肌生成抑制素结合蛋白的制作方法

专利名称：肌生成抑制素结合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及与肌生成抑制素(myosatin)结合的抗原结合蛋白例如抗体、编码所述抗原结合蛋白的多核苷酸、包含所述抗原结合蛋白的药物组合物和制备方法。本发明亦涉及所述抗原结合蛋白在治疗或预防与降低肌肉质量、肌肉力量和肌肉功能中的任一种或组合有关的疾病的用途。
背景技术：
肌生成抑制素亦称为生长和分化因子(⑶F-8)，是转化生长因子-β (TGF-β)超家族的成员，是肌肉质量的负调节物。肌生成抑制素在进化过程中高度保守，人、鸡、小鼠和大鼠序列在成熟C-末端结构域为100%相同。肌生成抑制素作为前体蛋白合成，所述前体蛋白含有信号序列、前肽结构域和C-末端结构域。分泌的肌生成抑制素的循环形式包括活性成熟C-末端结构域和无活性形式，所述无活性形式包含在与前肽结构域和/或其它抑制蛋白相关的潜在复合物中的成熟C-末端结构域。有多种与降低肌肉质量、肌肉力量和肌肉功能相关的不同疾病、病症和病况。增加锻炼和较好的营养是用于治疗所述疾病的目前疗法的支柱。很遗憾，由于患者方面不能坚持和顺从，增加身体活动的益处很少被认识到。对于某些患者锻炼亦可能困难、疼痛或办不到。此外，可能存在与锻炼有关的肌肉用力不足而不能对肌肉产生任何有益作用。营养介入只有在隐含饮食缺陷且患者有恰当的食欲时有效。由于这些限制，对于与肌肉质量、肌肉力量和肌肉功能中的任一种或组合降低相关的疾病的治疗，基本上不能满足获得更广泛利益的需求。业已阐述肌生成抑制素抗体(W02008/030706、WO 2007/047112、WO 2007/044411、WO 2006/116269、WO 2005/094446、WO 2004/037861、WO 03/027248 和 WO 94/21681)。Wagner 等(Ann Neurol. (2008)63(5) :561-71)亦阐述当用所述抗-肌生成抑制素抗体之一时，未改善成年人肌营养不良症(贝克型肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症和肢节型肌营养不良症)中肌肉力量或功能的探索性终点。因此，仍然需要用于治疗或预防与肌肉质量、肌肉力量和肌肉功能中的任一种或组合降低相关的疾病的更有效疗法。发明简述本发明提供与肌生成抑制素特异性结合的抗原结合蛋白。所述抗原结合蛋白可用于治疗或预防与降低肌肉质量、肌肉力量和肌肉功能中的任一种或组合相关的疾病。本发明提供与肌生成抑制素特异性结合的抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO 3的 CDRH3 或变体 CDRH3。本发明亦提供与肌生成抑制素特异性结合的抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO 7 的可变结构域序列的对应CDRH3或其变体CDRH3。 本发明亦提供与肌生成抑制素特异性结合的抗原结合蛋白，其包括包含SEQ ID
NO 7的95-101位Kabat残基的结合单位H3或变体H3。 本发明亦提供与肌生成抑制素特异性结合的抗原结合蛋白，其包含
⑴选自SEQ ID NO :7或SEQ ID NO 25的重链可变区；禾口 /或选自SEQ ID NO 8 或SEQ ID NO :21的轻链可变区；或具有75%或更高序列同一性的变体重链可变区或轻链可变区；或(ii) SEQ ID NO 26 重链；禾口 / 或选自 SEQ ID NO 27 或 SEQ ID NO 37 的轻链；或具75%或更高序列同一性的变体重链或轻链。本发明亦提供与肌生成抑制素特异性结合的抗原结合蛋白，其包含(i)选自SEQ ID NO 12、13或14中任一种的重链可变区；和/或选自SEQ ID NO: 15、16、17、18或M中任一种的轻链可变区；或具75%或更高序列同一性的变体重链可变区或轻链可变区；或(ii)选自SEQ ID NO :28、四、30、98或99中任一种的重链；和/或选自SEQ ID NO: 31、32、33、34或40中任一种的轻链；或具75%或更高序列同一性的变体重链或轻链。本发明亦提供编码本文所定义的抗原结合蛋白的核酸分子。本发明亦提供包含本文所定义的核酸分子的表达载体。本发明亦提供包含本文所定义的表达载体的重组宿主细胞。本发明亦提供用于制备本文所定义的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括培养如上所定义的宿主细胞和回收抗原结合蛋白的步骤。本发明亦提供包含本文所定义的抗原结合蛋白和药用载体的药物组合物。本发明亦提供治疗罹患降低肌肉质量、肌肉力量和/或肌肉功能的疾病的受试者的方法，所述方法包括给予本文所定义的抗原结合蛋白的步骤。