专利名称：造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖和/或分化促进剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及以一种肌动蛋白结合蛋白质，Cofilin及其类似物为有效成分的造血干细胞和/或者造血前体细胞的增殖和/或者分化促进剂和该促进剂的新用途。本发明的造血干细胞和/或者造血前体细胞的增殖和/或者分化促进剂可作为造血干细胞和/或者造血前体细胞的增殖和/或者分化不足引发的疾病的治疗药物，尤其是各型血细胞减少症和/或造血功能低下相关疾病的治疗药物。本发明的造血干细胞和/或者造血前体细胞的增殖和/或分化促进剂可用于体外扩增造血干细胞，且此方法对造血干细胞移植和基因治疗以及再生治疗都有用。
现有技术血细胞生成由具有自我更新能力的造血干细胞、源自造血干细胞并已确定分化方向的造血前体细胞、介于前后二者之间的处于不同分化阶段的细胞同围绕在这些细胞周围形成造血微环境的基质细胞之间的直接相互作用来调节，或者由所述第一组细胞和基质细胞分泌的体液造血调节因子之间的间接相互作用调节。已知造血干细胞经过造血前体细胞，增殖和/或分化为各种成熟血细胞的过程有多种细胞因子参与。
随着遗传工程的进步，可以克隆得到这些细胞因子的基因，通过基因重组技术其工业生产也成为可能。基因重组型造血因子中包括粒细胞集落刺激因子(以下称为“G-CSF”)和巨噬细胞集落刺激因子(以下称“M-CSF”)可以作为治疗放疗和化疗等造成的造血功能低下(中性粒细胞减少症等)的药物，及红细胞生成素(以下称“EPO”)，已作为肾性贫血等的治疗药物在临床中获得应用。不过，采用这些造血因子进行治疗，只导致成熟血细胞的暂时性恢复。
因此，从根本上改善造血功能的治疗手段是进行造血干细胞的自体或者同源移植。最近，外周造血干细胞移植迅速普及，另外脐带血造血干细胞移植也非常引人著目。可是，它们仍然存在很多问题，尤其是血细胞中造血干细胞数量稀少，对供体和/或接受者都造成很大负担。因此，有必要建立造血干细胞的体外扩增方法。现在正在对不能有效治疗的致死性遗传性疾病和某些恶性肿瘤、及爱滋病患者进行缺陷或者变异基因的互补性基因治疗尝试(大桥十也，试验医学，12333，1994)。
能长期存活的造血干细胞，被认为是上述基因治疗的最适靶细胞。可是，为了能够有效转染或者感染整合有目的基因的逆转录病毒载体，通常要求少量处于静止期的造血干细胞进入细胞周期，并进行增殖。目前已经对被认为参与造血干细胞和造血前体细胞增殖的干细胞因子(SCF)和flk-2/flk-3配体的作用进行了研究。
试验研究已经证明c-kit/SCF信号对造血干细胞和造血前体细胞的增长具有重要作用(Blood，781-19，1991；Blood，812844-2853，1993；Blood，904767-4778，1997)，而且还发现干细胞因子(SCF)是在造血干细胞和造血前体细胞上表达的酪氨酸激酶型受体c-kit的配体(Cell，63167-174，1990；Cell，63195-201，1990；Cell，63225-233，1990)。因此，研究人员认为SCF可能对造血干细胞和造血前体细胞的增殖有作用。可是，人造血干细胞和造血前体细胞上的c-kit表达量很低(Blood，874136-4142，1996)，而单独使用SCF扩增活性低，且对造血干细胞和造血前体细胞的增殖不完全有效。
在多种组织和血细胞中都发现有所表达的受体型酪氨酸激酶flk-2/flt-3主要在未分化的造血干细胞中表达，而flk-2/flt-3配体(FL)已被鉴定为刺激未分化的造血细胞增殖的因子(Lyman S.D.Curr Opin Hematol 1998；5(3)192-6)。不过，该分子单独使用时扩增活性低，且对造血干细胞和造血前体细胞的增殖不完全有效。
因此，单独使用SCF或FL都不能对造血干细胞和造血前体细胞的增殖完全有效，理想的造血干细胞和造血前体细胞的扩增方法是将它们同多种细胞因子进行组合(Blood，892644-2653，1997；CancerChemother.Pharmacol.，38[Suppl.]64-68，1996)，有人已经研究了这类分子和TPO(血小板生成素)、白介素6(IL-6)/可溶性白介素6受体复合物或者超IL-6(IL-6和IL-6受体的融合蛋白质)等的组合(Exp.Hematol.29822-832，2001)。此外，还期待能够阐明和得到具有高扩增活性的新因子。
Cofilin是分子量大约19000的蛋白质，属于肌动蛋白结合蛋白(ABP)中的一种，其能够响应于多种信号而与肌动蛋白丝(F-actin)按照1∶1的摩尔比结合，由此调节肌动蛋白的物理状态，并在基于肌动蛋白的细胞骨架的再构建中发挥主要作用(试验医学、第12卷，第4号24-28，1994)。并且已知Cofilin通过和G肌动蛋白结合并切割G肌动蛋白(肌动蛋白单体)并使之解聚来调控多种细胞反应，包括形态变化、移动(运动)、分裂、分泌、胞吞(饮)作用和多种信号的传导等(生物化学，第71卷，第2号101-114，1999)。Cofilin在细胞内存在磷酸化和去磷酸化的2种形式，磷酸化抑制，而去磷酸化促进其对肌动蛋白的结合活性。
近年来已知Cofilin的去磷酸化响应于多种外来刺激包括凝血酶刺激血小板、甲状腺刺激激素刺激甲状腺细胞、异丙肾上腺素刺激腮腺细胞、联丁酰基cAMP刺激星形胶质细胞等(Moon，A.&Drubin，D.G.(1995)Mol.Biol.Cell.6，1423-1431)。此外，据报道当中性粒细胞和T细胞活化时，Cofilin发生去磷酸化。
目前已经提出了一些通过肌动蛋白结合蛋白质(ABP)的功能或者通过调节ABP功能来治疗某些特定的疾病的方法。例如对因肌动蛋白沉淀而发病的疾病组织、器官施用肌动蛋白的治疗或者缓解疾病的方法(特表平5-50603A，特表平8-510998A)；根据细胞凋亡的调节机制，用Cofilin去磷酸化的抑制剂治疗凋亡调控失调相关的各种疾病(特开平10-67662A，特开平10-87484A)。
不过，到目前为止还没有关于Cofilin及其类似化合物参与造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖和/或分化的相关报道。
本发明的目的是提供造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖和/或分化促进剂，其可以用于治疗造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖和/或者分化不足引发的疾病，尤其用于各型血细胞减少症和/或造血功能低下相关疾病的治疗。此外，本发明的另一目的是提供造血干细胞的体外扩增方法，其包括施用造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂，该方法也可用于造血干细胞移植、基因治疗以及再生治疗。
发明概述本发明者以前处理人骨髓性白血病细胞系，建立了特征为CD34表达为阳性而同时GP(糖蛋白)IIb/IIIa表达为阴性的新细胞系(特开平6-269284A)。本发明人命名该细胞为人骨髓样白血病细胞S6SBM332(以下称“S6细胞”)，1993年3月9日交付于日本茨城县，筑波市东1-1-1通商产业部工业技术院生命科学工业技术研究所(现在的独立行政法人产业技术综合研究所，特许生物保藏中心)，以FERM BP-4227为代号进行了保藏。CD34是随着造血干细胞分化而消失的糖蛋白，是人造血干细胞的标记物，而GP(糖蛋白)IIb/IIIa是在血小板和巨核细胞中特异表达的血小板膜糖蛋白，属于随着巨核细胞的分化被增强的分化抗原，它是人巨核细胞的标记物。
S6细胞系在存在血清的条件下能持续长期培养，保持CD34表达的阳性和GPIb/IIIa表达的阴性，而且，当添加12-O-十四烷酰佛波醇13-乙酰酯(TPA)进行培养时CD34的表达减弱而GPIIb/IIIa的表达显著增强。因此判断S6细胞系向巨核细胞方向发生分化，具有分化能力。
本发明的发明人根据以前的这些常规试验结果进一步进行了研究，并确定S6细胞的无血清培养上清中存在促进小鼠高增殖潜力集落形成细胞(HPP-CFC)增殖的因子。根据以前的发现和这个研究的结果本发明人发现S6细胞具有造血干细胞的性质，并在能促进造血干细胞增殖的未知因子(以下称“S6因子”)存在下进行自分泌增殖。这样即暗示S6因子可能是新型的造血干细胞和/或造血前体细胞增殖因子。基于此可能性，发明人纯化S6细胞的无蛋白质培养上清，不仅分离纯化了具有HPP-CFC扩增能力的因子，确定其结构或克隆了该因子的基因，并对基因重组因子的HPP-CFC扩增能力进行深入研究，结果意外的发现该因子是低分子量的肌动蛋白结合蛋白，Cofilin。
基于此发现，本发明的发明人发现作为肌动蛋白结合蛋白质之一的Cofilin是能促进造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化的因子，该因子能够促进小鼠HPP-CFC扩增，并且和目前具有HPP-CFC扩增能力的细胞因子相比，该因子具有明显更高的活性，至此完成本发明。
由此，本发明提供含Cofilin为有效成分并可再含有其它细胞因子作为可选成分的造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂。
本发明还提供促进造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化的方法，此方法包括施用至少一种上述造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化的促进剂。
本发明还提供通过使用至少一种造血干细胞和/或造血细胞增殖和/或分化促进剂对造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化不足引发的疾病，尤其是各型血细胞减少症或者造血功能低下等疾病进行治疗的方法。
本发明还提供了体外扩增造血干细胞的方法，此方法包括施用至少一种上述造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂。
