专利名称：：作为体内造血刺激剂的tat-hoxb4h重组蛋白质及其医疗组成物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种C-端含有组胺酸标记的H0XB4重组蛋白质，特别涉及一种C端含有六个组胺酸残基(residue)的重组蛋白质。
背景技术：
：在再生医学发展蓬勃的今日，各种关于寻找器官特异干细胞或可自我更生(self-renewing)细胞的研究不断。所述可自我更生细胞中最常被研究的是造血干细胞，因为从癌症、新陈代谢疾病到免疫不全，造血干细胞皆是较好的治疗选择。“造血”是指血液细胞生成的过程，可通过位于骨髓中的造血干细胞的分裂而取代红血球及白血球。造血干细胞(HSCs)是一群具有自我更新能力与分化为所有血球或免疫细胞能力的细胞。然而，控制造血干细胞自我更新与分化的基因机转多半仍属未知。目前，自成人骨髓、动员后周边血液以及脐带血移植的人类造血干细胞，已在临床上用于治疗血癌(白血病与淋巴瘤)，以及用于帮助免疫系统由非血癌的高剂量化疗复原。然而有效的移植需要大量的不同来源的造血干细胞，并且可能需要进行干细胞增生(expansion)。造血干细胞可来自骨髓、周边血液以及脐带血。取出骨髓细胞需要进行手术以及相当痛苦的步骤，因而成为较差的手段。使用周边血液细胞也有缺陷，因为很难由造血机能受损的罹病或化疗患者取得合适与足量的造血干细胞。脐带血相对容易取得并且造血干细胞的质量也较好，然而此法所能取得的造血干细胞数量仍有限。每次取得的细胞数量足够用于小孩，但要用于成人就可能不足。为解决上述问题，就必须干扰干细胞自我更生过程来加速造血干细胞体外增生。新近的证据指出转录调控因子在调控干细胞的基因表现、与干细胞的发育过程扮演重要角色(Orkin、S.H.Nat.Rev.Genet1,57-64,2000)转录调控因子可通过与目标基因的结合与否或是本身浓度来构成复杂的细胞生理调控机制。一群称为DNAbindinghomebox(HOX)的转录因子被发现在胚胎发育扮演重要角色，并且在近年来发现HOX转录因子家族在造血干细胞发育也扮演了重要角色(Buske、C.et.al.J.Hematol.71,301-308、2000)ο蒙特娄大学(UniversityofMontreal)的盖·萨瓦格(GuySauvageau)博士曾经探讨骨髓中造血干细胞的HOX转录因子调控造血干细胞更新的现象，它的研究显示同位序列基因(homeoboxgene)H0XB4对于造血干细胞自我更新的调控十分重要,可维持造血干细胞在骨髓中的群集大小。最早证明HOX基因会在血球细胞表现，是利用人类及老鼠的细胞株(cellline)而证实的。有些HOX基因在不同的细胞形态有明显广泛的表现，有些HOX基因则只活化表现于特定细胞中。例如人类的HOXB串群中的八个成员会在红血球细胞发育之初表现，有些HOXB基因包括H0XB4及H0XB7也会在T细胞及B细胞表现。Sauvageau等人证实有九个HOXA基因、八个HOXB基因及四个HOXC基因会在CD34+骨髓细胞内表现，其中又以H0XB2、H0XB9及H0XA10在CD34+的细胞族群内的红血球原始细胞表现最多。另夕卜，实验结果也检测出在⑶34_的细胞群中，没有HOX基因表现。因此，“H0XB4”蛋白已最常被用于做为活体外造血干细胞(HSC)增生之有效刺激剂。近来已证实人类，“H0XB4”基因可以病毒或重组蛋白质形式来有效增生造血干细胞。TAT-H0XB4H重组蛋白质，在实验室等级，已被用于增生干细胞而不会有反转录病毒插入之风险或与骨髓基质细胞共培养之风险(参见Krosl、J.etal.