本发明提供治疗罹患以下疾病的受试者的方法少肌症(sarcopenia)、恶病质、 肌肉萎缩、废用性肌肉萎缩、HIV、AIDS、癌症、外科手术、烧伤、肌肉骨头或神经创伤或损伤、 肥胖症、糖尿病(包括II型糖尿病)、关节炎、慢性肾衰竭(CRF)、末期肾病(ESRD)、充血性心力衰竭(CHF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、选择性关节修复(elective joint repair), 多发性硬化病(MQ、中风、肌营养不良症(muscular dystrophy)、运动神经元神经病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、帕金森氏病、骨质疏松症、骨关节炎、脂肪酸肝病(fatty acid liver disease)、肝硬化、阿狄森病(Addison，s disease)、库欣病(Cushing，s diease)、急性呼吸窘迫综合征、类固醇诱导的肌肉萎缩、肌炎或脊柱侧凸，所述方法包括给予本文所述抗原结合蛋白的步骤。本发明提供在受试者中增加肌肉质量、增加肌肉力量和/或改进肌肉功能的方法，所述方法包括给予本文所定义的抗原结合蛋白的步骤。本发明提供本文所述抗原结合蛋白用于治疗罹患降低肌肉质量、肌肉力量和肌肉功能中任一种或组合的疾病的受试者。本发明提供本文所述抗原结合蛋白在治疗以下疾病中的用途少肌症、恶病质、肌肉萎缩、废用性肌肉萎缩、HIV、AIDS、癌症、外科手术、烧伤、肌肉骨头或神经创伤或损伤、肥胖症、糖尿病(包括II型糖尿病)、关节炎、慢性肾衰竭(CRF)、末期肾病(ESRD)、充血性心力衰竭(CHF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、选择性关节修复、多发性硬化病(MQ、中风、肌营养不良症、运动神经元神经病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、帕金森氏病、骨质疏松症、骨关节炎、脂肪酸肝病、肝硬化、阿狄森病、库欣氏肌肉萎缩、肌炎或脊柱侧凸。本发明提供本文所述抗原结合蛋白在受试者中增加肌肉质量、增加肌肉力量和/ 或改进综合征、急性呼吸窘迫综合征、类固醇诱导的肌肉功能的方法中的用途。
本发明提供本文所述抗原结合蛋白在制备用于治疗罹患降低肌肉质量、肌肉力量和肌肉功能中任一种或组合的疾病的受试者的药物中的用途。本发明提供本文所述抗原结合蛋白在制备用于治疗以下疾病的药物中的用途少肌症、恶病质、肌肉萎缩、废用性肌肉萎缩、HIV、AIDS、癌症、外科手术、烧伤、肌肉骨头或神经创伤或损伤、肥胖症、糖尿病(包括II型糖尿病)、关节炎、慢性肾衰竭(CRF)、末期肾病 (ESRD)、充血性心力衰竭(CHF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、选择性关节修复、多发性硬化病 (MS)、中风、肌营养不良症、运动神经元神经病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、帕金森氏病、骨质疏松症、骨关节炎、脂肪酸肝病、肝硬化、阿狄森病、库欣氏肌肉萎缩、肌炎或脊柱侧凸。本发明提供本文所述抗原结合蛋白在制备用于在受试者中增加肌肉质量、增加肌肉力量和/或改进综合征、急性呼吸窘迫综合征、类固醇诱导的肌肉功能的方法的药物中的用途。附图简述

图1显示纯化的成熟肌生成抑制素的LC/MS分析预测的分子量(MW) 12406. 25Da, 观察到的MW 24793. 98Da，这表明含9对二硫键的二聚体化分子与含9个半胱氨酸残基的预测的肌生成抑制素单体匹配。图2显示含MOPS缓冲液的4-12% NuPAGE Bis-Tris凝胶。第1道用DTT还原的成熟肌生成抑制素。第2道不用DTT的非还原性成熟肌生成抑制素。第3道:Mark 12 蛋白质标准品。图3A显示剂量反应曲线，其显示了肌生成抑制素(R&D Systems和内部(in house)肌生成抑制素种类)诱导的细胞信号转导的激活，这导致6小时后在A204细胞中以剂量依赖方式表达荧光素酶。图3B显示剂量反应曲线，其显示了内部肌生成抑制素诱导的细胞信号转导的激活，这导致于不同测试时刻在A204细胞中以剂量依赖方式表达荧光素酶，其由在不同天数所获得的数据来表示。图4显示通过ELISA测定的10B3与成熟肌生成抑制素、潜在复合物(latent complex)和从潜在复合物释放的成熟肌生成抑制素的结合。图5显示10B3和10B3嵌合体对肌生成抑制素结合ActRIIb的抑制。图6显示10B3和10B3嵌合体抑制肌生成抑制素诱导的细胞信号转导的激活，这导致降低A204细胞中的荧光素酶表达。图7显示10B3在体内对小鼠体重(A)和瘦肉质量⑶的影响。图8显示10B3在体内对小鼠腓肠肌(A)、四头肌⑶和趾长伸肌(EDL) (C)肌肉质
量的影响。图9显示10B3对离体EDL肌肉收缩性的影响，其显示强直性张力(A)和通过肌肉质量校正的强直性张力(B)。图IOA显示通过ELISA测定的人源化的抗-肌生成抑制素抗体变体(在CHOKl上清液中)和10B3C与肌生成抑制素结合。图IOB源自图10A，显示含有H2和/或L2链及 10B3嵌合体的抗体。图11显示通过ELISA测定的纯化的H0L0、H1L2和H2L2人源化的抗-肌生成抑制素抗体变体和10B3C与肌生成抑制素结合。图12显示10B3、10B3C、H0L0和H2L2抑制肌生成抑制素-诱导的细胞信号转导的激活，其导致在A204细胞中表达荧光素酶。图 13 显示通过 ELISA 测定的纯化的 H2L2-NMD、H2L2-N54Q, H2L2-C91S、 H2L2-N54D-C91S和H2L2-NMQ-C91S人源化的抗-肌生成抑制素抗体变体、H2L2和 10B3C (HCLC)与肌生成抑制素结合。