本发明还提供再生性医疗的方法，其包括使用至少一种造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂，体外扩增造血干细胞，并移植所扩增的造血干细胞。
附图简述
图1是人非肌肉型Cofilin(ACP23528)的一级结构序列图。
图2是人胎盘非肌肉型Cofilin(ACD00682)的cDNA序列图。下划线部分表示合成为引物的2个寡聚物的位置，即引物SK013(序列号3)和引物SK014(序列号4)。
图3是人胎盘来源(上部)和人S6细胞来源(下部)的非肌肉型Cofilin的碱基序列比对结果。两者相比较，第198号碱基和第471号碱基不同，这两个位点的不同都归因于沉默突变。
图4是对表达重组人非肌肉型Cofilin的COS-1细胞的培养上清的造血干细胞扩增作用进行HPP-CFC分析的结果。
图5表示与单独添加SCF或者FL相比，人非肌肉型Cofilin和SCF以及FL联合时，扩增人脐带血来源的CD34阳性细胞的显著能力。
图6A表示当人非肌肉型Cofilin和SCF、FL联合时，引起人脐带血来源的CD34阳性细胞的显著扩增。
图6B～D表示人脐带血来源的CD34阳性细胞在人非肌肉型Cofilin+SCF+FL条件下培养后进行集落形成分析的结果，CFU-GM、BFU-E以及CFU-Mix的集落数量都分别显著增加。
图7表示人脐带血来源的CD34阳性细胞在人非肌肉型Cofilin+SCF+FL条件下培养后进行集落形成分析的结果，CFU-Mk的集落数量显著增加。
图8是在人非肌肉型Cofilin和SCF、FL联合的条件下，人脐带血来源的CD34阳性细胞分化并生长成巨核细胞的显微镜照片。
图9是在人非肌肉型Cofilin和SCF、FL联合的条件下，将人脐带血来源的CD34阳性细胞培养2周左右时，部分巨核细胞形成前血小板(proplatelets)的显微镜照片。
发明详述本发明的Cofilin促进的造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化的活性可以参照促进HPP-CF扩增的活性(以下称“HPP-CFC活性”)来进行测定。HPP-CFC代表高增殖潜能集落形成细胞，其可由在体外集落形成检测中具有足够强的扩增能力而形成宏观集落来证明；HPP-CFC的分化程度比长期培养的起始细胞(long termculture-initiating cell、LTC-IC)快一个阶段，后者由在间质细胞上培养骨髓细胞至少5周以后仍能保持集落形成能力而被检测出来。并且，本发明中的HPP-CFC活性指的是被检物质对HPP-CFC扩增的促进活性。
HPP-CFC活性可以按如下方法测定为了特异性地得到造血干细胞，用抗癌药物5-氟尿嘧啶处理小鼠，从该小鼠的骨髓细胞中去除T细胞、B细胞、粒细胞以及巨噬细胞，分离得到造血干细胞级分；在添加样品和/或者细胞因子后，造血干细胞在液体培养基中培养，将含有造血干细胞的部分条件化的培养液用于集落分析，计数形成的宏观HPP-CFC集落数。根据此测定方法，可对本发明的造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂的活性进行测定。
本发明中，用Cofilin进行上述HPP-CFC活性测定时，发现Cofilin对HPP-CFC发挥作用，并显示诱导其增殖和/或者分化的活性。因此，Cofilin能够对那些多能干细胞或者那些处于其增殖和/或分化过程的最初级阶段的造血干细胞和/或造血前体细胞发挥作用，由此促进这些多能干细胞的增殖和/或分化。
本发明中的“造血干细胞”指的是能分化成包括红细胞、白细胞、血小板等所有血细胞的多能干细胞。此类细胞为CD34阳性、而其它细胞系标志完全阴性。例如本发明中的“造血干细胞”不仅包括骨髓来源的CD34阳性细胞，还包括脐带血来源的CD34阳性细胞。
本发明中的“造血前体细胞”指比造血干细胞分化阶段更进一步，但是还没有分化成为各种血液细胞系的前体细胞(单潜能前体细胞)。例如本发明中的“造血前体细胞”包括粒细胞/巨噬细胞相关的前体细胞(集落形成单位粒细胞巨噬细胞CFU-GM)、红细胞相关的前体细胞(爆发集落形成单位红细胞，BFU-E)、巨核细胞相关的前体细胞(集落形成单位巨核细胞、CFU-Mk)以及骨髓相关的干细胞(混合的集落形成单位、CFU-Mix)等。
本发明的造血干细胞和/或者造血前体细胞的“分化”一词既指造血干细胞向造血前体细胞的变化，也指从造血前体细胞向单潜能造血前体细胞和/或者有特定功能的细胞即红细胞、白细胞、巨核细胞等成熟细胞的转变。
因此，本发明的对造血干细胞和/或者造血前体细胞增殖促进活性指使具有上述功能的造血干细胞和/或者造血前体细胞扩增而增殖出具有同样功能的造血干细胞和/或者造血前体细胞的活性。此外，本发明中的造血干细胞和/或者造血前体细胞分化促进活性指使造血干细胞和/或者造血前体细胞分化而转化成具有上述功能的造血前体细胞，骨髓相关的干细胞，单潜能前体细胞和/或者成熟血细胞(红细胞、白细胞和巨核细胞)的活性。本发明中术语HPP-CPC和造血干细胞和/或者造血前体细胞同义使用。
作为切割因子之例的Cofilin是在真核生物中普遍存在的低分子量(15-21kDa)的肌动蛋白结合蛋白质，而任何一个高等脊椎动物的Cofilin均由166个氨基酸组成。并且，此氨基酸序列在系统树上远离的物种间存在30％以上的全长同源性。例如，人的Cofilin包括肌肉型Cofilin和非肌肉型Cofilin，其同源性达到76.5％。在本发明中没有特殊限定的情况下，所说的“Cofilin”指具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的Cofilin及其类似物。
本发明中的Cofilin类似物指具有造血干细胞和/或者造血前体细胞增殖和/或者分化促进活性的下列物质在SEQ ID NO1所示的Cofilin的氨基酸序列中含有1个或者多个氨基酸缺失、置换和/或者添加的氨基酸序列；可以和SEQ ID NO1所示的Cofilin氨基酸序列的编码碱基序列的互补序列在严紧条件下杂交的碱基序列所编码的氨基酸序列；和Cofilin的氨基酸序列(SEQ ID NO1)之间存在至少30％，优选至少50％、更优选至少60％，尤其优选至少70％同源性的氨基酸序列。本发明中提到的Cofilin类似物包括具有造血干细胞和/或者造血前体细胞增殖和/或者分化促进活性的下列物质由和SEQID NO2所示的Cofilin碱基序列的互补碱基序列能在严紧条件下杂交的碱基序列所编码；由包含和SEQ ID NO2所示的Cofilin碱基序列之间至少存在30％、优选至少50％、更优选至少60％、最优选至少70％碱基序列同源性的碱基序列的DNA所编码。
此处所说的“一个或者多个”优选指1到20个，更优选1到10个，且最优选1到5个。对于蛋白质，“缺失”、“置换”、“添加”指如在Cofilin(SEQ ID NO1)的情况中，其发生方式可保留造血干细胞和/或者造血前体细胞的增殖和/或者分化的促进活性。例如氨基酸“置换”的情况包括用具有相似性质的氨基酸进行置换，例如用另一个疏水性氨基酸置换某个疏水性氨基酸、用另一个亲水性氨基酸置换某个亲水性氨基酸、用另一个酸性氨基酸置换酸性氨基酸或者用另一个碱性氨基酸置换某个碱性氨基酸。
本发明中的严紧条件指目的碱基序列和Cofilin(SEQ ID NO1)编码碱基序列(例如SEQ ID NO2)或者与其简并序列之间能发生特异性杂交的条件。杂交条件取决于温度、离子浓度等条件，且已知一般情况下，温度越高，离子浓度越低，严紧程度越高。本领域技术人员可以根据例如Sambrook以及Russel(Molecular CloningALaboratory Manual，第三版(2001))所记载的方法对这样的严紧条件进行设定。这种严紧条件的例子具体如使用6×SSC、5×Denhardt’s、0.1％SDS、25℃到68℃等的杂交条件。此时，杂交温度优选可以为45℃到68℃(无甲酰胺)或25℃到50℃(50％甲酰胺)。
本发明的氨基酸或者碱基序列的序列同源性可以通过目测或者数学计算进行测定。可以在Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.，48443-453，1970)基础上并使用威斯康辛大学遗传学计算小组(UWGCG)的GAP计算机程序比较2个蛋白质序列的序列同源性。GAP程序中优选的缺省参数包括(1)Henikoff和Henikoff(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8910915-10919，1992)所记载的得分矩阵blosum62、(2)12个缺口权重(gap weight)、(3)4个缺口长度权重(gap length weights)和(4)末端缺口无罚分(penalty)。
本发明中对氨基酸序列或者碱基序列进行同源型分析时，也可以使用其它本领域技术人员所用的序列比较程序。例如可以用Altschul等人(Nucl.Acids.Res.25.，p.3389-3402，1997)所述的BLAST程序对序列信息进行比较。具体而言，当分析碱基序列时，向核苷酸BLAST(BLASTN)程序提交碱基序列，和GenBank、EMBL及DDBJ等碱基序列数据库进行比较。在进行氨基酸序列分析时，向蛋白质Blast(BlastP)提交氨基酸序列，和GenBank CDS、PDB、SwissProt、PIR等氨基酸序列数据库进行比较。可以在互联网的National Centerfor Biotechnology Informatin(NCBI)、或者DNA Data Bank ofJapan(DDBJ)的网页上得到上述程序。在那些网站中详细记录了用BLAST程序进行同源性检索的各种参数。尽管可以适当改变部分设定，通常使用默认值进行同源性检索。也可以使用本领域技术人员使用的其它的序列比较程序。
上述Cofilin及其类似物不限于天然产物，也可由本发明的技术领域内已知的基因工程方法制备，例如由定点突变、突变剂处理或PCR错误扩增的随机突变、盒式突变等方法制备的产物。换言之，突变可以自然发生也可以使用基因工程技术产生。例如氨基酸酸序列(SEQID NO1)和基因序列(SEQ ID NO2)已知的Cofilin，可以这些序列为基础，用已经建立的基因工程手段进行生产。可用的基因工程技术记叙于Sambrook和Russel(Molecular CloningA LaboratoryManual，第三版(2001))。技术人员可以常规方法，容易地制备这些突变的蛋白质。