、NatureMedicine9,1428-1432,2003)因此，“H0XB4”蛋白已常用于做为促进活体外造血干细胞增生的刺激剂。最近已有证据指出在H0XB4的N端加上一TAT蛋白质序列后，外源的H0XB4即可被运送至细胞内。此TAT序列系可导引H0XB4由细胞外至细胞内的运输。一旦进入细胞质，H0XB4可藉由护卫蛋白(Chaperon)HSP90而重新折迭成其原始的构形。TAT-H0XB4能够促进造血干细胞增生达2-6倍(AmselIem>S.等人，NatureMedicine9、1423-1427,2003;及Krosl.J.等人，NatureMedicine9、1428-1432，2003)。然而，该TAT-H0XB4重组蛋白质自大肠杆菌宿主的纯化回收产率偏低，且多为不可溶形式。为了增加该TAT-H0XB4重组蛋白质的产率，已发展出C-端另具有一段6个组胺酸残基(His-6)标记的TAT-H0XB4H重组蛋白质制造方法，其产率较原始蛋白质的纯化效率高出3-5倍。此制造方法已详细描述于PCT/CN2006/000646。上述TAT-H0XB4H重组蛋白质可用于人类周边血液或脐带血干细胞增生，并且所增生的干细胞仍保有其多能性(pluripotency)。此外,将上述TAT-H0XB4H重组蛋白质处理过的干细胞加入在非肥胖型糖尿病合并重度联合免疫缺陷小鼠(N0D/SCID)的骨髓内之后,可以在其周边白血球中发现人类白血球，由此可知小鼠免疫与造血机能已成功重建。然而，TAT-H0XB4H重组蛋白质从未被用于做为体内造血的刺激剂，特别是，从未被用于增进造血机能重建、扩增、骨髓重生(re-population)以及增加周边循环干细胞的数目，特别是在化疗或放射线治疗之后。Krosl等人(2003)以及Amsellem等人(2003)无法获得扩增造血干细胞临床研究所需的大量高纯度且高度安定的H0XB4蛋白质。使用现有技术由一公升培养液纯化而得的TAT-H0XB4H重组蛋白质总量约为1_2毫克，产率较低。使用现有技术方法表现TAT-H0XB4H蛋白质的pTAT-HA_H0XB4质体，是加拿大蒙特娄大学(UniversityofMontreal)的盖·萨瓦格(GuySauvageau)博士所赠，Krosl等人(2003)曾报告说，在血清培养4小时后，其纯化的TAT-H0XB4H蛋白质会丧失大部分。
发明内容本发明基于后述研究结果当TAT-H0XB4H重组蛋白质给予一有需要的使用者之后，其可增加骨髓内以及周边血液内的造血干细胞的数目。本发明一方面提供了一种TAT-H0XB4H蛋白质制造方法。该方法包含(a)提供一宿主细胞，其包含一具有上述蛋白质编码的载体；(b)在该宿主细胞内表现该蛋白质；(C)收取该表现蛋白质的一不纯溶液；(d)以下列步骤由该溶液纯化该蛋白质(i)将该溶液通入一HisTrap管柱；(ii)冲洗该HisTrap管柱；(iii)将该部分纯化的蛋白质由该HisTrap管柱溶离出，而形成一部分纯化的蛋白质溶液；(iv)将该部分纯化的蛋白质溶液通入一MonoSP管柱；(V)冲洗该MonoSP管柱；(vi)将纯化的蛋白质，呈变性形式，由该MonoSP管柱溶离出；(e)利用疏水性化合物将溶离出的变性蛋白质以下列步骤再折迭(i)将该溶离出的变性蛋白质与一疏水性化合物溶液混合形成一蛋白质与疏水性化合物溶液；()将该蛋白质与疏水性化合物溶液去盐而得一蛋白质与疏水性化合物去盐溶液；(iii)利用超过滤制程将该疏水性化合物由该蛋白质与疏水性化合物去盐溶液中移除。本发明另一方面提供了一种促进造血干细胞由骨髓动员至周边血液的方法。