一种提取早期造血前体干细胞的方法及其应用的制作方法

一种提取早期造血前体干细胞的方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种提取早期造血前体干细胞的方法及其应用。一种大量提取造血前体干细胞的方法，包含以下步骤：(1)从胎盘中分离单个核细胞；(2)从单个核细胞中先分选出CD133+阳性细胞群，然后再从CD133+阳性细胞群中分选出其中的CD133+CD34+细胞群，而流出的细胞群即为CD133+CD34-的造血前体干细胞。本发明发现在胎盘中含有比脐带血浓度高10倍以上，含量高30倍以上的CD133+CD34-干细胞群，这种细胞群不但是造血干/祖细胞的起始细胞，具有长期重建造血细胞的能力，是移植给宿主后可以长期植活的干细胞，而且还具有较强的可塑性，在再生医学和治疗细胞损伤等疾病中具有广泛的应用前景。
【专利说明】-种提取早期造血前体干细胞的方法及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药领域，涉及一种大量提取造血前体干细胞的方法及其应用， 具体涉及一种从人体健康胎盘中大量提取早期造血前体干细胞的方法及其应用。

【背景技术】
[0002] 随着科学技术的进步，人们发现干细胞在特定条件下可经诱导分化为其它种类细 胞，人们期望将来用该种方法进行组织修复，用于治疗帕金森症、糖尿病、老年性痴呆、也脏 病、脊髓损伤等。我们的专利"从胎盘组织中提取造血干细胞用于建立造血干细胞库的方 法"，专利号；ZL011311908,国际专利主分类号；C12N5/08中指出胎盘中含有丰富的造血干 细胞，因此可W代替异体骨髓来恢复重建患者的骨髓，换言之，即用它来置换骨髓。同时在 我们的另一篇专利中也提出了 "一种从剖腹产胎盘组织中提取原始间充质和造血干/祖细 胞方法"（专利号：200610098886)。该种方法可W用来收集来自于胎盘组织的单个核细胞 去建立造血前体干细胞库。应用该些方法可W收集并长期冻存现在废弃的新生儿胎盘内的 细胞，胎盘组织内的造血干细胞，建立自体或异体的胎盘造血前体干细胞储存库，提供全国 乃至全世界患者选择胎盘造血前体干细胞为细胞治疗应用。
[000引 CD34分子一直被认为是服C/造血祖细胞她C)的表面标记。血液界到目前为止 都W CD34+的HSC的含量作为移植能否成功的值标。1997年有科学家发现在哺乳动物体内 存在一群CD34-细胞也有重建造血的功能，表明CD34+是较为成熟的细胞，而CD34 -细胞是 更原始的服C。W后又有人提出表达CD133,不论是CD34阳性或阴性的服C/HPC移植到免 疫缺陷小鼠可W形成异位造血组织。同时发现CD133巧SC具有更强的促进血管形成的作用。 厮血CD133+细胞群中不仅富含服C (实际上当时没有人认识到厮带血只含有少量的CD34-细胞，大部分是CD34+细胞），而且该一群细胞具有更强的增殖潜能和长期造血重建功能，该 些提示CD133是比CD34更原始更幼稚的干细胞标志。研究证实，处于G。期的CD133+细胞 较处于Gi期的CD133-细胞更易大量富集而被激活参与造血，其长期造血功能优于CD34+细 胞群。
[0004] 自从发现、纯化、标记抗CD34单克隆抗体开始，使流式细胞定量检测在厮带和胎 盘血或骨髓中的CD34阳性造血干细胞成为了可能。CD34抗原存在于各种祖细胞上，其中包 括多能干细胞和间充质干细胞。CD34抗原的分子量为105-120KD，具有一个高度糖基化的 类粘蛋白的结构。在流式细胞仪检测中，对全血进行溶血来去除红细胞，标本中直接加入英 光标记的CD34抗体进行染色，然后用流式机进行分析和计算。人CD34阳性细胞是造血干 细胞移植时的关键细胞，决定着移植成功与否的重要条件。目前，临床上对是否能够移植都 WCD34阳性细胞数量为唯一重要标准。人CD133抗原为5次跨膜糖蛋白，目前发现的同源 性抗原有CD133_1和CD133_2。其基因分别定位在人类的4号和2号染色体上。CD133首 先是作为造血干/祖细胞表面标志物而被发现，并被认为是比CD34更早期的表面抗原。利 用取自人类骨髓血经增生后的CD133+，带有该种标记的细胞也称为血管先驱细胞。细胞直 接注入也肌梗塞的大鼠也脏，有也肌细胞恢复的功能。从外周血中也可W分离出CD34+细 胞，在体外将其诱导分化成内皮细胞，植入动物下肢缺血模型中局部形成新生血管。还可能 治疗缺血性疾病如也肌梗死、动脉硬化闭塞症、糖尿病等，该些引起了人们的广泛兴趣。近 来发现CD133分子是服Cs (造血干细胞）特异性标志。CD133是一个新发现的造血干细胞 表面标志，在服Cs分化成熟过程中，CD133的含量迅速降低，而CD34抗原开始表达，当向血 液细胞分化时，CD34抗原表达开始消失。
[0005] 上述大量的临床实践已证实，来自于骨髓、动员周围血及厮带血中含有大量的造 血干/祖细胞，即CD34+细胞，该种细胞能够重建受损伤的造血组织恢复造血功能。而该种 CD34+细胞来自于其更早期的细胞，即从CD133阳性细胞分化而来，而正是该种CD133+CD34+ 或CD33+CD34-细胞群移植给宿主后可W长期植活。厮带血中仅含有少量CD133+CD34-细胞， 该也造成厮带血移植后，部分造血干细胞不易植活，或需要植活的时间长的重要原因之一。