Cofilin因生物物种不同有不同的名称，通常，将其统称为Cofilin家族。本发明中将所有Cofilin分子，包括那些源自或属于Cofilin家族的Cofilin分子总称为Cofilin。因此，本发明中所说的Cofilin除了人肌肉型Cofilin和非肌肉型Cofilin之外，还包括例如猪destrin、鸡肌动蛋白去聚合因子(ADF)、海胆卵的蚕食蛋白、酵母的Abpl、变形虫载肌动蛋白和它们的类似物。
具有Cofilin活性的物质作为造血干细胞和/或者造血前体细胞的增殖和/或分化促进剂的活性不具有严格的种属特异性，例如小鼠来源的Cofilin能够对人的细胞发挥作用。因此，本发明的造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂的有效成分绝不限于Cofilin，且只要其在促进造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化的活性方面与Cofilin相当，该有效成分不需限定于特定的种属来源，例如其可以源于牛、猪、鸟、山羊和绵羊等动物。不过，当用于人体时，优选用人源的，即来源于人的Cofilin或者来源于人的Cofilin类似物。
本发明的一个实施方案中，造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂除了Cofilin或者其类似物之外，还可以含有一或多种具有造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进活性的细胞因子作为辅助有效成分。
本发明中作为辅助有效成分可添加的细胞因子包括，且不限于白介素(IL)-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-11、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、红细胞生成素(EPO)、干细胞因子(SCF)、flk-2/flt-3配体(FL)、血小板生成素(TPO)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、上皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、蛋白酶连接蛋白I、蛋白酶连接蛋白II、血小板来源的生长因子(PDGF)、胆碱能分化因子(CDF)、白细胞移行抑制因子(LIF)等。如需要，还可以含有IL-6/可溶性IL-6受体复合物或者超IL-6(来自IL-6和可溶性IL-6受体的融合蛋白质)。本发明的可添加细胞因子优选为干细胞因子(SCF)、flk-2/flt-3配体(FL)、血小板生成素(TPO)以及两或三种这些物质的组合。
如果作为辅助成分添加这些细胞因子，Cofilin作为造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂的效果会协同增加。这些细胞因子的添加量没有特定限制，但可以例如以人Cofilin作为100，各种成分可以按照0.0001-200000重量％进行添加。这些辅助有效成分的添加量绝不限于上述值，而可根据症状、患者的年龄等采用适当的量。这些细胞因子并非必需和Cofilin同时以相同的剂量形式给药，例如可在Cofilin给药后，进行细胞因子的给药。
在本发明的一个实施方案中，可以向上述造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂添加Cofilin以外的具有HPP-CFC活性的物质作为进一步的辅助成分。作为进一步的辅助成分的Cofilin以外的具有HPP-CFC活性的物质指能够通过促进形成HPP-CFC来源的集落来促进造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化的Cofilin以外的任何物质。将Cofilin和这些添加的辅助成分同时给药，能够协同增强对造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化的促进作用。这样的额外辅助活性成分包括，但不限于SCF、flk-2/flt-3配体、TPO、IL-6/可溶性-6受体或者超IL-6(来自IL-6和可溶性IL-6受体的融合蛋白质)等。
基于其对机体给药后所表现出的效果，本发明的以Cofilin为有效成分的造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂，在改进治疗造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化不足引发的疾病的方法中有效，具体而言，如对于各型血细胞减少症和/或者造血功能低下相关疾病，或者血细胞减少症或者造血功能受损相关疾病和/或者在改善治疗血细胞减少症或者造血功能受损疾病的方法中有效。上述疾病实例包括范可尼综合症、再生不良性贫血、如恶性淋巴瘤或者急性白血病等的癌症、慢性肝病、肾衰、手术时或者需输入大量保存血的输血患者、重症感染、骨髓障碍性血小板减少症、特发性血小板减少性紫斑病(ITP)、STE、毒蛇咬伤、溶血性尿毒综合症、脾功能亢进、出血、Barnard-Soulier综合症、Glanzmann’s血小板无力症、尿毒症、抗血小板抗体、骨髓增殖性疾病等。
本发明的造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂的给药方式没有特殊限定，但一般采用肠胃外给药，例如以静脉内、腹腔内、肌内等途径给药。本发明中优选静脉内给药。
本发明的造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂作为治疗或者改善药物时的使用量因其使用方法、使用目的等不同而变化。注射给药时，以Cofilin蛋白质的量计算，该促进剂优选每日给药约0.002μg/kg～20mg/kg，更优选0.2μg/kg～2mg/kg。
本发明的造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂可以制备成液体或者固体形式。
如果本发明的造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂制备成液体，则将Cofilin溶解在水溶液(如蒸馏水)、水溶性溶剂(如生理盐水、Ringer溶液)、及油性溶剂(如芝麻油、橄榄油)等溶剂中，然后按照惯用的方法进行制备。根据要求，还可以添加溶解剂(例如水杨酸钠和乙酸钠)、缓冲液(例如柠檬酸钠和甘氨酸)、等渗剂(例如葡萄糖和转化糖)、稳定剂(例如人血清白蛋白和聚乙二醇)、防腐剂(例如苯扎氯铵和酚)、无痛剂(例如苯甲醇、盐酸普鲁卡因)等添加剂。此外，该水溶液的pH优选调整到3～8，更优选约5～7。为了调整到上述pH范围，可添加例如稀酸(例如稀盐酸)和稀碱(例如稀氢氧化钠和稀碳酸氢钠)等。
由本发明的造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂制备药物制剂时，可向含有Cofilin的溶液制剂中添加人血清白蛋白(HSA)作为稳定剂，使其在pH调整到3～8时处于溶解形式。优选进行此步因为在保存过程中或者冷冻以及冻干操作中可使Cofilin的活性下降较低，而且可使冷冻制剂溶解为透明溶液。只要能将本组成物用于临床，可采用任何类型的HSA，优选使用肠胃外给药标准品质。例如根据Cohn的乙醇分离的第6种方法分离纯化健康人血浆所得到的。此外，稳定剂可以含有乙酰色氨酸钠和辛酸钠。当各个成分制成水溶液时，优选每毫升水溶液含有约0.1mg～约50mg、特别优选约0.5mg～约20mg的HSA。
由本发明的造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂制备药物制剂时，可向含有Cofilin的溶液制剂中，除添加上述HSA之外，还可添加一或多种选自下列的成分甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸和脯氨酸等氨基酸、特别是单氨类脂族氨基酸或者环状氨基酸；葡萄糖、甘露糖等单糖；山梨醇、甘露醇等糖醇，其生理学上可接受的盐及其衍生物。当Cofilin制成水溶液时，上述化合物优选以每毫升水溶液中，若为单糖或者糖醇，则约10mg～100mg的量整合、而若为氨基酸，则约5mg～约50mg。制备上述药物制剂时，该水溶液的pH调节至约3～8，优选pH约5～7。当添加谷氨酸等酸性氨基酸时，可通过按照上述量添加该物质来调节到所定的pH。或者，根据要求或不添加上述的酸性氨基酸时，用盐酸，磷酸等的无机酸或者琥珀酸、酒石酸和柠檬酸等的缓冲液调节到所定的pH。
此外，本发明的造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂可制备成固体形式，例如以冷冻或者冻干Cofilin的方法进行制备。特别是，出于对便于处理和贮存的稳定性方面的考虑，优选冻干Cofilin。为了由冷冻制备本发明的造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂，可以用制成水溶液的造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂为起始原料，通常在-80℃～-20℃进行冷冻。该冷冻组合物贮存于约-80℃～25℃、优选约-80℃～15℃、更优选-80℃～-10℃。为由冻干制备本发明的造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂，例如可以将上述冷冻的组合物按照常规方法进行减压干燥，或者，将上述水溶液或者上述冷冻组合物溶解得到的水溶液按照要求分成小份，如上述方法冷冻后，遵照常规方法减压干燥进行制备。
在本发明中，固体形式的(例如粉末状)Cofilin可混有稀释剂(例如蒸馏水、生理盐水和葡萄糖)、载体(例如羧甲基纤维素(CMC)和藻酸钠)、防腐剂(例如苯扎氯铵和酚)、无痛剂(例如葡萄糖、苯甲醇和盐酸普鲁卡因)等。