图 14 显示通过 ELISA 测定的纯化的 H2L2-NMQ、H2L2-C91S、H2L2_NMQ-C91S 人源化的抗-肌生成抑制素抗体变体、H2L2、HOLO和10B3C (HCLC)与肌生成抑制素结合。图15显示H2L2-NMQ、H2L2-C91S、H2L2-NMQ-C91S人源化的抗-肌生成抑制素抗体变体、H0L0、H2L2和10B3C对肌生成抑制素-诱导的细胞信号转导激活的抑制，其导致在 A204细胞中表达荧光素酶。图16显示在用或不用碳酸氢铵处理抗体后H2L2人源化的抗-肌生成抑制素抗体与肌生成抑制素的结合，所述碳酸氢铵处理可诱导抗体脱酰胺。图17显示在用或不用碳酸氢铵处理抗体后H2L2-N54Q人源化的抗-肌生成抑制素抗体变体与肌生成抑制素的结合，所述碳酸氢铵处理可诱导抗体脱酰胺。图18显示在用或不用碳酸氢铵处理抗体后H2L2-C91S人源化的抗-肌生成抑制素抗体变体与肌生成抑制素的结合，所述碳酸氢铵处理可诱导抗体脱酰胺。图19显示在用或不用碳酸氢铵处理抗体后H2L2-NMQ-C91S人源化的抗-肌生成抑制素抗体变体与肌生成抑制素的结合，所述碳酸氢铵处理可诱导抗体脱酰胺。图20显示在用或不用碳酸氢铵处理抗体后HOLO人源化的抗-肌生成抑制素抗体与肌生成抑制素的结合，所述碳酸氢铵处理可诱导抗体脱酰胺。图21显示在肌生成抑制素捕获ELISA中11种亲和纯化的⑶RH3变体的结合活性； H2L2-C91S、HOLO, HcLc (10B3嵌合体)和阴性对照单克隆抗体(用作对照抗体)。图22显示在肌生成抑制素结合ELISA中5种亲和纯化的⑶RH2变体的的结合活性；H2L2-C91S_F100G_Y、H2L2-C91S、HcLc (10B3嵌合体)和阴性对照单克隆抗体(用作对照抗体)。图23显示在第0天-第25天10B3和对照抗体治疗对荷有C46肿瘤的小鼠体重的影响。图M显示10B3和对照抗体治疗对荷有C46肿瘤的小鼠的总身体脂肪(A)、附睾脂肪垫⑶和瘦肉质量(C)的影响。图25显示10B3和对照抗体治疗对下肢肌肉力量的影响，其通过电刺激荷有C46 肿瘤的小鼠大腿中区的坐骨神经时的收缩力来测量。图沈显示在假手术和割腱手术中10B3和对照抗体治疗对小鼠胫骨前肌(TA)肌肉的影响。发明详述本发明提供与肌生成抑制素例如同型二聚体成熟肌生成抑制素特异性结合的抗原结合蛋白。抗原结合蛋白可结合并中和肌生成抑制素，例如人肌生成抑制素。抗原结合蛋白可为抗体，例如单克隆抗体。肌生成抑制素和⑶F-8 二者都指以下任何一种肌生成抑制素的全长未经加工的前体形式；呈潜在及非潜在(活性)形式的成熟肌生成抑制素，其因翻译后裂解C-末端结构域而产生。术语肌生成抑制素亦指保留与肌生成抑制素有关的一种或多种生物学活性的肌生成抑制素的任何片段和变体。肌生成抑制素的全长未经加工的前体形式包含前肽及形成成熟蛋白质的C-末端结构域，含或不含信号序列。亦已知肌生成抑制素前肽加C-末端结构域为多蛋白。肌生成抑制素前体可作为单体或同型二聚体存在。成熟肌生成抑制素为从肌生成抑制素前体蛋白的C-末端裂解的蛋白，亦称为 C-末端结构域。成熟的肌生成抑制素可作为单体、同型二聚体或以肌生成抑制素潜在复合物存在。成熟的肌生成抑制素可视条件而确立这些不同的形式组合之间的平衡。人、鸡、小鼠和大鼠肌生成抑制素的成熟C-末端结构域序列具有100%的同一性(参见例如SEQ ID NO :104)。在一个实施方案中，本发明抗原结合蛋白与SEQ ID NO :104中所示的同型二聚体成熟肌生成抑制素结合。肌生成抑制素前肽为从切割信号序列后的肌生成抑制素前体蛋白的N-末端结构域切割的多肽。前肽亦称为潜在相关肽(latency-associated peptide, LAP) 0肌生成抑制素前肽能够与成熟肌生成抑制素上的前肽结合结构域非共价结合。人前肽肌生成抑制素序列的实例提供在SEQ ID NO :108中。肌生成抑制素潜在复合物为在成熟肌生成抑制素与肌生成抑制素前肽或其它肌生成抑制素结合蛋白之间形成的蛋白复合物。例如，两个肌生成抑制素前肽分子可与两个成熟肌生成抑制素分子缔合，形成无活性的四聚体潜在复合物。肌生成抑制素潜在复合物可包括代替肌所述生成抑制素前肽中的一个或两个的其它肌生成抑制素结合蛋白，或除所述肌生成抑制素前肽中的一个或两个之外还包括其它肌生成抑制素结合蛋白。其它肌生成抑制素结合蛋白实例包括促滤泡素抑制素(follistatin)、促滤泡素抑制素相关基因 (FLRG)和生长及分化因子相关血清蛋白1 (GASP-I)。肌生成抑制素抗原结合蛋白可结合肌生成抑制素的前体形式、成熟形式、单体形式、二聚体形式、潜在形式和活性形式中的任一种或任意组合。抗原结合蛋白可结合呈其单体和/或二聚体形式的成熟肌生成抑制素。当肌生成抑制素为与前肽和/或促滤泡素抑制素的复合物时，抗原结合蛋白可与其结合或不与其结合。或者，当肌生成抑制素为与促滤泡素抑制素相关基因(FLRG)和/或生长和分化因子相关血清蛋白I(GASP-I)的复合物时，抗原结合蛋白可与其结合或不与其结合。例如，抗原结合蛋白与成熟二聚体肌生成抑制素结合。本文所用术语"抗原结合蛋白"指能够与肌生成抑制素结合的抗体、抗体片段和其它蛋白构建体，例如结构域。本文所用术语"抗体"以其最广泛的意义指具有免疫球蛋白样结构域的分子，并包括单克隆抗体、重组抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体和异源缀合物抗体；单可变结构域、结构域抗体、抗原结合片段、免疫学有效片段、单链Fv、双抗体、 Tandabs 等(对于可供选择的〃抗体〃样式的综述，参见Holliger和Hudson，Nature Biotechnology，2005，第 23 卷，第 9 期，1126-1136)。