HPC4标记的重组纯化和定量的野生型因子X(参见上文)用作参照。 结果以注入的重组人因子X的百分数表示。对于生物分布实验和回收率测定，如所描述的 (Fracker 和 Speck，BBRC 1978)使用 Iodo Gen (Pierce Chemical Co.，Rockford，IL，美国) 用Na125I (Perkin-Elmer, Courtaboeuf，法国)标记高度纯化的重组FX变体。比放射活性为 2到10X IO4Cpm/μ g FX变体。最终制剂中的游离碘通过用20%三氯乙酸沉淀测定为低于 5%。回收率表示注射后5min血浆中存在的FX相对于注射的量的百分比。小薩冲蛋白C禾ΠB夷岛素变体的清除率对于各蛋白C和胰岛素变体，使用M只8周大的雄性WT小鼠。将10 μ g在PBS 中稀释的纯化重组蛋白经由尾静脉注射入每只小鼠。在注射后的不同时间点用三溴乙醇麻醉小鼠(60mg/kg 体重)，并使用水蛭素(Diagnostica Stago, Asnieres，法国)(100UI，最终浓度)由眼球后静脉收集血液。每个时间点使用三只小鼠，各小鼠仅放血一次。制备血浆并通过ELISA或通过剩余活度分析残留的注入抗原的浓度。数据分析
清除率曲线指随时间变化的小鼠血浆中残留因子X、蛋白C和胰岛素衍生物抗原相对于注射量的量(％注射的浓度)。数据拟合 单指数方程Cp = Ae- α t方程 1 或双指数方程 Cp = Ae- α t+Be_ β t方程 2使用KaleidaGraph 软件(KaleidaGraph 版本 4. 02.，用于 Mac OS X，Synergy Software, Reading，美国)测定参数Α、α、B和β。Cp指血浆中残留因子X衍生物相对于注射量的量。这些参数是计算平均停留时间(MRT)所需要的。 在双相清除过程中MRT = (Α/ α 2+Β/ β2)/ (A/ α +B/ β )方程 3 在单相清除机制中MRT = (Α/ α 2) / (Α/ α )方程 4此外，α和β使用Τ1/2α = In 2/α和Τ1/2β = In 2/β分别计算初始和终末阶段的半衰期。凝血酶牛成分析根据Hemker 等人描述的方法(Hemker HC, Giesen P, Al Dieri R 等人， Pathophysiol Haemost Thromb 2003 ;33 :4_15)，在配备有分配器的 Fluoroscan Ascent 荧光计(Thermolabsystems 0Y，Helsink，Finland)中测定凝血酶的产生。简言之， 将补充有盐(对照)或指定浓度的抗凝血剂磺达肝癸钠(fondaparinux) (Arixtra GlaxoSmithKline, Brentford，英国)和多种浓度的重组因子X衍生物的80 μ 1血浆分配到圆底96-孔微量滴定板中。含有TF(来自Dade Behring的重组脂质化人组织因子，Irmovin )和磷脂(PL)囊泡的20 μ 1混合物加入血浆样品中，以获得最终浓度 IpM TF和4 μ M PL囊泡。由L- α -磷脂酰-L-丝氨酸(PS)和L- α -磷脂酰胆碱(PC) (Avanti Polarlipids, Albaster，Alabama，美国)制备的具有 IOOnm 标称直径的 PL 囊泡 (PC PS, 3 1)通过膜挤出方法合成(01son，F.，Hunt，C.A.，Szoka，F.C.，Vail，W. J.和 Papahadjopoulos, D. (1979) Biochim Biophys Acta 557(1) ,9-23) 通过磷酸盐分析测定磷脂浓度。最后，通过添加含有荧光底物和CaCl2W 20 μ 1起动试剂触发凝血酶生成。荧光底物 I-1140 (Z-Gly-Gly-Arg-AMC)来自 Bachem AG (Bubendorf，瑞士)。在 37°C使用校正的自动凝血酶生成图(thrombogram)对凝结血浆中的凝血酶产生动力学进行监测60分钟， ^jtM Thrombinoscope (Thrombinoscope B. V. ， Maastricht, ^^ ) /f。每个实验需要三个孔，两个孔用于测定血浆样品的凝血酶生成，一个孔用于校正。所有实验重复进行三次，报告平均值。测定内源凝血酶能力(ETP)，即曲线下面积，峰值凝血酶和用于确定凝血酶检测的延迟时间。MM重组体野生型因子X的双相清除为研究因子X从血浆中的清除，将重组体野生型因子X静脉注射到小鼠体内。在注射后的指定时间点，给小鼠放血，并分析血浆的因子X抗原。抗原值随注射后时间变化的图示显示，野生型因子X通过双相清除从血中消除，其特征在于分别为43和305min的快速和缓慢半衰期(图6)。此外，计算出MRT为380min (表II)。表II 描述Wt-因子X及其变体从血浆的清除率和回收率的药代动力学参数。 N.A.=不适用。N.D.=未测定
权利要求
1.一种多肽，其包含SEQ ID NO 2的33到52位的氨基酸序列，其中在39位或49位的天冬酰胺是N-糖基化的。