当采用冻干方法制备上述固体制剂时，可在使用前将其溶解到适当的溶剂中。具体如将上述固体制剂用蒸馏水或者生理盐水等溶解，以液体制剂使用。根据需要，可以用含有上述单糖、糖醇、氨基酸等的调节好pH的溶剂溶解后使用。
当本发明的造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂制成液体制剂或者以冷冻制备时，优选将含有Cofilin的水溶液利用过滤等手段除菌。制备液体制剂时，可以使用这样除菌的水溶液；由冷冻制备该促进剂时，可以冷冻该除菌的水溶液。
本方明的造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂以冻干制备时，优选将含有Cofilin的水溶液进行过滤或以相似手段除菌，或者将此水溶液除菌后，在无菌操作下分装到小瓶等类似容器中，再进行上述冻干处理。此时，将容器上层的空间进行真空处理或者用氮气填充以提高该组合物在容器中的稳定性。如果此冻干品需要用含有氨基酸或者糖醇等的水溶液溶解，这些水溶液优选进行过滤除菌并无菌操作分装到安瓿等类似容器中，再采用常规方法进行蒸气灭菌。
因为本发明的以Cofilin为有效成分的造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂可以发挥上述药理学作用，因此本方明的造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂还可以用作再生治疗药物。
本发明的造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂用于再生治疗药物时，可以将其如上所述体内给药或者离体添加到培养基中。当离体使用本方明的增殖和/或分化促进剂时，通常可以采用下面的方法实施，不过也可以采用此方法之外的该领域内公知的方法。首先，用该领域内公知的方法从被检体中取得造血干细胞和/或造血前体细胞，接着，将其在含有本发明的造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂的培养液中培养，使之增殖，由此促进造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化，然后，将增殖和/或分化后的造血干细胞和/或造血前体细胞再次移入被检体内。
当离体使用本方明的增殖和/或分化促进剂时，其在培养液中添加的量使Cofilin在培养基中的浓度处于1ng/ml～100μg/ml范围内，优选2.5ng/ml～50μg/ml，更优选25ng/ml～10μg/ml，最优选250ng/ml～2.5μg/ml，如前所述，可向本发明的增殖和/或者分化促进剂中进一步加入细胞因子。本发明中可选添加的细胞因子优选为干细胞因子(SCF)、flk-2/flt-3配体(FL)、血小板生成素(TPO)以及二或三种这些物质的组合。
发明的实施方式(1)检测具有造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进活性的物质的方法为了检测造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖，本发明采用了如下方法将去除了表达细胞谱系标记物(Lineage maker)细胞的小鼠骨髓细胞样品进行液体培养后，在含有造血干细胞的条件化的培养液中测定存在的高增殖潜能集落形成细胞(HPP-CFC)的数量。以HPP-CFC为指标的检测系统已经广泛用于造血干细胞研究之中。例如作用于造血干细胞的干细胞因子(SCF)参考HPP-CFC指标进行纯化。
(2)纯化具有造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进活性的物质为纯化具有造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进活性的物质，以S6细胞的无蛋白质培养上清(600L)以及细胞为出发原料，用分子量为10000的UF膜进行分离，超滤浓缩(到18L)后，然后进行一系列处理，包括用50％的硫酸氨沉淀并经过多个色谱柱纯化，使用苯基琼脂糖柱(Amersham Pharmacia Biotech K.K)、肝素琼脂糖柱(Amersham Pharmacia Biotech K.K)、螯合琼脂糖柱(Amersham Pharmacia Biotech K.K)、MonoS(AmershamPharmacia Biotech)、凝胶过滤法等。以280nm光吸收、Lowry定量和SDS-PAGE对蛋白进行验证。
(3)具有造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进活性的物质的结构测定为了测定具有造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进活性的物质的结构，通过参考蛋白质有限降解产生的多个肽片段的分子量以及参考其碰撞诱导裂解得到的分子量来检索蛋白质/核酸序列数据库并鉴定原始蛋白。此方法的技术背景包括下列三个方面质谱仪和质谱质析的发展可以对蛋白质和肽的分子量进行高精度的测定；(2)基因组计划和其它技术努力已经积累了大量蛋白质/核酸序列；以及(3)计算机技术已经发展到可以高速处理大量数据的水平。此方法的优点是可以通过简单的操作对很少量的样品(约10ng)进行处理，来迅速并且可靠地确定未知的蛋白质。
(4)HPP-CFC活性的测定方法采用如下方法测定HPP-CFC活性为了特异性取得造血干细胞，从对小鼠进行抗癌药物5-氟尿嘧啶处理后得到的骨髓细胞中去除T细胞、B细胞、粒细胞以及巨核细胞，分离得到造血干细胞级分，在加入样品和细胞因子后对造血干细胞进行液体培养基培养，并将含有造血干细胞的条件化的培养液的一部分作集落分析，对形成的宏观HPP-CFC集落进行计数测定。
在本说明书中用省略语表示碱基、氨基酸等时，采用IUPAC-IUBCommission on Biochemical Nomenclature的省略语或者该领域内惯用的省略语。
说明书的以下部分记载的是实施例。这些实施例用于对本发明进行更详细的说明，而不限定本发明的范围。
实施例实施例1具有造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进活性的物质的纯化和鉴定(1)人S6细胞的制备将人S6细胞在750cm2有效面积的摇瓶(Corning，430851)中培养。具体来说，每个摇瓶接种1×108个细胞，用500ml含有10％胎牛血清(FBS、Hyclone公司)的F-12培养基(Flow Laboratories)在37℃、以0.5rpm培养72小时。72小时后，离心去除上清，用磷酸缓冲盐溶液(PBS、日水制药)洗涤3次。洗净后，离心，将去除上清的细胞沉淀在-20℃冻存。
(2)用小鼠骨髓细胞测定具有造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进活性的物质以下列步骤测定能促进造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化的活性物质为了特异性取得造血干细胞，从对小鼠进行抗癌药物5-氟尿嘧啶(KYOWA HAKKO KOGYO Co.，Ltd)处理后得到的骨髓细胞中去除T细胞、B细胞、粒细胞以及巨核细胞，分离得到造血干细胞组分，在加入样品和细胞因子后对造血干细胞进行液体培养基培养，将含有造血干细胞的条件化的培养液的一部分作集落分析，对形成的宏观HPP-CFC集落进行计数测定。以下，称此测定法为HPP-CFC活性测定法。
具体细节对小鼠DBF1(雌性，10～15周龄、购自日本CharlesRiver公司)进行5-氟尿嘧啶给药，2天后，从大腿骨中采取骨髓细胞。用大鼠抗小鼠CD4抗体(CALTAG)、CD8抗体(CALTAG)、B220抗体(CEDERLANE)、Gr-1抗体(CEDERLANE)、和Mac-1抗体(CALTAG)对所采骨髓细胞进行标记。这些抗体全部为IgG。接着，用Dyna珠(DYNAL)标记的的山羊抗大鼠IgG抗体进行反应后，磁性去除结合Dyna珠的细胞，获得细胞谱系标志物阴性的骨髓细胞(Lin-BMCs)。将Lin-BMC在含有10％FCS(Invitrogen)的α-MEM培养基(Invitrogen)中调节至浓度为2.5×104个细胞/ml。向此细胞悬浮液中添加小鼠IL-3(以最终浓度为10ng/ml，INTERGEN)后，将此细胞悬浮液加到24孔板(Corning)中，每孔1ml。接着，向各孔中加入样品，在37℃、5％CO2的条件下于CO2温箱中培养。液体培养的第6天和第10天，悬浮起各个孔中培养的细胞后，取出细胞悬液中的200μl。在15ml离心管中将取得的200μl细胞悬液混合1.5ml FCS(以终浓度为30％)、0.5ml BSA(以终浓度为1％，ICN)、50μl的2-ME(以终浓度为1×10-4，Wako Pure ChemicalIndustries Ltd.)、在αMEM中制备的2ml的2.5％甲基纤维素(以终浓度为1％，Shin-Etsu Chemical Co.，Ltd.)、每种造血因子50μl(即，小鼠IL-3(INTERGEN)、SCF(PeproTech)、人IL-6(PeproTech)、G-CSF(CHUGAI PHARMACEUTICAL CO.，LTD.)、及M-CSF(绿色十字公司)；全部以终浓度为10ng/ml)及0.5mlαMEM，得到总体积5ml。之后，静置20分钟去除所有气泡，并将其中的1ml转到4个35mm的培养皿(Corning)中培养悬浮细胞。向9cm的培养皿中放入2个35mm的皿以及1个不加盖子的添有蒸馏水的35mm皿。在37℃、5％CO2的条件下于CO2温箱中培养14天。对直径达到2mm以上的HPP-CFC集落进行计数。