该方法包含a)给予一有需要的使用者一有效量的以上述方法制造的TAT-H0XB4H重组蛋白质；b)允许该TAT-H0XB4H重组蛋白质增加该使用者骨髓内造血干细胞的绝对数目，由此促进造血干细胞动员至该使用者的周边血液。本发明再一方面向提供了一种用以改善造血干细胞移植患者、放射线治疗患者或化疗患者的恢复时间的方法。该方法包含a)给予一有需要的使用者一有效量的以上述方法制造的TAT-H0XB4H重组蛋白质；b)允许该TAT-H0XB4H重组蛋白质增加该使用者骨髓内造血干细胞的绝对数目。本发明再一方面提供了一种用以促进造血干细胞由一有需要的使用者的骨髓动员至周边血液的医疗组成物。本发明的医疗组成物包含一有效量的以上述方法制造的TAT-H0XB4H重组蛋白质，其足以增加该使用者骨髓内造血干细胞的绝对数目，由此促进造血干细胞动员至该使用者的周边血液。本发明所述医疗组成物可给予进行自体造血干细胞移植的患者，用以改善其造血干细胞移植后的恢复时间。本发明所述医疗组成物，可作为颗粒球细胞生长因子(G-CSF)的替代物，给予G-CSF不敏感患者，用以动员造血干细胞至周边血液。本发明所述医疗组成物可给予造血干细胞捐赠者，由此可以由捐赠者之外围血液以较不具侵略性的方式取得足量的造血干细胞以供移植，而不须由其骨髓取得。本发明再一方面提供了治疗先天性造血干细胞缺乏而造成的疾病，其通过全身性给药方式，给予上述疾病患者一有效量的以上述方法制造的TAT-H0XB4H重组蛋白质或其医疗组成物。所给予的TAT-H0XB4H重组蛋白质会增加该使用者骨髓内造血干细胞的绝对数目。本发明再一方面提供了一种用以改善造血干细胞移植患者的恢复时间的方法，其通过全身性给药方式，给予一有需要的使用者一有效量的以上述方法制造的TAT-H0XB4H重组蛋白质或其医疗组成物。本发明再一方面提供了一种用以改善放射线治疗患者或化疗患者的造血干细胞回复的方法，其通过全身性给药方式，给予一有需要的使用者一有效量的以上述方法制造的TAT-H0XB4H重组蛋白质或其医疗组成物。图I为本发明中造血干细胞(HSC)从体内扩增动员至外围血液(PB)的示意图2为本发明中PTAT-H0XB4H的选殖与构筑在修改过的pET21b质体内的示意图；图3为本发明中pTAT-H0XB4H的DNA序列图；(ρΤΑΤ_Η0ΧΒ4ΗΝ_端及C-端额外的六个组胺酸残基加底线标示，并且标上TAT)图4为本发明中ρΤΑΤ-Η0ΧΒ4Η的蛋白质序列图；图5为本发明中以10%SDS-poIyacryIamide凝胶(I.5mm)证明TAT-H0XB4H蛋白质的纯化，其以coomassieblue染色分析图示pTAT_H0XB4H的蛋白质序列；其中M:分子量标记(M),O.3μg;laneI:来自未诱导BL21(DE3)pLysSTAT-H0XB4H蛋白质表现细胞的细胞溶解产物，Iμg蛋白质；Iane2:来自诱导后BL21(DE3)pLysSTAT-H0XB4H蛋白质表现细胞的细胞溶解产物，Iμg蛋白质；Iane3:纯化的TAT-H0XB4H，O.7μg蛋白质；Iane4:纯化的TAT-H0XB4(O.2μg蛋白质)；用以表现TAT-H0XB4蛋白质(lane5)的pTAT-HA_H0XB4质体,是加拿大蒙特娄大学(UniversityofMontreal)的盖·萨瓦格(GuySauvageau)博士所赠。lane3及lane4是加入相同体积的由MonoSP管柱收集的流份(fraction)。