【发明内容】

[0006] 本发明首先发现厮带血中不含有CD33+CD34-细胞，而胎盘血和胎盘组织富含该类 细胞，仅管骨髓也有该类细胞，但骨髓不能规模提取。本发明的目的是针对现有技术的上述 不足，提供一种从胎盘大量提取早期造血前体干细胞的方法。
[0007] 本发明的另一目的是提供胎盘造血前体干细胞的应用。
[000引本发明的目的可通过W下技术方案实现：
[0009] 本发明从胎盘血和胎盘组织中发现一种新型的干细胞群，命名为胎盘早期造血前 体干细胞：
[0010] (1)该种细胞群来自于去除厮带血后残留在胎盘内的血液或是从胎盘组织中经过 机械处理（冲洗、挤压、碼磨），或酶消化（膜酶、胶原酶、木瓜酶）等获得的单个核细胞。
[0011] (2)该种细胞群在流式细胞仪（FACS)的检测中为CD133+CD34XDl(n-CD29-CD3r， 几乎不存在于正常人周围血和厮带血中。
[001引 做造血前体干细胞为一群CD133+CD34-和CD133+CD34+的干细胞群，而 〔0133+〔034^为早期造血前体干细胞，该种干细胞存在于提取的胎盘干细胞内，它可^通过 胎盘分离浓缩后于液氮内长期保存。
[0013] (4)该种细胞群在干细胞集落培养试验中，其形成集落细胞（即每个细胞能扩增 成50个细胞W上）远较CD133-CD34+细胞为晚，在培养后的24小时，后者即可形成大量 成堆的细胞群的集落，而早期造血前体干细胞细胞需96小时W上。CD133-CD34+细胞能 生成早期集落，但不易长期生长，而是CD33+细胞可W长期稳定生长，移植标准应该W程度 CD133+的含量多少来预测移植物的植活效果
[0014] (5)该种细胞群可W和干细胞生长因子佑-CSF、GM-CSF、SCF等）或血管内皮生长 因子（VEG巧等共同培养，该细胞群可贴壁生长，具有明显的迁移性，形成单层细胞，具有向 内皮细胞分化的功能，即该类细胞可分化为CD133+的血管内皮干/祖细胞。
[0015] (6)该类细胞在有干细胞刺激因子佑-CSF，EP0)的培养液中，具有大量增殖的功 能，可W扩增到1000倍W上，其扩增后的终未细胞主要为红细胞系，巧PO的刺激下），但如 果和白细胞刺激因子共同培养，也可扩增为大量的白细胞。
[0016] (7)该类细胞具有更大的可塑性，在体外培养系统中，当该类细胞贴壁生长W后， 加入组织细胞相应的刺激因子，具有向肝脏细胞，骨细胞，也脏细胞，神经细胞等形成的能 力。
[0017] (8)在移植免疫免疫缺陷病小鼠动物模型中，W同等剂量，用来自胎盘的早期造血 前体干细胞CD133+CD34-细胞群和CD133+CD34+细胞群注射给干细胞移植小鼠动物，早期造 血干细胞具有长期植活效能。
[0018] (9)早期造血前体干细胞的标志为CD133+CD34-，而CD133分子量为120邸a,具有5 个跨膜区，它在体外培养中，可W形成各种红细胞，（CFU-E)，白细胞（CFU-GM和CFU-GEMN) 集落群。可W采用MACS磁珠分选的方法，体外纯化该种造血前体干细胞。
[0019] 一种大量提取早期造血前体干细胞的方法，优选包含W下步骤：
[0020] (1)从胎盘组织或胎盘血中分离单个核细胞；
[0021] (2)从单个核细胞纯化CD133阳性细胞中的早期造血前体干细胞。
[0022] 其中，所述的从胎盘中分离的单个核细胞优选进行浓缩后在进行分选。
[0023] 步骤（2)从单个核细胞纯化CD133阳性细胞中的早期造血前体干细胞优选W下任 一方法，进一步优选W下的磁珠法。
[0024] (1)磁珠法，0)流式法，0)双抗体法，（4)活体培养法
[00巧]磁珠法：采用带抗CD133抗体的磁珠和来自胎盘的单个核细胞混合，赔育，然后通 过一个和磁珠相结合的分离柱，所有带有CD133抗原的细胞都结合在柱子上，其它的细胞 均冲洗掉。然后改变酸碱度的缓冲液冲洗残留在柱子内的带CD133抗原的细胞，该个细胞 群为所有CD133+的细胞，该种方法回收率在80% W上，纯度可高达90%。把浓缩后的CD133 阳性细胞，再经过含抗CD34抗体的磁珠，用同样的方法分离，所有CD133+CD34-细胞先行洗 脱下来，残留在柱子体内的为CD133+CD34+细胞群。
[0026] 流式细胞仪分选法；采用流式细胞仪双抗体带各种英光标记方法，可W从单个细 胞分选所需要的细胞，在此采用的是抗CD133抗原及抗CD34抗原的双抗体，能够从胎盘分 离和浓缩后的单个核细胞分选所需要的CD133+CD34-和CD133+CD34+的细胞群。
[0027] 双抗体法：此时采用当抗体和具有该抗原的细胞给合后，再加入抗第一抗体的第 二抗体，则可把该细胞从溶液中分流出来。该儿也是采用如鼠抗人CD133抗体，鼠抗人CD34 抗体，然后再加入羊抗鼠IgG的抗体，则可成功的把所需要的细胞分离出来。