(3)具有造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进活性的物质的纯化向用PBS洗净并冻存的(湿重为269g)S6细胞中加入20mMTris/HCl缓冲液(pH7.0)，在Potter-Elvehjem型Teflon匀浆器(IWAKI GLASS CO.，LTD)中破碎混合物。离心分离细胞残渣(8000rpm，20分钟)，取得上清，添加硫酸氨达50％的饱和度。将上清加到用2M硫酸胺/20mMTris/HCl缓冲液(pH7.0)平衡的苯琼脂糖柱(Amersham Pharmacia Biotech K.K.)上，充分洗涤后，硫酸氨的浓度按照1.5M、1M、0.5M、0M分阶段下调，洗脱相应的结合级分。本说明书中所述的S6因子主要存在于1M硫酸胺/20mMTris/HCl缓冲液(pH7.0)的洗脱级分中，由(2)所述的测定HPP-CFC活性的同样方法确认。
用0.6M NaCl/20mM Tris/HCl缓冲液(pH7.0)充分透析苯琼脂糖得到的活性组分后，将其加样到肝素琼脂糖柱(AmershamPharmacia Biotech K.K.)上进行洗脱，用2M NaCl/20mM Tris/HCl缓冲液(pH7.0)处理来洗脱各个结合级分。用20mM Tris/HCl缓冲液(pH7.0)4倍稀释肝素洗脱级分，并使之吸附到用0.5M NaCl/20mMTris/HCl缓冲液(pH7.0)平衡的铜(Cu)螯合琼脂糖柱(AmershamPharmacia Biotech K.K.)上，用0.5M和0.3M NaCl/20mM磷酸钠缓冲液(pH6.8)分2个阶段洗涤，进行缓冲液置换。
用0.1M咪唑/0.3M NaCl/20mM磷酸钠缓冲液(pH6.8)洗脱结合的级分，并如此加样到用0.4M NaCl/20mM磷酸钠缓冲液(pH6.8)平衡的MonoS离子交换柱上，以流速0.7ml/分钟，进行0.4～2M NaCl的梯度洗脱，向洗脱液中加入终浓度为0.1％的表面活性剂CHAP，保存。经确认，其中HPP-CFC活性存在于47～50洗脱级分中，经ELISA检测，该级分中含有目的S6因子之外，还共存有碱性FGF。将MonoS活性级分分成第一组(47，48洗脱组分)和第二组(49、50洗脱组分)两组，并尝试以肝素柱梯度洗脱的方法去除碱性FGF。将样品加到用0.4M NaCl/20mM磷酸钠缓冲液(pH6.8)/0.1％CHAPS平衡的肝素色谱柱后，以流速0.7ml/分钟，用0.4～4M NaCl进行梯度洗脱。
第一MonoS活性组在第30～32洗脱级分表现出活性。经ELISA检测，确认其中含有碱性FGF，由此阐明该活性来自碱性FGF。
第二MonoS活性组在除了30～32(碱性FGF组分)之外的洗脱级分中表现出HPP-CFC活性，经ELISA检测，其中22、23洗脱级分没有FGF。对活性级分附近的各个级分进行了剂量分析和在用1ng/ml碱性FGF补充的系统中的分析。经确认第22、23级分的活性具有剂量依赖性，且液体培养第10天的HPP-CFC集落形成促进活性高于第6天的培养液。此外，在补充碱性FGF的分析系统中发现第22、23级分的活性比单独的碱性FGF的HPP-CFC活性高。
为了再次确认活性，改变肝素柱梯度斜率，再次进行柱纯化。将样品加到用0.3M NaCl/20mM磷酸钠缓冲液(pH6.8)/0.1％CHAPS平衡的肝素色谱柱后，用较温和的斜率以0.3～2M的NaCl进行梯度洗脱。经确认HPP-CFC活性在25～27级分中，经ELISA确证该级分中不含碱性FGF。还确证活性级分26存在剂量依赖性的活性，在添加碱性FGF的分析系统中，其活性比单独用碱性FGF的HPP-CFC活性高。此外，用SDS聚丙烯酰氨电泳(胶浓度10～20％梯度)对活性级分进行分析，在20kDa左右存在条带。
通过以上各个步骤，从120L的S6细胞中得到了0.4μg的级分，其在SDS聚丙烯酰氨电泳分析显现20kDa的条带，经确认那些级分具有HPP-CFC活性，其中此20kDa的条带是具有造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进活性的物质。
(4)具有造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进活性物质的性质本发明目的因子具有下述性质。
1.分子量大约20kDa(SDS-PAGE)经SDS聚丙烯酰氨电泳分析，该因子作为20kDa附近的单一条带被检出，在还原和非还原状态下，移动度没有差别。因此分子间没有二硫键结合。
2.等电点8.1±0.5用AFB MultiphorII(Amersham Pharmacia Biotech K.K.)进行双向电泳分析，该因子检测为静止区域内的一个点。
(5)测定具有造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进活性的物质的结构按照以下的流程，测定该因子的结构。
为MS以及MS/MS测定制备样本将含有鉴定为目的因子的20kDa条带的纯化级分用12.5％丙烯酰胺凝胶进行SDS聚丙烯酰氨电泳分析后，用0.1％CBB/40％MeOH/1％AcOH染色。检出20kDa条带后，切取该条带，在40％MeOH/1％AcOH中脱色。将脱色的胶在10mMDTT/100mM NH4CHO3(pH8.7)中浸泡，56℃孵育1小时。添加55mM碘乙酰胺，暗孵育45分钟来还原并烷基化该因子。从胶中去除过剩的还原剂和烷基化剂后，添加150mg胰蛋白酶(Promega)/5mMCaCl2/50mM NH4HCO3，在37℃条件下进行胶内胰蛋白酶消化18个小时。反应结束后，提取肽片段，用SPEED BACK(Savant)进行干燥。将溶解在0.05％TFA中的肽片段混合物加到用0.05％TFA平衡的PorosR2(Perseptive Co.Ltd.)，并用50％MeOH/0.2％FA洗脱除盐。将除盐后的肽片段混和物作为质谱分析(MS)和串联质谱分析(MS/MS)的样品(条件化的肽片段化合物)。作为阴性对照，从只用样品缓冲液进行SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳的泳道中的认为是20kDa条带的位置切取胶条，按照与该因子相同的方法条件化。详细操作可参考Wilm等人的方法进行(Wilm，M.，Shevchenko，A.，Houthaeve，T.，Breit，S.，Schweigerer，L.，Fotsis，T.and Mann，M.Nature 379，466-469，1996)。
通过MS以及MS/MS分析进行结构测定用Q-TOF(四重极直交加速飞行时间质谱分析仪，Micromass公司)对该因子的结构进行测定。可遵照MS以及MS/MS测定操作指南进行测定。首先，对条件肽片段混合物和阴性对照分别由MS在100～1500的mz范围内进行测定。对于作为肽指示的多价分子离子进行了两种方法的比较，在条件肽片段混合物中明确检测出了3个2价分子离子(见表1)。
表1在MS以及MS/MS分析中得到的主要离子分子离子序号1分子离子583.82(2价)分子离子序号2分子离子669.39(2价)产品离子(y离子)712.43，827.45，990.51，1103.60，1174.66产品离子(i离子)86.08，136.07分子离子序号3分子离子670.9(2价)然后，分别选择这3个2价离子进行MS/MS测定。根据主要产品离子的所得信息，用国际互联网上公开的数据库检索程序之一ProteinProspector(http//prospector.ucsf.edu/mshome3.2.htm)进行检索，得到了众所周知为低分子量肌动蛋白调节蛋白的人非肌肉型Cofilin(ACP23528、pI 8.22、166aa)。目的因子和人非肌肉型Cofilin的分子量、等电点等类似。
可是，仅仅根据MS及MS/MS分析确认本因子是人非肌肉型Cofilin还比较困难。因此，为了将表1中所记述的信息和人非肌肉型Cofilin匹配性进行更加严密的研究，根据得到的信息合成肽(表2)并测定碰撞解离谱验证其同一性。结果得到的信息完全和表1所记载的信息一致。更值得特别指出的是所得信息中含有表2所记载的N末端和C末端肽相关的信息，因此表明该因子的N末端和C末端和人非肌肉型Cofilin一致。据此确定，该因子被确定为人非肌肉型Cofilin(肌动蛋白调节的活性类型)，其在翻译起始点没有甲硫氨酸，接下去的丙氨酸发生了乙酰化，再接下去的丝氨酸没有发生磷酸化(见表1)。
表2根据数据库检索推测的部分氨基酸序列分子离子序号根据信息1推测的N末端肽(AcetN)ASGVAVSDGVIK+添加的Na分子离子序号根据信息2推测的肽
YALYDATYETK分子离子序号根据信息3推测的C末端肽LGGSAVISLEGKPL实施例2Cofilin的制备(1)制备人S6细胞系来源的cDNA文库用含无血清培养基F12(Invitrogen)的摇瓶连续培养S6细胞(1.2×108个细胞)4天。用FastTrack mRNA分离试剂盒(Invitrogen)，制备37μg S6细胞-polyA RNA。由5μg S6细胞-polyA RNA用TimeSaver cDNA合成试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech K.K.)和Directional Cloning Toolbox(Amersham Pharmacia Biotech K.K.)制备在2相对端含有EcoRI(Takara Shuzo Co.，Ltd.)限制性酶切位点和NotI(Takara Shuzo Co.，Ltd.)限制性酶切位点的cDNA。
然后，将cDNA插入到λ噬菌体克隆载体λExCellNotI/EcoRI/CIP(Amersham Pharmacia Biotech K.K.)，用GigapackIII Gold Packaging Extract(Stratagene)进行体外包装。以大肠杆菌NM522(Stratagen)为宿主，根据琼脂培养基上的嗜菌斑数目测定效价为1.37×106pfu。此外，以大肠杆菌NM522为宿主，进行文库扩增，得到了6.9×1010pfu/ml效价的S6细胞cDNA文库。S6细胞cDNA文库的平均插入大小是1.0kb。
(2)用PCR全长克隆人非肌肉型Cofilinc的DNA。