图6为本发明中以SDS-polyacrylamide凝胶分析纯化后TAT-H0XB4H蛋白质的安定性图；(其储存在PBS，40C，O小时(A)与16小时(B)，其中M代表分子量标记，O代表在40CO小时，16代表在4°C16小时)图7为本发明中以SDS-polyacrylamide凝胶以及coomassie染色分析TAT-H0XB4H蛋白质储存在_4°C以及_20°C，PBS以及MDM缓冲液的安定性图；(箭头指示TAT-H0XB4H蛋白质band)图8A为本发明中以流式细胞仪分析G-CSF对于小鼠骨髓中⑶34+干细胞数目的刺激效果图；图8B为本发明中以流式细胞仪分析PBS对于小鼠骨髓中CD34+干细胞数目的刺激效果图；图8C为本发明中以流式细胞仪分析TAT-H0XB4H蛋白质对于小鼠骨髓中⑶34+干细胞数目的刺激效果图；图9A为本发明中以流式细胞仪分析G-CSF对于恒河猴骨髓中⑶34+干细胞数目的刺激效果图；。图9B为本发明中以流式细胞仪分析TAT-H0XB4H蛋白质加上G-CSF对于恒河猴骨髓中CD34+干细胞数目的刺激效果图；图9C为本发明中以流式细胞仪分析TAT-H0XB4H蛋白质对于恒河猴骨髓中⑶34+干细胞数目的刺激效果图；图9D为本发明中以流式细胞仪分析PBS对于恒河猴骨髓中CD34+干细胞数目的刺激效果图；图10为本发明中TAT-H0XB4H蛋白质对于NOD-SCID小鼠的造血回复影响图；图11为本发明中TAT-H0XB4H蛋白质对于接受Cisplatin化疗后Balb/c小鼠的造血回复影响图。具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明的实施例作进一步的详细说明。I·TAT-H0XB4H蛋白质本发明由一公升培养液纯化而得的TAT-H0XB4H重组蛋白质总量约为6_10毫克，而本发明的TAT-H0XB4H蛋白质纯化方法具有体内给予蛋白质所需提升的产率。本发明的TAT-H0XB4H蛋白质，即使在血清培养4星期后，仍显出明显较佳的安定性，此处将TAT-H0XB4H蛋白质用于临床研究的关键。本发明所提供的TAT-H0XB4H蛋白质的制造方法，具有能够提高产率以及安定性的优点，使得上述蛋白质可用于体内给药。此TAT-H0XB4H蛋白质为包含三个基因片段(element)(TAT、H0XB4以及组胺酸标记)的构体(construct)。H0XB4是转录调控因子HOX家族的一员，其可促进造血干细胞增生。TAT使得H0XB4部分得以被输送至细胞核内。组胺酸标记可使重组表现源的初始纯化产率增加，本发明的制造方法可进一步增加蛋白质产率。pTAT-H0XB4H的构筑如图2所示，DNA序列系如图3所示。TAT-H0XB4H重组蛋白质系指C端含有六个组胺酸残基(residue)标记(参见图4)的TAT-H0XB4融合蛋白质。除非另外指明，蛋白质的氨基酸序列(或称“初级结构”或“初级序列”)是由氨基端至羧基端。在非生物系统(例如使用固态合成者)，蛋白质(包含双硫(半胱氨酸)键位置)的初级结构可由使用者自订。“删除(deletion)”是指氨基酸(或核苷酸)序列由于缺失一个或一个以上的氨基酸残基(或核苷酸)所造成的改变。“插入(insertion)或增加”是指氨基酸(或核苷酸)序列的改变造成在一分子或其表现物，相较于一参照序列(例如自然存在分子所发现的序列)，增加一个或一个以上的氨基酸残基(或核苷酸)。“取代”是指一个或一个以上的氨基酸(或核苷酸)被不同的氨基酸(或核苷酸)取代。与本发明序列相似或同源(例如序列有70%相同)的序列也是本发明的一部分。在某些实施例中，序列相同度可以是90%、、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。此外，实质相同也存在于当核酸片段可以与其互补股杂交(例如在高度严格的条件下)时。