[0028] 活体培养法；采用无免疫功能的小鼠，把大量从胎盘中分离，浓缩后的单个核细胞 输注给小鼠，在一定的时间，如2,4周，从小鼠骨髓中提取干细胞，其内含有大量人来源的 能维持长期植活的造血干细胞，然后再结合着磁珠或流式分选法，分选出具有CD133+的细 胞。
[0029] 步骤（1)所述的从胎盘血和胎盘组织中分离单个核细胞的方法优选：
[0030] (1)收集胎盘，向厮带静脉内注入含有25到50毫升抗凝剂和抗生素的生理等渗溶 液或缓冲液，采用厮带动、静脉灌注法收集胎盘血。
[0031] (2)采用有机溶剂及生理缓冲液清除胎盘组织和厮带外表的透明质粘液，采用机 械挤压及酶和生理缓冲液冲洗的方法，冲洗掉任何残留的血液；
[0032] (3)离也收集胎盘组织干细胞；将胎盘组织、羊膜和绒毛膜组织用生理盐水洗涂 后剪碎，采用0. 25%的膜酶、0. 1-1 %的胶原酶II、0. 5% Dispense II酶，或加入0. 05到 0. 2%的邸TA,在37C温箱内赔育或揽拌30到60min，收集、过虑、离也获得的细胞为胎盘单 个核细胞。
[0033] 其中，步骤（3)所述的过滤、离也的蓋体方法为：
[0034] 过滤；收集后的胎盘血和组织干细胞均通过各层尼龙或钢丝滤网，最小的为 50um,最大的为100mm，收集单个核细胞；
[0035] 离也；将W上细胞收集到50毫升的离也管内，在离也机中W l，500g离也10分钟， 去掉70 %的液体，然后按照W下任一方法进行处理：
[0036] (a)收集的细胞和淋己细胞分离液按1:4的比例混合，在离也机中W 2500g离也 30分钟，去掉残存红细胞W及成熟的粒细胞，收集液面间的细胞，细胞用1640培养液洗二 次；
[0037] 化）将提取的含有胎盘组织或胎盘血干细胞溶液和6%高分子轻己基淀粉按1:3 到1:6比例混合，150化pm, 4°C离也5到20min，弃去红细胞，保留上清液，然后用低分子右 旋糖酢（含盐）将其洗涂H次，把所收集的细胞制成单个核细胞混息液。
[0038] 按照本发明所述的方法提取的胎盘CD133+CD34-早期造血前体干细胞在制备帮助 和促进干细胞再生的药物中的应用。采用胎盘组织造血前体干细胞移植能够帮助、加速干 细胞移植的存活。
[0039] 按照本发明所述的方法提取的胎盘早期CD133+CD34-造血前体干细胞在制备治疗 脑积水、也脑血管疾病、肝坏死、肝硬化、糖尿病、关节炎、肺纤维化（尘肺）自体免疫性病、 脊髓损伤性疾病、红斑狼疮、硬皮病、肾炎、性细胞功能障碍性疾病、先天性或后天性疾病的 药物中的应用。
[0040] 所述的也脑血管疾病优选脑溢血，脑血栓、也肌梗塞、冠也病中的任意一种；所述 的糖尿病优选重型糖尿病，或膜岛素依赖性糖尿病；所述的关节炎优选关节退化的骨关节 炎；所述的性细胞功能障碍性疾病优选性冷淡或阳瘦；所述的先天性或后天性疾病优选肌 肉服大症、脑萎缩或老年性痴呆症中的任意一种。
[0041] 在造血干细胞移植中，组织配型相符的前体造血干细胞可W和厮带血、胎盘间充 质干细胞、骨髓血、或动员周围血干细胞同时输注给病人，加速造血干细胞的植活。
[0042] 当应用于临床时，可W采用新鲜胎盘前体造血前体干细胞，也可采用冷冻保存，再 融化，再培养的前体造血前体干细胞。
[0043] 采用胎盘早期造血前体干细胞用于临床时，可W不用或仅需要做HLA低分辨配 型，不会有排斥反应，可W在病人体内长期存活，有长期植活的功效。
[0044] 胎盘早期造血前体干细胞可W在体外培养后应用于病人。每次应用为IXIOVkg 至5X10 Vkg体重。
[0045] 所采用的胎盘早期造血前体干细胞可W制备成针剂，袋装静脉输液袋，也可制备 成瓶装输液瓶。在病人临床应用时，由我公司直接制备成各种针、水剂，直接供病人应用，也 可W冰冻袋在-8(TC的条件下，输送到病人所在医院应用。如果是W冰冻袋或保存袋的形式 到医院直接供病人应用，需按照我公司的说明书，即用4C的生理盐水，等渗葡萄糖液，DMEM 培养液或含高渗葡萄糖的PBS (磯酸盐缓冲液）进行稀释，离也后才能应用。
[004引发明详述
[0047] 收集胎盘：把胎盘放于无菌盒子内运输到无菌间，向厮带静脉内注入含有25?50 毫升抗凝剂和抗生素的溶液，该抗凝剂可W是肝素，或构稼酸轴，抗生素是1 %的青霉素，链 霉素，庆大霉素，也可加制霉菌素，溶液可W是0. 9%的生理盐水等渗磯酸缓冲液或DMEM细 胞培养液，然后用夹子夹住厮带，竖起厮带一分钟（用手顺着厮带往胎盘处向下持，让溶液 进入胎盘。把整个胎盘无菌的放到无菌容器和采集箱。
[0048] 收集胎盘血；在无菌环境下，向厮带静脉内注入含抗生素，如1%的青霉素，链霉 素，庆大霉素，也可加制霉菌素，溶液可W是0.9%的生理盐水等渗磯酸缓冲液或DMEM细胞 培养液，然联接厮带动脉，中间联接生物粟，形成循环，时间在1到24小时，收集来自于胎盘 内的血，命名为胎盘血，胎盘血内的细胞为单个核细胞。