根据胎盘来源的人非肌肉型Cofilin的氨基酸序列的编码碱基序列(ACD00682，501bp)合成了寡聚物SK013(对应于图2的1～16，引物SK013SEQ ID NO3)和SK014(对应于图2的476～501所，引物SK014SEQ ID NO∷4)。
引物SK0135’-ATGGCCTCCGGTGTGGCTGTCTCTGA-3’(SEQ ID NO∷3)引物SK0145’-TCACAAAGGCTTGCCCTCCAGGGAGA-3’(SEQ ID NO∷4)人非肌肉型Cofilin的cDNA以上述S6细胞cDNA文库为模板，用SK013(SEQ ID NO∷3)和SK014(SEQ ID NO∷4)作为引物，用Advantage2聚合酶(CLONTECH公司)进行PCR扩增。将此扩增产物用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen公司)亚克隆到pCR-Blunt II-TOPO载体中，得到具有约500个碱基对的DNA片段的阳性克隆。对此阳性克隆，用BigDye Terminater Cycle Kit(Applied Biosystems公司)用ABI PRISM310(Applied Biosystems公司)进行碱基序列分析，确认取得了501个碱基对的非人肌肉型Cofilin的cDNA全长。和胎盘来源的非肌肉型Cofilin cDNA的碱基序列相比，S6细胞来源的存在2个碱基的差异，不过二者都没有氨基酸突变(图3)。
(3)人非肌肉型Cofilin cDNA表达载体的构建非肌肉型Cofilin cDNA克隆和pKDEMSS载体(Kitano K，Fukuda Y，Nagahira K，Nasu T，Izumi R，Kawashima K，Nakanishi T ImmunoL. Lett.47，215-222，1995)来源的pDE载体经EcoRI消化后，用碱性磷酸酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)去磷酸化。之后，将含有非肌肉型Cofilin cDNA的EcoRI片断和pDE载体DNA片断进行琼脂糖电泳，切取含有DNA的胶，用CONCERT Rapid GelExtraction System(Invitrogen)进行纯化。用DNA连接试剂盒(TakaraShuzo Co.，Ltd.)将非肌肉型Cofilin片段插入到pDE载体的DNA片段中并用于转化大肠杆菌JM109(Toyobo Co.，Ltd)，由此制备人非肌肉型Cofilin的表达载体。用限制性内切酶确认表达载体中插入的人非肌肉型Cofilin cDNA相对于表达所用启动子而言其方向是正向。
(4)在COS-1细胞中表达人非肌肉型Cofilin按照以下的流程将重组人非肌肉型Cofilin进行表达，并对表达进行确认。
在COS-1细胞中表达人非肌肉型Cofilin用人非肌肉型Cofilin cDNA表达载体，在动物细胞中表达人非肌肉型Cofilin，对所表达的蛋白质是否具有HPP-CFC活性进行检测。用COS-1(购自理化研究所)作为宿主动物细胞。用脂转染技术转染此人非肌肉型Cofilin cDNA。具体来说，在直径为10cm的培养皿(Corning，430167)中接种1×106个COS-1细胞。培养基为含10％胎牛血清的Dulbecco最小必需培养基(DMEM、NISSUIPHARMACEUTICAL CO.，LTD)。第二天，用Opti-MEM I培养基(Invitrogen)5ml浸洗1次后，然后加入5ml的Opti-MEM I培养基，在37℃培养细胞2小时。培养2小时后，加入在实施例2(3)中制备的表达质粒1μg以及脂转染试剂(lipofectin，Invitrogen)10μg的混和液，在37℃再培养5小时，培养后，加入5ml Opti-MEM培养基，共计10ml。在5％CO2存在的条件下，于37℃培养72小时。培养72小时后，离心回收上清。用没有插入人非肌肉型Cofilin的表达载体作阴性对照进行同样的表达过程。
分泌型重组人非肌肉型Cofilin的检测用SDS聚丙烯酰氨电泳分析培养上清显示转入了人非肌肉型Cofilin cDNA载体的培养上清有可见的重组人非肌肉型Cofilin的20kDa条带。此20kDa条带在蛋白质印迹分析中，能够和兔抗人非肌肉型Cofilin肽(13～22)的多克隆抗体(Cytoskeleton)发生特异反应。因此确认重组人非肌肉型Cofilin的分泌。根据蛋白印迹分析和SDS聚丙烯酰氨电泳分析，分泌型重组Cofilin的表达量为每毫升约有2.5μg。
分泌型天然人非肌肉型Cofilin的检出对转入了未插入人非肌肉型Cofilin的原始载体(pDE载体)的细胞的培养上清用加入10％三氯乙酸进行沉淀后，将100体积的沉淀进行上述同样的蛋白质印迹分析时，也检测出了微弱的天然人非肌肉型Cofilin条带。由此说明，认为只在细胞内部存在的非肌肉型Cofilin也有微量的分泌型。
实施例3重组人非肌肉型Cofilin作为具有造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进活性的物质的活性确认。
为了评价COS-1细胞表达的分泌型重组人非肌肉型Cofilin是否为具有造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进活性的物质，对其培养上清进行了HPP-CFC分析。
对小鼠DBF1(雌性，10～15周龄、购自日本Charles River公司)施用5-氟尿嘧啶(150mg/kg，i.v.，KYOWA HAKKO KOGYO Co.，Ltd.)，2天后，从大腿骨中采取骨髓细胞。用大鼠抗小鼠CD4抗体(CALTAG)、CD8抗体(CALTAG)、B220抗体(CEDERLANE)、Gr-1抗体(CEDERLANE)、和Mac-1抗体(CALTAG)对所取骨髓细胞进行标记。这些抗体全部是IgG。接着，用Dyna珠(DYNAL)标记的的山羊抗大鼠IgG抗体进行反应后，磁性去除结合有Dyna珠的细胞，获得细胞谱系阴性的骨髓细胞(Lin-BMCs)。这些细胞用作HPP-CFC分析中的造血干细胞级分。
将得到的造血干细胞级分在添加了10％FCS的α-MEM培养基中调节至浓度为2.5×104个细胞/ml。向此细胞悬浮液中添加小鼠IL-3(以最终浓度为10ng/ml)后，将此细胞悬浮液加到24孔板(Corning)中，每孔1ml。将实施例2制备的Cofilin培养上清或细胞因子加入每孔，进行液体培养，将部分含造血干细胞的条件培养液用于集落分析，通过计数所形成的宏观HPP-CFC集落数对HPP-CFC的活性进行测定。
图4中，Cofilin 1、2、3、4分别指的是10倍浓度的Cofilin培养上清的1-、10-、100-、和1000倍稀释。因实施例2中分泌型重组人非肌肉型Cofilin的表达量是2.5μg/ml。其中具有所加稀释的Colifin培养上清1/10体积的液体培养的αMEM培养基中，重组型人Cofilin的浓度分别是Cofilin 1为2500ng/ml、Cofilin 2为250ng/ml、Cofilin 3为25ng/ml、Cofilin 4为2.5ng/ml。再参见图4，C1、C2代表加入与培养上清等量PBS的孔。SCF1、SCF5、SCF10分别表示在液体培养的培养基中含有1ng/ml、5ng/ml和10ng/ml的SCF。图4数据表示在液体培养第6天和第10天各个孔的200μl细胞悬液中HPP-CFC的集落数目。输入值表示液体培养前200μl细胞悬浮液中的HPP-CFC集落数。
和阴性对照相比较，重组人非肌肉型Cofilin，以目的因子特有的显著的浓度依赖方式显示HPP-CFC活性，该因子在液体培养第10天倾向比第6天活性高(图4)。测得活性的浓度为25ng/ml(图4中由Cofilin3标记)和SCF的1ng/ml(图4中由SCF1标记)相当。在阴性对照的培养上清中可以测得分泌型的天然人非肌肉型Cofilin，这暗示所述Cofilin与HPP-CFC活性有一定关系(图4)。
经过上述过程，本发明人发现已知为低分子量肌动蛋白调节蛋白质的人非肌肉型Cofilin可作为具有造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进活性的物质。
实施例4重组人非肌肉型Cofilin促进人造血干细胞和/或造血前体细胞(CD34+细胞)增殖的活性评价为了解重组人非肌肉型Cofilin是否具有促进人造血干细胞和/或者造血前体细胞增殖，将实施例2制备的含有重组人非肌肉型Cofilin的COS-1细胞培养上清添加到人造血干细胞的培养中。
向人脐带血中加入硅胶悬浊液达到10％(V/V)并缓慢搅拌混合物。在37℃静置大约1小时。在重力为1.077的lymphpprep(NYCOMED公司)上覆盖后，于1600转/分钟条件下进行重力离心30分钟，得到单核细胞级分。然后，用Direct CD34前体细胞分离试剂盒以及Auto-MACS(Miltenyi Biotec)得到了CD34阳性细胞。将如此得到的CD34阳性细胞在补充有20％FCS(CCT)和1％BSA(SIGMA)的αMEM(GIBCO)的培养基中调节至细胞浓度为1×104个细胞/ml，加入到12孔培养板(Falcon)中，每孔添加1ml。
向这样制备的SCF+FL组培养板中加入人SCF(100ng/ml，R&D)和人Flt-3配体(FMA-样酪氨酸激酶3配体，FL；100ng/ml，R&D)；向SCF+FL+Cofilin组中加入人SCF(100ng/ml，R&D)和人FL(100ng/ml，R&D)以及100μl实施例2所制备的含有重组型人非肌肉型Cofilin的COS-1细胞培养上清的10倍浓缩液，然后在CO2温箱中于37℃条件下孵育。在PBS组(对照组)，只加入等量的PBS替代上述的SCF、FL以及Cofilin。在培养的第3、5、7、9、12以及14天用血球计数板在显微镜下测定细胞数。用相对于培养开始时初期细胞数的增殖倍数表示结果，并将其表示在图5中。
其结果表明人非肌肉型Cofilin和SCF+FL共存的情况下，人脐带血来源的CD34阳性细胞随时间增殖，与只添加SCF+FL的情况相比，表现出显著的增殖活性。具体而言，在培养的第14天时，增加到比初期细胞数高约90倍(图5)。