短语"单可变结构域"指抗原结合蛋白可变结构域(例如VH、VHH、\)，其可特异性结合抗原或结合独立于不同的可变区或结构域的表位。可认为"结构域抗体"或"dAb"与"单可变结构域"相同，其能够结合抗原。单可变结构域可为人抗体可变结构域，但亦包括来自其它物种的单抗体可变结构域，例如啮齿动物(例如如WO 00/29004中所揭示)、绞口鲨(nurse shark)和骆驼科(Camelid) Vhh dAb。骆驼科源自包括骆驼、美洲驼(llama)、羊驼(alpaca)、单峰骆驼(dromedary)和原驼(guanaco)在内的物种的免疫球蛋白单可变结构域多肽，所述物种产生天然缺乏轻链的重链抗体。所述Vhh结构域可按照本领域可获得的标准技术人源化，认为所述结构域为“ 结构域抗体"。本文所用Vh包括骆驼科Vra结构域。本文所用术语"结构域"指具有独立于蛋白质的其余部分的四级结构的折叠蛋白质结构。结构域通常负责蛋白质的不相关联的功能性质，在很多情况下可将其加入、移走或转移到其它蛋白质，而不丢失蛋白质和/或结构域的其余部分的功能。“单可变结构域"为包含抗体可变结构域序列特性的折叠多肽结构域。因此，其包括完全抗体可变结构域和经修饰的可变结构域，例如，其中一个或多个环被以下序列取代不具有抗体可变结构域特性的序列；或业已被截平或包含N-或C-末端延伸的抗体可变结构域；以及保留至少全长结构域的结合活性和特异性的可变结构域的折叠片段。结构域可结合抗原或结合独立于不同的可变区或结构域的表位。可借助在非抗体蛋白质支架例如结构域上安排一个或多个CDR来提供抗原结合片段。非抗体蛋白质支架或结构域为经过蛋白质工程改造以获得与不同于其天然配体的配体结合的蛋白质支架或结构域，例如作为选自以下的支架的衍生物的结构域 CTLA-4(Evibody)；脂笼蛋白(lipocalin)；源自蛋白A的分子例如蛋白A的Z-结构域 (Affibody, SpA)、A-结构域(Avimer/Maxibody)；热休克蛋白例如 GroEl 和 GroES ；转铁蛋白(穿膜抗体(transbody))；锚蛋白重复蛋白(DARPin)；肽适体；C-型凝集素结构域(四连接素(Tetranectin))；人Y -晶体蛋白和人泛素(affilins) ；PDZ结构域；人蛋白酶抑制剂的蝎毒素kimitz型结构域；和纤连蛋白(adnectin)；它们业已经过蛋白质工程改造以实现与不同于其天然配体的配体结合。CTLA-4 (细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)为主要在⑶4+T细胞上表达的⑶观-家族受体。其胞外结构域具有可变结构域样Ig折叠。对应于抗体CDR的环可被异源序列取代，以提供不同的结合特性。工程改造为具有不同的结合特异性的CTLA-4分子亦被称为 Evibodies。进一步的详细资料参见 Journal of Immunological Methods 248(1-2)， 31-45(2001)。脂笼蛋白为运输小疏水分子(例如类固醇、后胆色素、类视黄醇和脂类)的细胞外蛋白质家族。它们具有在规范结构(canonical structure)的开放末端有多个环的刚性β-折叠二级结构，可将其工程改造以结合不同的靶标抗原。Anticalin大小为160-180 个氨基酸，源自脂笼蛋白。关于进一步的详细资料参见Biochim Biophys Acta 1482 337-350(2000)、US7250297B1和 US20070224633。Affibody是源自金黄色葡萄球菌蛋白A的支架，可将其进行工程改造以结合抗原。结构域由大约58个氨基酸的3个螺旋束组成。通过让表面残基随机化产生文库。关于进一步的详细资料参见 Protein Eng. Des. Sel. 17,455-462(2004)和 EP1641818A1。Avimer是源自A-结构域支架家族的多结构域蛋白。大约35个氨基酸的天然结构域采取限定的二硫化物键合的结构。通过A-结构域家族展示的天然变异穿梭来产生多样性。关于进一步的详细资料参见 Nature Biotechnology 23 (12)，1556-1561 (2005)和 Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917(2007 年 6 月)。
转铁蛋白为单体血清转运糖蛋白。可通过在容许的表面环插入例如一个或多个 CDR肽序列，将转铁蛋白进行工程改造以结合不同的靶标抗原。工程改造的转铁蛋白支架实例包括穿膜抗体。关于进一步的详细资料参见J. Biol. Chem 274，24066-24073 (1999)。设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)源自介导完整膜蛋白与细胞骨架连接的蛋白质家族的锚蛋白。单锚蛋白重复为由两个α-螺旋和β-转角组成的33个残基模体。可通过以下方法对其进行工程改造以结合不同的靶标抗原使每一个重复的第一个α-螺旋和转角处的残基随机化；或插入肽序列，例如一个或多个CDR。可通过增加模块数量来增加其结合界面(亲和力成熟的方法)。