[0049] 清洗胎盘组织：当胎盘进入无菌环境后，采用有机溶剂及生理缓冲液清除胎盘组 织和厮带外表的透明质粘液和母血。采用1号消毒剂（酒精、氯化轴、磯酸氨二轴、磯酸二氨 轴和楓），该消毒剂内，酒精浓度为50 %?75 % W及含有0. 1?0. 5 %的楓和0. 1到0. 25M 的磯酸缓冲液，抑为7. 2到7. 6之间，用于清洗胎盘及厮带表面，杀灭任何可能存在胎盘 膜和厮带表面上的微生物污染，清除胎盘组织和厮带外表的透明质粘液。采用2号有机溶 剂（在1号消毒剂的基础上减去楓，该消毒剂内，酒精浓度为50%?75%，含0. 1?0. 25M 磯酸缓冲液，抑为7. 2到7. 6之间）用于清洗胎盘及厮带表面。3号消毒剂清洁液（酒精 和0. 9%氯化轴，其中，酒精浓度为50%?75%，氯化轴浓度为0. 9%，抑为7. 2到7. 6之 间）用于清洗胎盘及厮带表面，也可W用磯酸缓冲液（pH7. 4)或低分子右旋糖酢或细胞培 养液（DMEM)清洗。采用机械挤压及酶和生理缓冲液冲洗的方法，冲洗掉任何残留的血液。 该缓冲液可W含有抗菌素，像青霉素（lOOU/ml)，链霉素（lOOg/ml)也可含有2500到10， 000单位的无防腐剂的肝素；该生理缓冲液的成分可W是生理盐水，低分子右旋糖甘，磯酸 缓冲液（phosphate-buffered saline)或细胞培养液，像 1640，DMEM值U化ecco's modified Eagle' S medium)，其所含单个核的细胞称为单个核细胞，细胞总量在0. 3到10. 5X109间。
[0050] 收集胎盘组织单个核细胞细胞；采用输液器（可W用注射器或输液粟）从厮带静 脉或厮带动脉注入0. 25%膜酶（Tirpsion)，或0. 1-1 %胶原酶II (Collegenase)，或0. 5% Dispense II 酶，也可加入 0.05 到 0.2% 的巧thylene diamine tetra acetic acid) (邸TA)，在37°C温箱内赔育含有组织细胞分离酶的胎盘30分钟到90分钟，然后在厮带静脉 或厮带动脉内灌注生理缓冲液冲洗，该生理缓冲液的成分可W是生理盐水，低分子右旋糖 甘，磯酸缓冲液（phosphate-buffered saline)或细胞培养液，像1640, DMEM值U化ecco' S modifie祀agle'S medium),每冲洗一次，然后挤压一次，收取含有W胎盘单个核细胞为主的 血液和组织液的混合液，冲洗，挤压3到5次，时间在30到90分钟之间，该样收取的缓冲液 的混合物为含有胎盘单个核细胞，其体积在100到800毫升之间。该缓冲液可W含有抗菌 素，像青霉素（lOOU/ml)，链霉素（lOOg/ml)也可含有2500到10,000单位的无防腐剂的肝 素。该种用酶消化，揽拌，挤压，洗涂等方法收集的细胞称为胎盘组织单个核细胞。
[0051] 收集胎盘组织（膜）单个核细胞；从胎盘组织分离羊膜和绒毛膜组织，用生理盐 水洗涂后剪碎，采用0. 25%的膜酶（Tirpsion)或0. 1-1 %的胶原酶II (Collegenase)，或 0.5% Dispense II 酶，或加入 0.05 到 0.2%的巧th}dene diamine tetra acetic acid) (邸TA)，在37度温箱内赔育或揽拌30到60分钟，收集、过虑、离也获得的细胞为胎盘组织 单个核细胞。（从膜或胎盘组织内一起获得的细胞统称为胎盘组织单个核细胞）图1可W 清楚的看到染色单个核细胞。
[0052] 收集到的胎盘单个核细胞均通过下述处理方法：
[0053] 1)收集的胎盘血或组织干细胞均通过各层尼龙或钢丝滤网，最小的为50um，最大 的为100mm，收集单个核细胞。
[0054] 2)将来自于胎盘的细胞收集到50毫升的离也管内，在离也机中W l，500g离也10 分钟，去掉70%的液体。然后可有W下二种方法。
[0055] 2. 1)收集的细胞和淋己细胞分离液按1:4的比例混合。在离也机中W 2500g离 也30分钟，去掉残存红细胞W及成熟的粒细胞，收集液面间的细胞，细胞用1640培养液洗 二次。
[0056] 2. 2)另一种方法是将提取的含有胎盘组织原始间充质和造血干/祖细胞溶液和 6%高分子轻己基淀粉Ofespan,大于60,000道尔顿）按1:3到1:6比例混合，150化pm巧00 到1，OOOg), 4度离也5到20分钟，弃去红细胞，保留上清液，然后用低分子右旋糖酢（含 盐）将其洗涂H次，把所收集的细胞为浓缩单个核细胞，将其制成单个核细胞混息液，并做 单个核细胞计数，测定细胞活性，计算CD34、CD4、CD8细胞含量及做体外培养的白细胞集落 (CFU-GM)，红，白细胞集落（CFU-GEMM)和间充质集落（CFU-F)。图2为浓缩后的胎盘细胞， 染色的细胞为单个核细胞。
[0057] 将做完各种检测，包括，病毒，细菌培养和组织配型的厮带血（是采用厮带血做 检测而不是用于提取），胎盘血和胎盘组织干细胞按照上述方法分别制成单个核细胞，W IXlO 7到IXlO8Ail的浓度和DMSO (二甲亚讽）混合，且W 10 %的终浓度DMSO和低分子右旋 糖酢降温到零下8(TC，然后转移到液氮（-186C)液相中深低温分别保存保存，W备移植时 应用。