实施例5重组人非肌肉型Cofilin促进人造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖和分化的活性评价。
用实施例2制备的含有重组人非肌肉型Cofilin的COS-1细胞培养上清做实验，以各种细胞集落形成能力为增殖和/或分化促进活性的指标来了解重组型人非肌肉Cofilin是否具有促进人造血干细胞和/或者造血前体细胞的增殖和分化的活性。
首先，将人脐带血来源的CD34阳性细胞按照实施例4所述调节浓度到2.5×104个细胞/ml，然后向12孔培养板的每个孔中加入1ml。将实施例2制备的含有重组人非肌肉型Cofilin的COS-1细胞培养上清进行10倍浓缩，从中取出100μl和人SCF(100ng/ml)、人FL(100ng/ml)和/或者人TPO(100ng/ml，R&D)以多种组合添加到上述培养板中，培养7天后，用血球计数板在显微镜下对细胞数目进行测定。结果用相对于培养开始时的初期细胞数的增殖倍数表示，图6A出示各个组情况“T/C”组存在人TPO(100ng/ml，R&D)和上述的含有Cofilin的培养上清；“S/F/C”组存在人SCF(100ng/ml)、人FL(100ng/ml)以及上述的含有Cofilin的培养上清；“S/F/T”组存在人SCF(100ng/ml)、人FL(100ng/ml)以及人TPO(100ng/ml，R&D)；“S/F”组存在人SCF(100ng/ml)和人FL(100ng/ml)；C组存在上述的含有Cofilin的培养上清；且T组存在人TPO(100ng/ml，R&D)。PBS组表示在只添加PBS的条件下的培养物。
结果，当人非肌肉型Cofilin和SCF以及FL共存时(即S/F/C组)令人脐带血来源的CD34阳性细胞显著增殖，显示出的增殖活性约为S/F组的6倍，约是S/F/T组的2倍，培养第7天时增殖到大约“输入值”(培养前200μl细胞悬浊液中的集落数)的58倍(见图6A)。
接着，取一部分上述的(1)中的培养了7天的人脐带血来源的CD34阳性细胞悬浊液，用甲基纤维素法进行集落形成分析。
按照以下的步骤用甲基纤维素法进行集落形成分析。以αMEM为基础，在半固体培养基中添加2.2％甲基纤维素(信越化学有限公司)、30％FCS、1％BSA、5×10-5M 2ME(和光纯药)、SCF(100ng/ml)、IL-3(20ng/ml)、TPO(10ng/ml、R&D)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF；10ng/ml，CHUGAI PHARMACEUT1CAL有限公司)及红细胞生成素(EPO；2U/ml，麒麟麦酒有限公司)，并于37℃，5％CO2的条件下在所得培养基中培养所取得的CD34阳性细胞2周，以形成各种细胞集落。
在形成的各种细胞集落中，确定粒细胞巨噬细胞相关前体细胞(集落形成单位粒细胞，巨噬细胞，CFU-GM)、红细胞相关前体细胞(爆发集落形成单位红细胞，BFU-E)和骨髓相关干细胞(集落形成混合单位，CFU-Mix)的集落，并利用倒置显微镜进行目测观察计数。CFU-GM指的是由较小细胞密集聚集形成的粒细胞集块和较大细胞聚集形成的粗糙的巨噬细胞集块构成的细胞集块，可以同BFU-GM相区分，后者指由因血红蛋白合成而变成红色的细胞的较大集块。对于判别困难的集块和没有典型集落形态的集块，可以在制做成细胞纤维(cytospun)样品后，根据May-吉姆萨染色进行判断。大于50个由粒细胞和巨噬细胞构成的细胞集块被评价为CFU-GM集落，而500个以上的红细胞的细胞集块被评价为BFU-E集落，包含BFU-E和至少50个其它系谱细胞的集落被被评价为CFU-Mix集落。结果各自用相当于培养开始时的初期细胞数的增殖倍数表示，图6B～6D分别表示了CFU-GM、BFU-E和CFU-Mix集落的结果。
人非肌肉型Cofilin和SCF以及FL共存(即S/F/C组)条件下允许人脐带血来源的CD34阳性细胞增殖，然后对细胞进行集落形成分析。结果，CFU-GM、BFU-E以及CFU-Mix的集落数分别为“输入值”(培养前的200μl细胞悬浮液中的集落数)的约4倍、约6倍以及约8倍(图6B、6C、6D)。具体而言，BFU-E和CFU-Mix的集落数目比其他任何细胞因子的联用都多得多。
实施例6重组人非肌肉型Cofilin促进人巨核细胞的前体细胞增殖和分化的活性评价发明人用实施例2制备的含有重组人非肌肉型Cofilin的COS-1细胞培养上清进行实验，以巨核细胞的前体细胞(集落形成单位巨核细胞，CFU-Mk)的集落形成能力为指标来了解重组人非肌肉型Cofilin是否具有促进人巨核细胞的前体细胞增殖和分化的活性。
首先，按照实施例4所述方法将人脐带血来源的CD34阳性细胞浓度调至2.5×104个细胞/ml，向12孔培养板的每个孔中加入1ml。将实施例2制备的含有重组型人非肌肉Cofilin的COS-1细胞培养上清进行10倍浓缩，从中取出100μl和人SCF(100ng/ml)、人FL(100ng/ml)和人TPO(100ng/ml，R&D)参照实施例5进行组合，即以T/C组、S/F/C组、S/F/T组、S/F、C组、T组的条件添加，培养7天。PBS组表示在只添加PBS的条件下的培养物。
接着，取部分培养7天的人脐带血来源的CD34阳性细胞的悬浊液，用MegaCult-C(Stem Cell Technologies)使之形成CFU-Mk集落，鉴定巨核细胞和测定集落数。具体而言，将部分(100μl)细胞悬浮液添加到胶原蛋白凝胶(含有IL-3、IL-6以及TPO)中搅拌后，移到培养用玻片的小室中，培养12～14天，使之形成CFU-Mk集落。将玻片上的细胞用甲醇/丙酮溶液固定后，用抗-GP(糖蛋白)IIb/IIIa(人巨核细胞的标记物)抗体免疫染色和用Evans蓝染色细胞核来检测巨核细胞。在实施例6中，在显微镜下观察时，将由20个以上巨核细胞组成的细胞集块计为一个CFU-Mk集落。其结果用相当于培养开始时的初期细胞数的增殖倍数表示，此结果示于图7。
人非肌肉型Cofilin和SCF以及FL共存(即S/F/C组)条件允许人脐带血来源的CD34阳性细胞增殖，将细胞再进行集落形成分析。结果，CFU-Mk集落扩增到“输入值”(培养前的200μl细胞悬浮液中的集落数)的约4倍(见图7)。由其他细胞因子组合得到的扩增效果跟输入值基本相同。
实施例7重组人非肌肉型Cofilin在人巨核细胞的前血小板(Proplatelet)形成中的活性评价用实施例2制备的含有重组人非肌肉型Cofilin的COS-1细胞培养上清进行形态学研究来了解重组人非肌肉型Cofilin是否具有人巨核细胞的前血小板形成活性。
在具有1％BSA和GIBCO补充成分(胰岛素，10μg/ml；转铁蛋白，5.5μg/ml；氨基乙醇，2mg/ml、亚硒酸，6.7mg/ml)的αMEM培养基中调节人脐带血来源的CD34阳性细胞的浓度为2.5×104个细胞/ml，向12孔培养板的每个孔中加入1ml。然后将实施例2制备的含有重组人非肌肉型Cofilin的COS-1细胞培养上清进行10倍浓缩，从中取出100μl和人TPO(100ng/ml)单独添加或者组合添加，然后在5％CO2、37℃的条件下，培养7天。在第7天时，再补充1ml与各个孔中的培养基相同组成的培养基，继续培养。之后，在显微镜下观察，确认有无形成巨核细胞的前血小板。
人非肌肉型Cofilin和TPO共存的条件使人脐带血来源的CD34细胞向巨核细胞方向显著分化并生长(图8)，使得在培养2周左右后，在部分成熟的巨核细胞中形成了认为是反映血小板释放前阶段的可见的前血小板(图9)。可是，单独添加人非肌肉型Cofilin或者TPO组没有检测到前血小板的形成。
工产实用性本发明提供含Cofilin为有效成分的造血干细胞和/或者造血前体细胞增殖和/或者分化促进剂，由此提供促进广泛种类的血液细胞的增殖和/或者分化的功效。利用这个功效，该促进剂可以用作治疗各型血细胞减少症和/或者造血功能低下相关疾病的药物。进一步，该促进剂剂还可以在再生治疗领域有效再生血液细胞。
序列表<110>SUNTORY LIMITEDSUNTORY BIOMEDICAL RESEARCH LIMITED<120>造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖和/或分化促进剂<130>YCT-785<150>JP 2001-400330<151>December 28，2001<160>4<200>1<211>166<212>PRT<213>人<223>人Cofilin的氨基酸序列<400>1Met Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Asp Gly Val Ile Lys Val Phe Asn5 10 15Asp Met Lys Val Arg Lys Ser Ser Thr Pro Glu Glu Val Lys Lys Arg20 25 30Lys Lys Ala Val Leu Phe Cys Leu Ser Glu Asp Lys Lys Asn Ile Ile35 40 45Leu Glu Glu Gly Lys Glu Ile Leu Val Gly Asp Val Gly Gln Thr Val