核酸可出现在全细胞、细胞溶解物或呈半纯化或纯化形式。两序列间“同源性”或“序列相同性”(两者在此处可交换使用)的计算方法如下所示。先将序列以最适合比较的方式对齐(例如可在第一或第二氨基酸(或核酸)序列加上缺口(gap)以最适合比较，并且比较时可去掉不同源的片段)。在本发明的一个优选实施例中，参照序列用于对齐比较的长度可以是参照序列长度的至少30%、较佳至少40%、更佳至少50%、更佳至少60%、更佳至少70%、80%、90%、100%。然后比较对应位置上的氨基酸残基(或核苷酸)。当第一序列以及第二序列相对应位置相同的氨基酸残基(或核苷酸)时，则在该位置相同(在此氨基酸(或核酸)“相同”指等同于氨基酸(或核酸)“同源”)。两序列之间的相同度百分比指两序列间共同拥有相同位置的数目的函数，其需考虑为了最佳化对齐所加入的缺口的数目与每一缺口的长度。两序列之间的序列比较与相同百分比可以利用一数学算法达成。在本发明的一个优选实施利中，两氨基酸序列之间的相同百分比可以利用已并入GCG软件包(http://www.gcg.com)GAP程序的NeedlemanandWunsch(1970)(J.MoI.Biol.48:444-453)算法决定，使用Blossum62matrix或PAM250matrix以及16、14、12、10、8、6或4的缺口加权与1、2、3、4、5或6的长度加权。在本发明的另一个优选实施利中，两氨基酸序列之间的相同百分比可以利用GCG软件包(http://www.gcg.com)决定，使用NWSgapdna.CMPmatrix以及40、50、60、70或80的缺口加权与1、2、3、4、5或6的长度加权。一组优选的参数组(当不确定哪些参数可用以决定一分子是否为本发明相同或同源的序列时，可使用此组参数)为，使用Blossum62scoringmatrix以及12的缺口罚分(penalty)、4的缺口延伸罚分与5的框架位移(frameshift)缺口罚分。两氨基酸(或核苷酸)序列之间的相同百分比也可以利用已并入ALIGN程序(2.O版)的E.Meyersandff.Miller((1989)CABI0S,4:11-17)算法决定，使用PAM120weightresiduetable以及12的缺口长度罚分与4的缺口罚分。II.TAT-H0XB4H重组蛋白质制造方法A.选殖与表现用于在各种宿主细胞中选殖与表现蛋白质的系统，在本领域中已经广为人知。适用于制造蛋白质的细胞，例如Fernandezetal.(1999)GeneExpressionSystems。简而言之，适合的宿主细胞包含哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞或原核细胞(例如E.coli)ο本领域中用于异源蛋白质表现的哺乳动物细胞，包含淋巴细胞株(例如NS0)、HEK293cells、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、COScells、HeLacells、幼仓鼠肾细胞、卵母细胞以及来自基因转殖动物的细胞，例如乳腺上皮细胞。合适的载体可以构筑成含有适当的调节序列，包含启动子序列、基因终止序列、多聚腺苷化序列、增强子序列、标记基因以及其它序列。载体可含有质体或病毒骨架。细节参见Sambrooketal.MolecularCloningALaboratoryManuals2nded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)。