[005引提取胎盘造血前体干细胞；VlM'消枝术已经成为细胞磁性可W分选CD34阳性和 CD133阳性的细胞金标准，有其强大的优势和广泛的用途；从小量分选到大规模分选，从高 频细胞到稀有亚群的细胞分选，可W高效的、可重复的及高质量的细胞分离结果来自于胎 盘内的干细胞群，可W实现细胞的全自动分选，而不需要专口的人员或技巧。细胞分选试剂 可W从各种物种和样品中获得几乎所有类型的细胞，选柱用于快速分选被MACS磁珠标记 的细胞，细胞即可被分选柱放大的磁场捕获。温和的分选环境，在保证细胞的回收率和纯度 的同时，更保护了细胞表面抗原表位，因此，分选得到的细胞表位完好，细胞功能不受影响， 用于从抗凝处理的全血中快速进行细胞的阴性分选，最多一次处理30血全血，无需密度梯 度离也等步骤，可W加速红细胞的沉降，W便去除非目的细胞，即可方便地从上清液中获得 目的细胞。先采用含抗CD133的磁珠抗体从胎盘干细胞中浓缩纯化含CD133的细胞，再用 抗CD34磁珠抗体从含CD133的细胞群内分离出CD133+CD34-的干细胞群，也称为早期造血 前体干细胞，像图2所示，采用磁珠纯化后的细胞染色，着色细胞大，细胞核几乎占据整个 细胞，细胞质疏松。
[0059] 胎盘早期造血前体干细胞的培养；取塑料IOOcm2或75cm2的培养皿或培养瓶，在培 养皿内放到l-5ml的培养液，培养液可用DMEM或2-Mebicm，或1640培养液，其中含有10% 的血清，该血清可W是胎盘血清（FB巧，也可W是无血清培养液，含有细胞刺激因子，像纤维 细胞生长因子，白细胞生长因子等，培养时间为每3天换液一次，此时，细胞经过用培养液 清洗后，可W再次培养和再次保存，胎盘早期造血前体干细胞仍然保持原有的特性。
[0060] 对胎盘早期造血前体干细胞的检测；胎盘自进入实验室或公司后，首先要做各种 病毒的推测，像己型肝炎表面抗体，丙型肝炎病毒抗体，艾滋病毒抗体，巨瞻细胞病毒抗体 W及梅毒抗体，只有在各种检测为阴性时，才能进行下一步的胎盘冲洗和清除残留红细胞 程序。在获得胎盘造血前体干细胞后，首先要进行胎盘霉菌培养，只有在各种培养阴性后， 提取的胎盘早期造血前体干细胞需进行组织配型（HLA)的分子生物学低、高分辨检测，HLA 一类抗原（A，B)和HLA二类抗原值时，所有资料将由电脑软件和条形码控制和管理。所有 培养后的胎盘造血前体干细胞需要流式细胞仪检测。图3,为采用磁珠分离后的胎盘造血 前体细胞流式检测。该图为磁珠抗CD133抗体纯化后的细胞，可见有CD133和CD34双阳性 的细胞，图4为再次采用抗CD34磁珠抗体纯化去除CD34阳性细胞，为CD133阳性的细胞群。 图5为白细胞集落检测（CFU-GM)和图6为红一白细胞集落检测（CFU-GEMM)，每一堆细胞都 是来自于一个早期造血前体干细胞。
[0061] 胎盘造血前体干细胞的临床适应症：纵上所述，胎盘造血前体干细胞的治疗机理， 一是利用该干细胞的多能分化型，他可W在特定的环境下，分化成人体组织的各种细胞，像 神经，皮肤，骨骼，软骨，肌肉，肝脏，也脏，脂肪和膜岛细胞，二是利用该细胞能分化各种细 胞趋化因子和细胞刺激因子来帮助受损细胞核组织修复和帮助受损细胞再生，据此该干细 胞在临床上可用于下列疾病的治疗：
[0062] 脑血管病；脑出血、脑血塞、老年痴呆等
[0063] 也血管病：也肌梗塞、也绞痛、也肌病
[0064] 内分化性疾病；糖尿病
[0065] 消化性疾病；肝硬化
[0066] 呼吸系统疾病：肺硬化肺巧
[0067] 自体免疫性疾病；红细胞疾病肺纤维化，红斑狼疮，硬皮病，肾小球肾炎
[0068] 免疫排斥性疾病：移植物抗宿主病
[0069] 造血前体干细胞临床使用方法；经过培养收集后的胎盘造血前体干细胞在临床使 用前，需要再次进行下列检测：
[0070] ①流式细胞仪分析；其早期造血前体干细胞中为CD133+和CD34-阴性细胞需占整 个细胞群体的70% W上。
[0071] ②培养胎盘造血前体干细胞的上清液需再次做细菌培养，必须确认无任何微生物 生长和外来动物蛋白。
[0072] ③复查HLA配型，需用的胎盘造血前体干细胞其HLA低分辨中的I类和II类抗原 必须有4个W上任意和使用者的HLA配型相符。
[0073] ④检测胎盘造血前体干细胞的活性，要求在需使用时，其活性要大于90% W上。
[0074] ⑥检测胎盘造血前体干细胞的数量，要求再次给予病人的造血前体干细胞数要大 于1.0X 1〇5/公斤体重。
[00巧]输注胎盘造血前体干细胞的输液袋，要求是无菌，无毒，符合国家卫生部要求，输 液袋要有明显的标签，XX胎盘造血前体干细胞的含量，活性和HLA配型W及生产厂家和生 产日期，失效日期等。
[0076] 该专利提供了一种采用胎盘造血前体干细胞用于免疫调节的方法，描述了如何生 产和培养、筛选有活性的胎盘造血前体干细胞。来自于胎盘的造血前体干细胞，在体外通过 培养和扩增，至少具有下列细胞表面标志；CD133+，W及不具有CD34, CD45。含有胎盘早期 造血前体干细胞的塑料输液袋，该输液袋为密封和无菌，中间有管道用于静脉输液。本专利 提供了一种从胎盘中提取，鉴定，培养，低温保存和培养，扩增，保存的胎盘早期造血前体干 细胞。