关于进一步的详细资料参见J. Mol. Biol. 332， 489-503 (2003)、PNAS 100(4)，1700-1705 (2003)和 J. Mol. Biol. 369，1015-1028 (2007)和 US20040132028A1。纤连蛋白为可进行工程改造以结合抗原的支架。Adnectin由人纤连蛋白III型 (FN3)的15个重复单位的第10个结构域的天然氨基酸序列骨架组成。可对β-夹层的一端的三个环进行工程改造以使Adnectin特异性识别目的治疗靶标。关于进一步的详细资料参见 Protein Eng. Des. Sel. 18,435-444(2005)、US20080139791、W02005056764 和 US6818418B1。肽适体是由恒定支架蛋白组成的组合型的识别分子，其通常为含有在活性位点插入的限定的可变肽环的硫氧还蛋白(TrxA)。关于进一步的详细资料参见Expert Opin. Biol. Ther. 5，783-797(2005)。微抗体源自天然存在的25-50个氨基酸长的微蛋白，其含有3-4半胱氨酸桥；微蛋白质实例包括KalataBl和芋螺毒素和打结素(knottin)。微蛋白具有可工程改造以包括至多25个氨基酸而不影响所述微蛋白的总折叠的环。关于工程改造的打结素结构域的进一步的详细资料参见W02008098796。其它结合结构域包括一直用作工程改造不同靶标抗原结合特性的支架的蛋白质， 所述蛋白质包括人Y-晶体蛋白和人泛素(affilins)、人蛋白酶抑制剂的knuitz型结构域、Ras结合蛋白AF-6的PDZ-结构域、蝎毒素(卡律蝎毒素)、C-型血凝素结构域(四连接素)，它们在 Handbook of Therapeutic Antibodies Q007，由 Stefan Dubel 编辑)和 Protein Science 15 :14-27 Q006)的第7章非抗体支架中综述。本发明结合结构域可源自任何这些备选蛋白质结构域和移植到所述结构域上的本发明⑶R的任何组合。抗原结合片段或免疫学有效片段可包含部分重链或轻链可变序列。片段为至少5、 6、8或10个氨基酸长。或者，片段为至少15、至少20、至少50、至少75或至少100个氨基酸长。本说明书通篇所用与抗原结合蛋白有关的术语"特异性结合"，意即抗原结合蛋白与肌生成抑制素结合，且不结合或不显著结合其它(例如不相关)蛋白。然而，该术语不排除所述抗原结合蛋白亦可与亲缘关系相近的分子(例如生长和分化因子-11)交叉反应这一事实。本文所述抗原结合蛋白可按为结合亲缘关系相近的分子例如GDF-Il的亲和力的至少2、5、10、50、100或1000倍来结合肌生成抑制素。抗原结合蛋白-肌生成抑制素相互作用的结合亲和力或平衡解离常数(Kd)可为 IOOnM或更小、IOnM或更小、2nM或更小或InM或更小。或者，Kd可为5_10nM之间；或1_2ηΜ 之间。Kd可为1ρΜ-500ρΜ之间；或500pM-lnM之间。
通过结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd) (KD = kd/ka)来测定抗原结合蛋白的结合亲和力。可通过BIAcore ，例如通过用由伯胺偶联偶联在CM5芯片上的肌生成抑制素来进行抗原捕获并将抗体捕获到该表面，来测量结合亲和力。可将实施例2. 3中阐述的 BIAcore 方法用于测量结合亲和力。或者，可通过FORTCbio，例如通过用由伯胺偶联偶联在CM5针上的肌生成抑制素来进行抗原捕获并将抗体捕获到该表面，来测量结合亲和力。 可将实施例5. 1中所述的FORTCbio方法用于测量结合亲和力。然而，由于本发明抗原结合蛋白与肌生成抑制素的结合特性，可将结合亲和力用于等级评定的目的。kd可为IxlO-3S-1或更小、ΙχΙΟΛΓ1或更小或lxlOY1或更小。kd可在 ΙχΚΤ ^-ΙχΙΟΛΓ1之间；或在lxK^f-lxKTY1之间。缓慢的kd可导致抗原结合蛋白-配体复合物慢解离，并配体中和改进。本说明书通篇所用术语"中和"，意即与缺乏抗原结合蛋白时的肌生成抑制素的活性比较，在本文所述抗原结合蛋白存在下，体外或体内肌生成抑制素的生物学活性降低了。中和可因以下原因中的一种或多种而产生阻断肌生成抑制素与其受体的结合；防止肌生成抑制素激活其受体；下调肌生成抑制素或其受体；或影响效应功能。中和可由于封阻肌生成抑制素与其受体结合并因此防止肌生成抑制素激活其受体而产生。肌生成抑制素活性包括与活性肌生成抑制素有关的生长、调节和形态发生活性中的一种或多种，例如调节肌肉质量、肌肉力量和肌肉功能。与活性肌生成抑制素有关的另外的活性可包括调节肌纤维数量、肌纤维大小、肌肉再生、肌肉纤维变性、成肌细胞增殖率、 肌分化；卫星细胞激活、卫星细胞增殖、卫星细胞自我更新；参与肌肉生长和功能的蛋白质的合成或分解。所述肌肉可为骨骼肌。生物学活性的降低或抑制可为部分或全部。相对于在缺乏抗原结合蛋白时的肌生成抑制素的活性，中和抗原结合蛋白可中和肌生成抑制素活性至少20% JO^dO^jO^、 55%,60%,65%,70%,75%,80%,82%,84%,86%,88%,90%,92%,94%,95%,96%, 97^^98^^99%或100%。在功能测定(例如以下所述中和测定)中，IC5tl是降低生物学反应最大值的50%的浓度。用技术人员已知或本文所述的一种或多种测定可测定或测量中和。