许多载体相关技术，包含操作、制备、形成突变、序列解读以及DNA转染(transfection)描述于CurrentProtocolsinMolecularBiology,SecondEdition,Ausubeletal.eds.,JohnWiley&Sons(1992)。本发明还提供了一种将核苷酸送入宿主细胞的方法。对于原核细胞，适合的转染技术包含磷酸钙、DEAE-Dextran,电穿孔、脂小体中介转染以及利用反转录病毒或其它病毒，例如牛痘病毒(vaccinia)或杆状病毒(baculovirus)。对于细菌细胞,适合的技术包含氯化钙转化(transformation)、电穿孔以及利用脂小体中介转染以及利用噬菌体转染。DNA送入之后，可以接着以选择方法(例如药物抵抗)来选择含有核苷酸的细胞。B.纯化与在再折迭TAT-H0XB4H蛋白质可以利用本领域任何已知的适当手段由重组宿主细胞单离。例如当蛋白质可被分泌时，其可以由细胞上清液中分离；或者蛋白质可由细胞溶解产物中分离。TAT-H0XB4H蛋白质可以利用层析法纯化，其包含(a)将细胞溶解产物或细胞上清液(假如蛋白质可被分泌)通入一HisTrap管柱；(b)以一缓冲溶液冲洗该HisTrap管柱；(c)将该部分纯化的蛋白质由该HisTrap管柱溶离出；(d)将由HisTrap管柱收到的部分纯化的蛋白质通入一MonoSP管柱；(e)以一缓冲溶液冲洗该MonoSP管柱；(f)将纯化的蛋白质由MonoSP管柱溶离出。细胞溶解产物或细胞上清液(假如蛋白质可被分泌)可以在4°C下以20，OOOxg离心30分钟使其澄清。将上清液调整至IOmM咪唑并加入HisTrap螯合管柱(AmershamPharmacia)。以8M尿素，20mMHEPES,0.5mMDTT，IOOmMNaClρΗ8·0缓冲溶液以及IOmM咪唑冲洗管柱，以移除未结合蛋白质。部分纯化的蛋白质可利用高浓度的咪唑以及盐由该HisTrap管柱溶离。进一步纯化指将由HisTrap管柱收到的部分纯化的蛋白质通入MonoSP管柱(AmershamPharmacia)。以4M尿素，20mMHEPES,5OmMNaClpH6.5缓冲溶液一缓冲溶液冲洗管柱，以移除未结合蛋白质。结合的TAT-H0XB4H可利用高浓度的盐溶离。此纯化步骤所得的TAT-H0XB4H蛋白质系呈变性形式。接着，利用疏水性化合物将由HisTrap管柱溶离的呈变性的TAT-H0XB4H蛋白质以下列步骤再折迭(i)将该溶离出的变性蛋白质与一疏水性化合物溶液混合形成一蛋白质与疏水性化合物溶液；(ii)将该蛋白质与疏水性化合物溶液去盐而得一蛋白质与疏水性化合物去盐溶液；(iii)利用超过滤制程将该疏水性化合物由该蛋白质与疏水性化合物去盐溶液中移除。本发明中，“疏水性化合物”是指任何可以在变性去盐步骤中，保护蛋白质使其不产生不溶性沈积的疏水性化合物。适用于本发明的疏水性化合物系描述于Oganesyanetal.、Pharmagenomics(2004)71、22-26。合适的疏水性化合物包括TritonX-100、tween_20或多苯环化合物。该超过滤制程或缓冲溶液转换可藉由蛋白浓缩管柱(centricontube)或蛋白超滤膜(stircell)进行。该超过滤制程或缓冲溶液转换的条件视蛋白质的种类而定。在本发明的一个实施例中，在含有H0XB4H蛋白质的去盐溶液中的疏水性化合物系藉由5-10次的缓冲溶液转换(每次以1000-2500xg离心10分钟)来移除，该缓冲溶液转换系以由低至高浓度的大分子疏水性物质(例如环糊精(cyclodextrin))溶液进行,藉此使变性的H0XB4H蛋白质再折迭恢复成天然形式(nativeform)。