[0077] 胎盘造血前体干细胞具有强烈的细胞分化和分泌体内各种刺激因子的功能，可用 于治疗各种慢性炎症性疼痛，也血管疾病和肝硬化，糖尿病及自身免疫疾病。
[0078] 按照我们的方法，提取的胎盘早期造血前体干细胞都是活性大于90% W上。能 分泌巧tokines (化-1，alpla,比-1，beta, IFN-gamma, TFN,蛋白小分子激素（Hormones, an化Ogen,雌激素，膜岛素，prolectin素，胶原蛋白等。至少1. 7X lOVkg，最好是2. 5X IO6/ kg造血前体干细胞可用于抗炎症（anti-inflammation)的效果，可用于任何炎症疾病，而 且该种炎症可W表现在任何组织，任何器官，像肌肉，神经，脑，脊髓，周围神经，血管组织， 也脏，膜岛，肠，消化道，肝脏，肺，肾，生殖系统，内皮和内分泌系统，也可W用来治疗自身 免疫疾病，尤其是伴有炎症时，像糖尿病，amylotrophic lateral sclerosis, myasthenia fravis diabeticmeutropaathy, inpus,Alzheimer' s,Pakinson' s.sickle cell anemia, pompe' S diseases, pheny化etonuria(PKU)胎盘早期造血前体干细胞非常适合外伤W 后，细胞和组织的恢复，该些外伤包括但不限于中枢神经系统疾病损伤，像脑出血，脑血 栓，脊髓或周围神经损伤，也肌损伤，像也肌梗塞，也肌缺血，肌肉或骨骼损伤（像肌肉或 初带损伤），骨折，消化系统损伤，像肝硬化，肝炎，结肠炎，生殖系统损伤，像不育症，泌尿 系统损伤，像肾小球肾炎，内分泌系统损伤，像膜岛素依赖型糖尿病，W及一切由于物理 原因的皮肤或黏膜损伤，像烧伤，核放射，冻伤等。该种早期造血前体干细胞也非常适合 于老年性细胞退行性变而引发的疾病，像老年性关节炎，阿莫而氏病ACS，帕金森综合症 (Parkinson' S)。
[0079] 本专利提出HLA相符的胎盘早期造血前体干细胞治疗能够大大增强维持干细胞 的疗效，因而采用自体胎盘早期造血前体干细胞保存，不但能维持自体保存人的应用，而且 可造福于整个家族，对于异体早期造血前体干细胞的应用，也是要建立一个鹿大的异体早 期造血前体干细胞库，并对自体保存每一例的早期造血前体干细胞HLA配型，在临床使用 时，HLA有分子生物学低分辨4个W上位点相符（HLA:A，B，DR)胎盘早期造血前体干细胞在 使用前的保存温度，如果是在冰冻时保存，应该W干冰形式运输，也可W在小型液氮罐中， 如果是已经在培养液中存活的细胞，则应保存在4-l(TC。根据细胞状态，保存时间不一；在 液氮管中可W长期保存，在干冰中可W保存18-21天，而在培养液内为24-48小时。
[0080] 胎盘早期造血前体干细胞的使用剂量；应用胎盘造血前体干细胞作为细胞治疗， 必须要给病人高剂量的细胞才能发挥疗效，小剂量的注射只能对病人有害，使病人发生免 疫反应，产生过度应激状态，我们采用2倍W上的造血干细胞移植的剂量，如在造血干细 胞移植时应用1 X IO9单个核细胞，如若是来自于骨髓血，则相当于0. 1-0. 6X IO7造血干 细胞，而我们采用的胎盘造血前体干细胞的含量为1-10 X IO5/每体重公斤胎盘造血前体 干细胞的使用量，该些干细胞可W-次性注入，也可W间隔数天分多次注入。注射的部位 多通过周围静脉输注，但根据病情，也可W局部应用，像周围静脉注射，脊髓腔注射，脑部 注射，关节腔内注射或也冠状动脉注射，也可在体内任何组织或器官损伤部位注射含胎盘 造血前体干细胞的输液袋。培养，扩增后的胎盘早期造血前体干细胞保存在无菌输液袋 中，该袋子的长为18,宽为15,高为10,为一透明无毒无菌国家卫生部口许可应用与人类 静脉输注的输液袋该袋子的外部标有出厂单位，时间，袋内胎盘造血前体干细胞的数量，活 性，名称，保存温度，保存时间W及血型和HLA配型。胎盘造血前体干细胞的输液袋需装 在一个不怕损坏的铅盒中，W保证该输液袋在运输过程中不会被损坏，该种铅盒，长19,宽 19,高12,打开铅盒后可W放入输液袋，然后盖上铅盒，盒的上方有一开口，可W观察输液 袋内的情况。在该输液袋内除含有胎盘造血前体干细胞W外，还可含有细胞刺激因子，像 GM-CSF，红细胞刺激因子巧PO),干细胞刺激因子（FIT)等，也可含有各种白介素刺激因子， 像比-2,比-4,比-6, CD401，IFN-alpha，TNF-alpha，IFN-beta-3,也可 W含有各种细胞组织 的干细胞刺激因子，像肝细胞刺激因子化巧atowte growth化Ctor),也肌细胞刺激因子 (cardiotropin-l)，血管紧张刺激因子 I，II ,III (angiotensin)，IFN-famma,内皮细胞刺激 因子，巧piciermalf;row1:h factor),纤维细胞刺激因子化asic fibroblast growth factor), 也可W含有抗菌素，像10-100单位/ml的青霉素和10-100微克的链霉素。