例如，可在三明治ELISA中通过BIAc0reTM、FMAT、FORTCbi0TM或相似体外测定例如表面等离子共振，来评估抗原结合蛋白与肌生成抑制素的结合。可通过在抗原结合蛋白存在下测量肌生成抑制素与固定在板上的可溶性ActRIIb 受体的结合，将基于ELISA的受体结合测定用于测定抗原结合蛋白的中和活性(更详细资料参见实施例2. 5)。受体中和测定是灵敏的方法，其可用于基于效价区分IC50低于InM的分子。然而，其本身对有结合能力的生物素化肌生成抑制素的精确浓度敏感。因此，可获得介于 0. 1ηΜ-5ηΜ 范围的 IC50 值，例如 0. 1ηΜ_3ηΜ 或 0. 1ηΜ_2ηΜ 或 0. InM-InM 范围。或者，可通过测量对受体结合、下游信号转导和基因激活的抑制，将基于细胞的受体结合测定用于测定抗原结合蛋白的中和活性。例如，可通过其在横纹肌肉瘤细胞(A204) 中抑制肌生成抑制素-诱导的荧光素酶活性的能力，来确定抗原结合蛋白的中和，所述横纹肌肉瘤细胞用在PAI-I特异性启动子调控下编码荧光素酶基因的构建体转染，本测定亦称为肌生成抑制素响应报告基因测定(关于更详细资料参见实施例1. 2)。可在显示肌肉质量、肌肉力量和肌肉功能中的任一种或组合变化的动物中用多种不同测定来确定体内中和。例如，可将体重、肌肉质量(例如瘦肉质量)、肌肉收缩性(例如强直性张力)、握力、动物悬空自己的能力和游泳测定，单独或以任何组合用于评估肌生成抑制素抗原结合蛋白的中和活性。例如可测定以下肌肉的肌肉质量腓肠肌、四头肌、三头肌、趾长伸肌(EDL)、胫骨前肌(TA)和比目鱼肌。本领域技术人员显然明白，术语"起源"意欲不仅从来源意义上界定所述材料的身体来源，而且界定在结构上与所述材料一样但并不是来源于参考来源的材料。因此"在供体抗体中存在的残基"不必一定纯化自供体抗体。分离意指分子例如抗原结合蛋白被从其可实际存在的环境中移出。例如，所述分子可从其实际上正常存在的物质中纯化。例如，抗原结合蛋白可被纯化为关于含有抗原结合蛋白的培养基至少95%、96%、97%、98%或99%或更高。“嵌合抗体"指工程抗体类型，其含有与源自受体抗体的轻链和重链恒定区缔合的源自供体抗体的天然存在的可变区(轻链和重链)。“人源化的抗体"指工程抗体类型，其具有源自非人供体免疫球蛋白的一个或多个CDR，所述分子的源自免疫球蛋白的其余部分源自一个或多个人免疫球蛋白。另外， 可改变构架支撑残基以保留结合亲和力(参见例如Queen等Natl Acad Sci USA, 86 :10029-10032(1989), Hodgson 等 Bio/technology，9 :421 (1991))。合适的人受体抗体可为通过与供体抗体的核苷酸及氨基酸序列的同源性选自以下常规数据库的一种例如 KABAT 数据库、Los Alamos数据库和Swiss Protein数据库。特征为与供体抗体构架区同源(基于氨基酸)的人抗体，可适宜地提供重链恒定区和/或重链可变构架区用于插入供体CDR。可按相似的方式选择能够贡献轻链恒定或可变构架区的合适的受体抗体。应该注意，受体抗体重链和轻链不必源自同一个受体抗体。现有技术阐述了产生所述人源化的抗体的几种方式,参见例如EP-A-0239400和EP-A-0M951。术语"供体抗体"指将其可变区、一个或多个CDR或其它功能片段或其类似物的氨基酸序列贡献给初始免疫球蛋白伴侣的抗体。因此，供体提供改变的免疫球蛋白编码区， 得到具有供体抗体的抗原特异性和中和活性特点的表达的改变的抗体。术语"受体抗体"指与供体抗体异源的抗体，其将编码其重链和/或轻链构架区和/或其重链和/或轻链恒定区的氨基酸序列的全部(或任何部分)贡献给初始免疫球蛋白伴侣。人抗体可为受体抗体。本文所用术语"Vh"和"分别指抗原结合蛋白的重链可变区和轻链可变区。“ OTR"定义为抗原结合蛋白的互补决定区氨基酸序列。这些是免疫球蛋白重链和轻链的高可变区。在免疫球蛋白的可变部分有3个重链和3个轻链CDR (或CDR区)。因此，本文所用“CDR"指所有3个重链CDR、所有3个轻链CDR、所有重链和轻链CDR或至少两个⑶R。除非另外规定，否则在本说明书中通篇按照Kabat编号规则来对可变结构域序列和全长抗体序列的氨基酸残基进行编号。同样地，实施例中所用术语"OTR"、“⑶RL 1"、” CDRL2"、” CDRL3"、” CDRHl “、” CDRH2"、” CDRH3"遵循 Kabat 编号规则。对于进一步的资料，参见 Kabat 等，SEQuences of Proteins of Immunological Interest, 第 4 版，U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)。
本领域技术人员显然明白，对于可变结构域序列和全长抗体序列的氨基酸残基， 有备选编号规则。对于⑶R序列亦有备选编号规则，例如在ChOthia等(1989) Nature 342 877-883中提出的那些编号规则。抗体的结构及蛋白质折叠可意味着认为其它残基是CDR 序列的部分，技术人员应该如此理解。因此，本文所用术语"对应的CDR"指用任何编号规则(例如表1中提出的那些)的CDR序列。技术人员可获得的用于CDR序列的其它编号规则包括〃 AbM" (University of Bath)禾口〃 接通(contact) ‘‘ (University College London)方法。用 Kabat、Chothia、AbM 和接通方法中的至少两种可测定最小重叠区，以提供"最小结合单位"。最小结合单位可为⑶R的亚部分。下表1代表用每一种编号规则对每一个CDR或结合单位的一种定义。表1中用 Kabat编号方案来给可变结构域氨基酸序列编号。应该注意，某些CDR定义可视所用的单独出版物而变化。表 权利要求