在本发明又一实施例中，纯化的TAT-H0XB4H蛋白质可储存在MDM(HyClone)培养基(储存缓冲溶液I)中，4°C或_20°C。在本发明又一实施例中，纯化的TAT-H0XB4H蛋白质可储存在DMEM(HyClone)培养基(储存缓冲溶液2)中，4°C或_20°C。在本发明又一实施例中，TAT-H0XB4H蛋白质C端的组胺酸标记可以在进行体内给药的前移除。在本发明又一实施例中，TAT-H0XB4H蛋白质N端的组胺酸标记可以在进行体内给药的前移除。在本发明又一实施例中，TAT-H0XB4H蛋白质N端的及C端的组胺酸标记可以在进行体内给药的前移除。C.制备医疗组成物当与药学上可接受的载剂结合时，TAT-H0XB4H可作为医疗组成物使用。除了TAT-H0XB4H蛋白质与载剂之外，此医疗组成物可包含各式各样的稀释剂、填充剂、盐类、缓冲剂、安定剂、助溶剂以及本领域中其它已知的材料。“药学上可接受”是指不会干扰活性剂生物活性的有效性的无毒材料。载剂的特性视给药途径而定。由于剂量均一以及服用方便，将组成物配方成剂量单元形式系较有利的。剂量单元形式在此处指，用于被治疗对象单元剂量的物理上可分开的单元。每一单元含有一预先设定量的活性剂，用以结合所要的医药载体，产生所要的治疗效果。本发明剂量单元形式的规格系视活性剂的独特性质、所要达成的特定治疗效果而定。典型的给药路径，包含口服、外用、非肠道(例如舌下或口含)、舌下、直肠、阴道以及鼻内。“非肠道(parenteral)”在此处包含皮下的(subcutaneous)、皮内的(intracutaneous)、静脉内的(intravenous)、肌肉注射(intramuscular)、胸骨内的(intrasternal)、阴莖海绵体内注射、鞘内的(intrathecal)、耳道内(intrameata)、尿道内(intraurethral)注射以及任何适当的注入技术。医疗组成物指配方成容许其所含有的活性剂在给予患者时具有生物可利用性。医疗组成物可以一个或一个以上的剂量单元给予患者，例如一个锭剂可以是单一剂量单元，而以喷雾剂形式的容器可含有复数个剂量单元。当以口服给予治疗有效量的TAT-H0XB4H蛋白质时，结合剂可以是以锭剂、胶囊、药粉、溶液或酏剂(elixir)的形式。当以锭剂形式给药时，本发明的医疗组成物可另包含固体载剂例如明胶，或佐剂。锭剂、胶囊、药粉可含有5%至95%的结合剂(bindingagent)，优选为含有25%至90%的结合剂。也可加入显色剂或调味剂。可使用膜衣层。当以液体形式给药时，可加入液体载剂例如水、石油(petroleum)、动物油或植物油(例如花生油、矿物油、大豆油、芝麻油)或合成油。以液体形式的医疗组成物可另包含生理食盐水、葡萄糖或其它醣类溶液或二醇例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。当以液体形式给药，医疗组成物可含有O.5%至90%的结合剂，优选为含有I%至50%的结合剂。当以静脉、皮肤或皮下注射给予一治疗有效量的TAT-H0XB4H蛋白质时，可以是无致热原的非肠道(parenteralIy)可接受的水溶液的形式。制备具有应有的pH值、等张性、安定性的非肠道可接受蛋白质溶液，属于该