2.权利要求1所述的多肽，其用于提高丝氨酸蛋白酶酶原的半衰期。
3.一种融合蛋白，含有-权利要求1所述的第一多肽，和-第二多肽，其包含SEQ ID NO 4的7到16位的氨基酸序列。
4.权利要求3所述的融合蛋白，其中所述第一多肽的羧基端区域与所述第二多肽的氨基端区域融合。
5.因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中所述蛋白质的天然激活肽由权利要求 3-4中任一项所述的融合蛋白取代。
6.权利要求5所述的因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中-对应于SEQ ID NO 1的235位残基的异亮氨酸被丙氨酸、丝氨酸或亮氨酸取代，和/或-对应于SEQ ID NO 1的236位残基的缬氨酸被苯丙氨酸或丙氨酸取代，和/或 -对应于SEQ ID NO 4的14位残基的甘氨酸被缬氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸取代，和/pt/ · 'τΛ ，-对应于SEQ ID NO 4的15位残基的缬氨酸被脯氨酸取代。
7.一种因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中所述蛋白质的天然激活肽被融合蛋白取代，所述融合蛋白含有-权利要求1所述的多肽，和-氨基酸序列SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6所定义的血纤维蛋白肽A凝血酶可裂解衍生物。
8.权利要求7所述的因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中所述多肽由氨基酸序列SEQ ID NO 2所定义。
9.权利要求7-8任一项所述的因子X的嵌合凝血酶可裂解衍生物，其中所述血纤维蛋白肽A凝血酶可裂解衍生物由选自SEQ ID NO 7, SEQ ID NO :8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO 11和SEQ ID NO :12的氨基酸序列所定义。
10.权利要求7-9任一项所述的因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中 -所述多肽由氨基酸序列SEQ ID NO 2所定义，和-所述血纤维蛋白肽A凝血酶可裂解衍生物由氨基酸序列SEQ ID NO :7所定义。
11.一种蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中所述蛋白质的天然激活肽由权利要求3-4中任一项所述的融合蛋白取代。
12.权利要求11所述的蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中-对应于SEQ ID NO 3的212位残基的亮氨酸被丙氨酸或丝氨酸取代；和/或 -对应于SEQ ID NO 3的213位残基的异亮氨酸被苯丙氨酸取代；和/或 -对应于SEQ ID NO 3的214位残基的天冬氨酸被甘氨酸取代；和/或 -对应于SEQ ID NO 4的14位残基的甘氨酸被缬氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸取代；和/或-对应于SEQ ID NO 4的15位残基的缬氨酸被脯氨酸取代。
13.一种蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中所述蛋白质的天然激活肽被融合蛋白取代，所述融合蛋白含有-权利要求1所述的多肽，和-由氨基酸序列SEQ ID N0:13或SEQ ID NO :14定义的血纤维蛋白肽A凝血酶可裂解衍生物。
14.权利要求13所述的蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中所述多肽由氨基酸序列SEQ ID NO 2所定义。
15.权利要求13-14任一项所述的蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中所述血纤维蛋白肽A凝血酶可裂解衍生物由选自SEQ ID NO 15, SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、 SEQ ID NO :18,SEQ ID NO :19,SEQ ID NO :20,SEQ ID N0:21、SEQ ID NO :22,SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25 或 SEQ ID NO :26 的氨基酸序列定义。