[0081] 冻融和造血前体干细胞移植治疗；当临床确认需应用某例胎盘干细胞时，在病人 床前从液氮内取出干细胞，于37C电动水浴箱内融化，在血细胞几乎即将冻融完毕时，加入 低分子右旋糖酢等量混合，按顺序给病人输注。
[0082] 根据病人的病情需要，可W分别冻融多种来源的干细胞，也可一次性的冻融多种 细胞联合给病人应用。对体重小于10公斤的病人可W只用一袋厮带血，对体重大于10公 斤小于30公斤的病人可W用厮带血和胎盘血干细胞，对体重大于30公斤W上的病人厮带 血、胎盘血造血干细胞W及胎盘组织造血前体干细胞。
[0083] 本发明制备的胎盘组织早期造血前体干细胞一般W静脉输入为主，但也可W局 部直接进入到骨髓组织内，也可通过任何其它的途径，像动脉注入等方法输注给病人。本 发明主要应用的药学成分或含有生理盐水、低分子右旋糖酢、厮带血浆、DMEM值U化ecco' S Modified Essential Medium)培养液、注射用水等。W上所用溶液均是无菌、无热原制备W 及可用临床移植的病人。
[0084] 有益效果：
[0085] 干细胞是具有自我复制和向各种细胞分化潜能的原始细胞，是形成生命机体各组 织器官的起源细胞。人类个体的发育过程实际实质就是干细胞的自我更新和增殖分化的过 程，而各个器官的细胞也是分别来源于各个器官的干细胞，像肝脏，神经，脑组织，膜腺，皮 肤等。按干细胞的种类有：
[008引 1.胚胎干细胞
[0087] 胚胎干细胞是最原始，可分化程度最高的细胞，也是受精卵结合后形成胚胎的初 始阶段，它可W分化成各种细胞，甚至可W采取核移植的方法，利用自体体细胞分化成各种 细胞。临床应用时必须破坏胚胎，让其分化成其它细胞，由于细胞的高度分化性，易形成肿 瘤细胞，因而不可能用该类细胞提取任何造血干细胞。
[0088] 2转基因多能干细胞
[0089] 转基因多能干细胞，也称为induced pluripotent stem cell (iP巧是由日本科学 家（获得诺贝尔奖）首先发现的自体成体细胞在基因转染后具有胚胎干细胞的功能，但最 大疑问就是转染细胞也可W同时具有肿瘤细胞的可能性，要全面应用于临床，还需要大量 的科研和时间，因而不可能用该类细胞提取任何造血干细胞，它的主要用途还是用于组织 修复。
[0090] 3成体干细胞：
[0091] 成体干细胞是人出生W后，各器官还自行保留能再生的细胞。该种干细胞是越年 轻的机体，含量越丰富，可分化程度越高。1998年，在美国Wisconsin大学首先发现在成人 骨髓中也具有能分化成各种组织细胞的干细胞，随后人们认识到人体内各种组织细胞都存 在着该种细胞，称为成人干细胞（ASC细胞），它具有和胚胎干细胞同样的功能。成体干细胞 可分为：
[0092] 3. 1成人骨髓干细胞：主要是含有能分化成人体血液细胞的干细胞，像白细胞，红 细胞，血小板等。有人采用骨髓研究，MACS分选后CD133+细胞功能性研究表明，CD133+细 胞具有长期培养起始细胞（Long-term州hure-initiating cells,LTC-IC)和长期重建造 血细胞（Long term r巧opulation cells, LTRC)的能力，为最原始的造血细胞，移植给宿主 后可W长期植活。此外，最近研究发现LTC-IC主要见于AC133+CD34+亚群，一小群CD1337 CD34-细胞也具有长期增殖潜能。显然，由于来源的困难，采用骨髓只能用于科研，不能用于 大规模提取。
[0093] 3. 2周围血干细胞；正常人周围血内不含有或有很少量的干细胞，但是在应用了 一种称为白细胞刺激因子的药物后，骨髓血中的干细胞可W释放到周围血中，所W也称为 周围动员血干细胞，该类细胞W CD34+细胞为主，只含有少量的CD133+细胞，同骨髓一样，由 于来源的困难，采用周围血干细胞只能用于科研，不能用于大规模提取。
[0094] 3. 3厮带血干细胞。是新生儿出生后，厮带血中的干细胞，它含有丰富的造血干细 胞。由于来源方便，取材容易，所W对它的研究最为广泛，所做的厮带血CD34和CD133分选 研究发现同一份标本的CD34+细胞扩增潜能低于CD133+细胞。因此AC133分选可能优于 CD34分选。但正如在我们表1中指出的那样，厮带血中含有丰富的CD133+CD34+细胞，但几 乎不含有CD133+CD34 -细胞，而胎盘血正好相反，血中含有丰富的CD133+CD34-细胞，但仅含 有只占10%左右的CD133+CD34+细胞，因而，厮带血的工作仅是造血前体干细胞，而不是早 期造血前体干细胞。那么，为何没有人研究胎盘干细胞；该主要是：
[0095] 1)把厮带血干细胞的科技带到国内是由本发明人在1996年首先在国内开发的。
[0096] 2)发现胎盘血内含有丰富的造血干细胞的国内外第一篇论文也是本作者在2004 年首先发表。
[0097] 3)本作者在2005年申请了胎盘干细胞专利。
[0098] 4)更重要的是本作者掌握了如何无菌，保证细胞活性，是提取胎盘干细胞的关键， 而该正是本作者获得成功，在该个基础上，在此前，没有任何人想到和发现厮带血和胎盘血 在该方面有如此巨大的差异，我们发现了胎盘内含有厮带血中不含或很少量的早期造血前 体干细胞。