1.与肌生成抑制素特异性结合的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含SEQID NO 3 的CDRH3 ；或变体CDRH3。
2.权利要求1的抗原结合蛋白，其中所述变体⑶RH3为(i)SEQID NO :82-92或110 中的任一种；或(ii)以下Kabat取代中的任一种V102Y、V102H、V102I、V102D或V102G。
3.权利要求1或2的抗原结合蛋白，其进一步包含选自以下的一种或多种或所有CDR CDRHl (SEQ ID NO 1)或变体 CDRHl ；CDRH2(SEQ ID NO 2)或变体 CDRH2 ；CDRLl (SEQ ID NO 4)或变体 CDRLl ；CDRL2(SEQ ID NO 5)或变体 CDRL2 ；和 CDRL3(SEQ ID NO :6 或 109)或变体 CDRL3。
4.权利要求2的抗原结合蛋白，其中所述变体⑶RH2为(i)SEQID NO :93-97中的任一种；或(ii)以下 Kabat 取代中的任一种N50R、N50E、N50W、N50Y、N50G、N50Q、N50V、N50L、 N50K、N50A、I51L、I51V、I51T、I51S、I51N、Y52D、Y52L、Y52N、Y52S、Y53A、Y53G、Y53S、Y53K、 Y53T、Y53N、N54S、N54T、N54K、N54D、N54G、V56Y、V56R、V56E、V56D、V56G、V56S、V56A、N58K、 N58T、N58S、N58D、N58R、N58G、N58F 或 N58Y。
5.前述权利要求中任一项的抗原结合蛋白，其中⑶RH3为SEQID NO :90 ；和/或⑶RH2 为 SEQ ID NO 95 ；禾口 / 或 CDRL3 为 SEQ ID NO :109。
6.与肌生成抑制素特异性结合的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋包含SEQID N0:7可变结构域序列的对应的CDRH3或其变体CDRH3。
7.权利要求6的抗原结合蛋白，其进一步包含选自以下的一种或多种或全部对应的 ⑶R 所述SEQ ID NO :7可变结构域序列的⑶RHl或其变体⑶RHl或⑶RH2或其变体⑶RH2 ； 或所述SEQ ID NO 8可变结构域序列的⑶RLl或其变体⑶RL1、⑶RL2或其变体⑶RL2和 CDRL3或其变体CDRL3。
8.与肌生成抑制素特异性结合的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包括包含SEQID NO 7的95-101位Kabat残基的结合单位H3或变体H3。
9.权利要求8的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白进一步包含选自以下的一种或多种或全部结合单位包含SEQ ID NO :7的31-32位Kabat残基的Hl或变体Hl ；包含SEQ ID NO :7的52-56位Kabat残基的H2或变体H2 ；包含SEQ ID NO 8的30_；34位Kabat残基的 Ll或变体Ll ；包含SEQ ID NO :8的50-55位Kabat残基的L2或变体L2 ；和包含SEQ ID NO :8的89-96位Kabat残基的L3或变体L3。
10.前述权利要求中任一项的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白进一步包含选自以下的Kabat氨基酸残基中的任一种或组合(a)所述可变重链观位的S或T；(b)所述可变重链105位的T或Q；(c)所述可变重链的以下位置2位V、I或G;4位L或V ；20位L、I、M或V ；22位C ；24 位 Τ、A、V、G 或 S J6 位 G ；四位 I、F、L 或 S ;36 位 W ；47 位 W 或 Y ;48 位 I、Μ、V 或 L ；69 位 I、L、F、M 或 V ;78 位 A、L、V、Y 或 F ;80 位 L 或 M ;90 位 Y 或 F ；92 位 C ；禾口 / 或 94 位 R、K、 G、S、H 或 N ；(d)所述可变轻链的16位R或G；(e)所述可变轻链71位的Y或F；(f)所述可变轻链100位的A或Q；和/或(g)所述可变轻链的以下位置2位I、L或V ;3位V、Q、L或E ;4位M或L ;23位C ；35 位 W ;36 位 Y、L 或 F ；46 位 S、L、R 或 V ；49 位 Y、H、F 或 K ；88 位 C ；和 / 或 98 位 F。
11.前述权利要求中任一项的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白进一步包含与SEQID NO 10所示构架区具有75%或更高序列同一性的重链可变区受体抗体构架；或与SEQ ID NO 11所示构架区具有75%或更高序列同一性的轻链可变结构域受体抗体构架。