16.权利要求13-15任一项所述的蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中 -所述多肽由氨基酸序列SEQ ID NO :2定义，和-所述血纤维蛋白肽A凝血酶可裂解衍生物由氨基酸序列SEQ ID N0:15定义。
17.一种因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其含有激活的因子X或其功能保守的变体和权利要求3-4任一项所述的融合蛋白。
18.权利要求17所述的因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中所述融合蛋白与激活的因子X或其功能保守的变体的重链氨基末端融合。
19.权利要求17-18任一项所述的因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中-对应于SEQ ID NO 1的235位残基的异亮氨酸被丙氨酸、丝氨酸或亮氨酸取代；和/或-对应于SEQ ID NO 1的236位残基的缬氨酸被苯丙氨酸或丙氨酸取代；和/或 -对应于SEQ ID NO 4的14位残基的甘氨酸被缬氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸取代；和/或-对应于SEQ ID NO 4的15位残基的缬氨酸被脯氨酸取代。
20.一种蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其含有激活的蛋白C或其功能保守的变体和权利要求3-4任一项所述的融合蛋白。
21.权利要求20所述的蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中所述融合蛋白与激活的因子X或其功能保守的变体的重链氨基末端融合。
22.权利要求20-21任一项所述的蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中 -对应于SEQ ID NO 3的212位残基的亮氨酸被丙氨酸或丝氨酸取代；和/或 -对应于SEQ ID NO 3的213位残基的异亮氨酸被苯丙氨酸取代；和/或-对应于SEQ ID NO 3的214位残基的天冬氨酸被甘氨酸取代；和/或 -对应于SEQ ID NO 4的14位残基的甘氨酸被缬氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸取代；和/或-对应于SEQ ID NO 4的15位残基的缬氨酸被脯氨酸取代。
23.一种核酸分子，其编码权利要求5-16任一项所述的嵌合的凝血酶可裂解衍生物。
24.权利要求5-10和17-19任一项所述的因子X的嵌合衍生物，用于出血型的凝血病症的预防或治疗。
25.权利要求M所述的因子X的嵌合衍生物，用于A或B型血友病的预防或治疗。
26.权利要求11-16和20-22任一项所述的蛋白C的嵌合衍生物，用于涉及高凝性的病症的预防或治疗。
27.权利要求沈所述的蛋白C的嵌合衍生物，用于血栓症的预防或治疗。
28.用于预防或治疗凝血障碍的药物组合物，其包含权利要求5-22任一项所述的嵌合衍生物。
29.一种融合蛋白，其含有-权利要求1所述的第一多肽，和-含有SEQ ID NO 4的7到16位的氨基酸序列的第二多肽，其中-对应于SEQ ID NO :4的14位残基的甘氨酸被缬氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸取代，和/或-对应于SEQ ID NO 4的15位残基的缬氨酸被脯氨酸取代。
30.权利要求四所述的融合蛋白，其中所述第一多肽的羧基端区域与第二多肽的氨基端区域融合。
31.权利要求5-10和17-19任一项所述的因子X的嵌合衍生物，用于预防或治疗由低分子量肝素(LMWH)或由靶向因子fe的抗凝血剂引发的出血的方法中。
32.权利要求31所述的因子X的嵌合衍生物，其中所述因子X的嵌合衍生物的对应于 SEQ ID NO 1的419位残基的丝氨酸被丙氨酸取代。
33.权利要求32所述的因子X的嵌合衍生物，其中所述因子X嵌合衍生物的分别对应于SEQ ID NO 1的387和391位残基的精氨酸和赖氨酸被丙氨酸取代。
34.一种融合蛋白，其含有-权利要求1所述的第一多肽，和-目标蛋白质。
35.权利要求34所述的融合蛋白，其中所述目标蛋白质是一种循环蛋白。
全文摘要
本发明涉及丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物，其含有用于提高所述衍生物的半衰期的因子X的激活肽或其片段。优选地，所述嵌合衍生物是蛋白C和因子X衍生物。本发明也涉及用于预防或治疗凝血功能障碍的所述衍生物。
文档编号C07K19/00GK102325880SQ200980157388
公开日2012年1月18日 申请日期2009年12月21日 优先权日2008年12月19日
发明者保罗·盖冈, 吉莱纳·谢雷尔, 塞西尔·德尼, 奥利弗·克里斯托夫 申请人:国家健康与医学研究院