[0099] 表1 ;厮带血和胎盘血组份的比较
[0100]

【权利要求】
1. 一种从人体健康胎盘中大量提取早期造血前体干细胞的方法，其特征为：所述的早 期造血前体干细胞为一群⑶133+⑶的细胞群，来源于去除脐带血后残留在胎盘内的血 液或是从胎盘组织经过机械处理或酶消化获得的单个核细胞，在流式细胞仪的检测中为 ⑶133+CD34TD105TD29XD3r，几乎不存在于正常人周围血和脐带血中。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于包含以下步骤： (1) 从胎盘血或胎盘组织中分离单个核细胞； (2) 从单个核细胞中先分选出CD133+阳性细胞群，然后再从CD133+阳性细胞群中分选 出其中的⑶133+⑶34+细胞群，而流出的细胞群即为⑶133+CD34_的造血前体干细胞。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的从胎盘中分离的单个核细胞进行浓 缩后再进行分选。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤（2)通过从浓缩后的胎盘单个核细胞 中采用MACS磁珠分选出CD133+CD341 勺早期造血前体干细胞，或者从浓缩后的胎盘单个核 细胞中采用任何抗CD34或抗CD133的抗体和生物反应素结合，或者和第二抗体结合去分选 ⑶133+CD3C的早期造血前体干细胞。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于采用MACS磁珠分选的方法，用抗CD133磁 珠单克隆抗体从单个核细胞中先分选出CD133+阳性细胞群，然后再从CD133+阳性细胞群 中应用抗CD34磁珠单克隆抗体分选出其中的CD133+CD34+细胞群，而流出的细胞群即为 ⑶133+CD3C的早期造血前体干细胞。
6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的从胎盘血或胎盘组织中分离单个核 细胞的方法为： (1) 收集胎盘，向脐带静脉内注入含有25?50毫升抗凝剂和抗生素的生理等渗溶液或 缓冲液；采用脐带动、静脉灌洗法收集胎盘血；其中，所述的抗生素选自青霉素、链霉素或 制霉囷素； (2) 采用有机溶剂及生理缓冲液清除胎盘组织和脐带外表的透明质粘液，采用机械挤 压及酶和生理缓冲液冲洗的方法，冲洗掉任何残留的血液； (3) 离心收集胎盘组织干细胞：将胎盘组织、羊膜和绒毛膜组织用生理盐水洗涤后剪 碎，采用0. 25%的胰酶、0. 1-1 %的胶原酶II、0. 5% Dispense II酶，或加入0. 05到0. 2% 的EDTA，在37°C温箱内孵育或搅拌30到90min，收集、过滤、离心获得的细胞为胎盘组织干 细胞。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于步骤（3)所述的过滤、离心的具体方法为： 收集的胎盘血干细胞和胎盘组织干细胞均通过各层尼龙或钢丝滤网，最小的为50um， 最大的为100mm，收集单个核细胞； 将来自于胎盘或胎盘血的单个核细胞收集到50毫升的离心管内，在离心机中以 1，500g离心10分钟，去掉70 %的液体，然后按照以下二种方法之一进行处理： (a) 收集的细胞和淋巴细胞分离液按1:4的比例混合，在离心机中以2500g离心30分 钟，去掉残存红细胞以及成熟的粒细胞，收集液面间的细胞，细胞用1640培养液洗二次，得 到浓缩后的胎盘单个核细胞； (b) 将提取到的浓缩后的胎盘单个核细胞和6%高分子羟乙基淀粉按1:3到1:6比例 混合，1500rpm，4°C离心5到20min，弃去红细胞，保留上清液，然后用低分子右旋糖酐（含 盐）将其洗涤三次，把所收集的细胞制成单个核细胞混悬液。
8. 按照权利要求1?7中任一项所述的方法提取的早期造血前体干细胞在制备帮助和 促进干细胞再生的药物中的应用。
9. 按照权利要求1?8中任一项所述的方法提取的期造血前体干细胞在制备治疗脑积 水、心脑血管疾病、肝坏死、肝硬化、糖尿病、关节炎、肺纤维化（尘肺）自体免疫性病、脊髓 损伤性疾病、红斑狼疮、硬皮病、肾炎、性细胞功能障碍性疾病、先天性或后天性疾病的药物 中的应用。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的心脑血管疾病为脑溢血，脑血栓、 心肌梗塞、冠心病中的任意一种；所述的糖尿病为重型糖尿病，或胰岛素依赖性糖尿病；所 述的关节炎为关节退化的骨关节炎；所述的性细胞功能障碍性疾病为性冷淡或阳痿；所述 的先天性或后天性疾病选自肌肉肥大症、脑萎缩或老年性痴呆症中的任意一种。
【文档编号】A61P15/10GK104357396SQ201410610588
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月3日 优先权日:2014年11月3日
【发明者】周胜利, 郑超 申请人:赛欧帕克（江苏）干细胞生物工程有限公司