12.与肌生成抑制素特异性结合的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含(i)选自SEQID NO :7或SEQ IDNO 25的重链可变区；和/或选自SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 21的轻链可变区；或具有75%或更高序列同一性的变体重链可变区或轻链可变区； 或(ii)SEQID NO :26的重链；禾口 /或选自SEQ ID NO 27或SEQ ID NO 37的轻链；或具有75%或更高序列同一性的变体重链或轻链。
13.与肌生成抑制素特异性结合的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含(i)选自SEQID NO: 12、13或14中任一种的重链可变区；和/或选自SEQ ID NO :15、 16、17、18或M中任一种的轻链可变区；或具有75%或更高序列同一性的变体重链可变区或轻链可变区；或(ii)选自SEQID NO :28、四、30、98或99中任一种的重链；和/或选自SEQ ID NO :31、 32、33、34或40中任一种的轻链；或具有75%或更高序列同一性的变体重链或轻链。
14.权利要求12或13的抗原结合蛋白，其中存在以下Kabat取代(i)所述重链可变区或重链中的Y96L、G99D、G99S、G100A_K、P100B_F、P100B_I、W100E_ F、F100G_N、F100G_S、F100G_Y、V102N 或 V102S ；禾卩 / 或(ii)所述重链可变区或重链中的G55D、G55L、G55S、G55T或G55V；和/或(iii)所述轻链可变区或轻链中的C91S。
15.前述权利要求中任一项的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白为Fc无效化。
16.编码权利要求1-15中任一项的抗原结合蛋白的核酸分子。
17.权利要求16的核酸分子，所述核酸分子包含(i)SEQ ID NO 41重链DNA序列；和/或选自SEQ ID NO 42或52的轻链DNA序列；或具有75%或更高同一性的变体重链或轻链；或(ii)选自SEQID NO :43、44或45中任一种的重链DNA序列；和/或选自SEQ ID NO 46、47、48、49或55中任一种的轻链DNA序列；或具有75%或更高同一性的变体重链或轻链。
18.权利要求16的核酸分子，其中所述DNA序列编码具有以下Kabat取代的重链或轻链(i)所述重链中的Y96L、G99D、G99S、G100A_K、P100B_F、P100B I、W100E_F、F100G_N、 F100G_S、F100G_Y、V102N 或 V102S ；和 / 或(ii)所述重链中的G55D、G55L、G55S、G55T 或 G55V ；和 / 或(iii)所述轻链中的C91S。
19.包含权利要求16-18中任一项所定义的核酸分子的表达载体。
20.包含权利要求19中所定义的表达载体的重组宿主细胞。
21.用于制备权利要求1-15中任一项所定义的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括培养权利要求20的宿主细胞及回收所述抗原结合蛋白的步骤。
22.包含权利要求1-15中任一项的抗原结合蛋白及药用载体的药物组合物。
23.治疗罹患降低肌肉质量、肌肉力量和肌肉功能中任一种或组合的疾病的受试者的方法，所述方法包括给予权利要求1-15中任一项的抗原结合蛋白或权利要求22的组合物的步骤。
24.治疗罹患以下疾病的受试者的方法少肌症、恶病质、肌肉萎缩、废用性肌肉萎缩、 HIV、AIDS、癌症、外科手术、烧伤、肌肉骨头或神经创伤或损伤、肥胖症、糖尿病(包括II型糖尿病)、关节炎、慢性肾衰竭(CRF)、末期肾病(ESRD)、充血性心力衰竭(CHF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、选择性关节修复、多发性硬化病(MQ、中风、肌营养不良症、运动神经元神经病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、帕金森氏病、骨质疏松症、骨关节炎、脂肪酸肝病、肝硬化、阿狄森病、库欣病、急性呼吸窘迫综合征、类固醇诱导的肌肉萎缩、肌炎或脊柱侧凸，所述方法包括给予权利要求1-15中任一项的抗原结合蛋白或权利要求22的组合物的步骤。
25.在受试者中增加肌肉质量、增加肌肉力量和/或改进肌肉功能的方法，所述方法包括给予权利要求1-15中任一项的抗原结合蛋白或权利要求22的组合物的步骤。
全文摘要
本文阐述了与肌生成抑制素结合的抗原结合蛋白例如抗体、编码所述抗原结合蛋白的多核苷酸、包含所述抗原结合蛋白的药物组合物和制备方法。此外，本文阐述了所述抗原结合蛋白在治疗或预防与降低肌肉质量、肌肉力量和肌肉功能中的任一种或组合有关的疾病的用途。
文档编号C07K16/22GK102325793SQ200980157393
公开日2012年1月18日 申请日期2009年12月18日 优先权日2008年12月19日
发明者A·比顿, A·路易斯, B·韩, C·阿什曼, F·库尔, H·张, I·柯比, J·H·艾利斯, K·M·林德利, M·A·奥雷基亚, P·威尔逊, T·S·徐, Y·沈 申请人:葛兰素集团有限公司