50 55 60Asp Asp Pro Tyr Ala Thr Phe Val Lys Met Leu Pro Asp Lys Asp Cys65 70 75 80Arg Tyr Ala Leu Tyr Asp Ala Thr Tyr Glu Thr Lys Glu Ser Lys Lys85 90 95Glu Asp Leu Val Phe Ile Phe Trp Ala Pro Glu Ser Ala Pro Leu Lys100 105 110Ser Lys Met Ile Tyr Ala Ser Ser Lys Asp Ala Ile Lys Lys Lys Leu115 120 125Thr Gly Ile Lys His Glu Leu Gln Ala Asn Cys Tyr Glu Glu Val Lys130 135 140Asp Arg Cys Thr Leu Ala Glu Lys Leu Gly Gly Ser Ala Val Ile Ser145 150 155 160Leu Glu Gly Lys Pro Leu165<200>2<211>501<212>DNA<213>人<223>人Cofilin的核苷酸序列<400>2atggcctccg gtgtggctgt ctctgatggt gtcatcaagg tgttcaacga catgaaggtg 60cgtaagtctt caacgccaga ggaggtgaag aagcgcaaga aggcggtgct cttctgcctg 120agtgaggaca agaagaacat catcctggag gagggcaagg agatcctggt gggcgatgtg 180ggccagactg tcgacgatcc ctacgccacc tttgtcaaga tgctgccaga taaggactgc 240cgctatgccc tctatgatgc aacctatgag accaaggaga gcaagaagga ggatctggtg 300tttatcttct gggcccccga gtctgcgccc cttaagagca aaatgattta tgccagctcc 360
aaggacgcca tcaagaagaa gctgacaggg atcaagcatg aattgcaagc aaactgctac 420gaggaggtca aggaccgctg caccctggca gagaagctgg ggggcagtgc ggtcatctcc 480ctggagggca agcctttgtg a 501<200>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<223>扩增人Cofilin基因的引物序列<400>3atggcctccg gtgtggctgt ctctga 25<200>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<223>扩增人Cofilin基因的引物序列<400>4tctccctgga gggcaagcct ttgtga 2权利要求
1.含Cofilin为有效成分的造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖和/或分化促进剂。
2.根据权利要求1的造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖和/或分化促进剂，其中Cofilin具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列或在SEQ ID NO1所示的Cofilin的氨基酸中含有一或者多个氨基酸缺失、置换和/或添加的氨基酸序列，该Cofilin具有促进造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化的活性。
3.根据权利要求1的造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖和/或分化促进剂，其中Cofilin具有SEQ ID NO1所示的氨基酸与序列或具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的编码碱基序列的互补碱基序列在严紧条件下可以与之杂交的碱基序列所编码的氨基酸序列，该Cofilin具有促进造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化的活性。
4.根据权利要求1的造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖和/或分化促进剂，其中Cofilin具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列或者同Cofilin氨基酸序列(SEQ ID NO1)具有至少30％氨基酸序列同源性的氨基酸序列，该Cofilin具有促进造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化的活性。
5.根据权利要求1的造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖和/或分化促进剂，其中Cofilin由SEQ ID NO2所示的碱基序列或者在严紧条件下，可和SEQ ID NO2所示Cofilin的碱基序列的互补碱基序列进行杂交的碱基序列所编码，该Cofilin具有促进造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化的活性。
6.根据权利要求1的造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖和/或分化促进剂，其中Cofilin由SEQ ID NO2所示的碱基序列或者包含和SEQ ID NO2所示的碱基序列有至少30％碱基序列同源性的碱基序列所编码，该Cofilin具有促进造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化的活性。
7.根据权利要求1到6中任何一项的造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖和/或分化促进剂，其中Cofilin是基因重组技术产品。
8.根据权利要求1到7中任何一项的造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖和/或分化促进剂，其中Cofilin含有糖链。
9.根据权利要求1到8中任何一项的造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖和/或分化促进剂，其进一步含有另一种细胞因子。
10.根据权利要求9的造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖和/或分化促进剂，其中的另一种细胞因子是至少以下成员之一白介素(IL)-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10和IL-11、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、红细胞生成素(EPO)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子(TGF-α)、蛋白酶连接蛋白I、蛋白酶连接蛋白II、血小板来源的生长因子(PDGF)、胆碱能分化因子(CDF)、白细胞移行抑制因子(LIF)、干细胞因子(SCF)、flk-2/flt-3配体(FL)、血小板生成素(TPO)、IL-6/可溶性IL-6受体复合物或者超IL-6(来自IL-6和可溶性IL-6受体的融合蛋白质)。
11.根据权利要求9的造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖和/或分化促进剂，其中所述另一种细胞因子是IL-3。
12.根据权利要求9的造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖和/或分化促进剂，其中所述另一种细胞因子是干细胞因子(SCF)、flk-2/flt-3配体(FL)或其组合。
13.根据权利要求1到12中任何一项的造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖和/或分化促进剂，其用于治疗造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖和/或分化不足所导致的疾病。
14.根据权利要求1到12中任何一项的造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖和/或分化促进剂，其用于治疗各型血细胞减少症和/或造血功能低下相关疾病。
15.根据权利要求1到12中任何一项的造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖和/或分化促进剂，其可用于再生医疗。
16.促进造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化的方法，其包括施用至少一种根据权利要求1到12中任何一项的造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖和/或分化促进剂。
17.治疗造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖和/或分化不足所导致的疾病的方法，其包括施用至少一种根据权利要求1到12中任何一项的造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖和/或分化促进剂。
18.根据权利要求17的方法，其中由造血干细胞和/或造血前体细胞的增殖和/或分化不足导致的疾病是各型血细胞减少症和/或造血功能低下相关疾病。
19.通过使用至少一种根据权利要求1到12中任何一项的造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂离体扩增造血干细胞的方法。
20.涉及使用至少一种根据权利要求1到12中任何一项的造血干细胞和/或造血前体细胞增殖和/或分化促进剂离体扩增造血干细胞的再生医疗的方法。
全文摘要
本发明提供造血干细胞和/或者造血前体细胞的增殖和/或者分化促进剂，此促进剂可作为药物用于治疗因造血干细胞和/或者造血前体细胞的增殖和/或者分化不足引发的疾病，尤其用于各型造血细胞减少症和/或造血功能低下相关疾病的治疗。本发明提供了含Cofilin为活性成分的造血干细胞和/或者造血前体细胞的增殖和/或者分化促进剂。
文档编号A61K38/16GK1499980SQ02807279
公开日2004年5月26日 申请日期2002年12月27日 优先权日2001年12月28日
发明者三浦健寿, 忠, 春山宗忠, 保, 児玉志保 申请人:第一三得利制药株式会社, 株式会社第一三得利生物医学研究所