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的公知技术。在某些实施例中，用于静脉、皮肤或皮下注射的医疗组成物可包含等张载体，例如氯化钠注射液、林格氏液、葡萄糖注射液、葡萄糖及氯化钠注射液、乳酸林格注射液或其它本领域公知的载体。本发明的医疗组成物还可包含安定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂或其它本领域公知的添加剂。在进行本发明治疗方法或使用本发明时，先将治疗有效量的TAT-H0XB4H蛋白质给予使用者，例如一哺乳类动物，当然，也可以是人类。“治疗有效量”在此处指该医疗组成物中活性剂的总量足以产生积极的效果，例如症状减轻、治愈或增加治愈率。当用在单一活性剂且单独给药时，“治疗有效量”单指该活性剂。当用于一组合时，“治疗有效量”指所有活性剂足以产生治疗效果的总合量，不论该些活性剂指系列性组合给药或同时组合给药。TAT-H0XB4H蛋白质在本发明医疗组成物中的含量视欲治疗症状的严重性与本质、患者先前接受的治疗本质以及患者的年龄及性别而定。最后，主治医师可以决定个别患者活性剂给药量。刚开始，主治医师可以给予低剂量的活性剂，并观察患者的反应。可给予较大剂量的活性剂直到患者得到适当的治疗效果，此时一般不会再增加剂量。用以实施本发明方法的医疗组成物可含有每公斤体重约Ig至约Img的TAT-H0XB4H蛋白质。给予使用者的剂量范围可选自IUg/kg至lmg/kg、Iμg/kg至0.5mg/kg、lμg/kg至0.lmg/kg、10μg/kg至0.5mg/kg、10μg/kg至0.lmg/kg、100μg至0.5mg/kg、250μg/kg至0.5mg/kg。此外，剂量范围可选自50μg至100mg、100μg至50mg、500μg至50mg、lmg至50mg。使用本发明医疗组成物的静脉注射时间视欲治疗的疾病严重性以及个别患者的特异反应而定。在本发明又一实施例中，施以本发明TAT-H0XB4H蛋白质的时间可以是12至24小时的连续静脉注射。在本发明又一实施例中，本发明TAT-H0XB4H蛋白质可持续使用，只要患者继续在进行化疗或放射线治疗。TAT-H0XB4H蛋白质可以静脉注射10-100μg/kg，一天两次，4.5至5天。一次治疗循环可能就足以在体内扩增造血干细胞。最后，主治医师可以决定使用本发明医疗组成物的适当静脉注射时间。化合物毒性以及治疗效价可以标准的药剂学程序以细胞培养或实验动物决定，例如LD5tl(总数50%致死剂量)以及ED5tl(总数50%有效治疗剂量)。毒性以及治疗间的剂量比例即为治疗指数，其可以LD5(i/ED5(i表示。细胞培养与实验动物的数据可以用来评估用于人类的剂量范围。化合物剂量可以在包含ED5tl且毒性小或无毒的循环浓度范围内。视所使用的剂型与给药途径，剂量可在上述范围内变化。TAT-H0XB4H的有效治疗剂量可以由细胞培养试验初步估计。在动物模型中，剂量可以是达到包含IC5tl(也即测试蛋白质达到最大症状抑制一半的浓度)的循环血浆浓度范围，就如同细胞培养决定的方式。血浆浓度可以利用高效液相层析测定。任何特定剂量的效果可以藉由适当的生物检定法(Bioassay)监测。适合的生物检定法包含，但不限于，利用标记有荧光探针(例如FITC)的CD34+干细胞抗体来量测在单核细胞内的CD34+干细胞，以及利用流式细胞仪量测在外围血液或骨髓造血干细胞中的LY5细胞比例。本发明的多核苷酸与蛋白质系预期可展现下述的一个或一个以上的用途或生物活性。本发明蛋白质的用途或活性可以由给药或使用此蛋白质的方式提供，也可由给药或使用编码此蛋白质的多核苷酸的方式(例如基因疗法或适用于送入DNA的载体)提供。III.体内造血刺激方法A.需要治疗的患者本发明的医疗组成物可用于治疗自体免疫疾病、免疫不全症以及血液疾病。此外，本发明的医疗组成物可用于改善造血干细胞移植后的恢复时间。本发明的医疗组成物可用于治疗罹患淋巴瘤、白血病、霍奇金氏症以及骨髓增生性疾病的患者。此外，造血干细胞缺乏而造成的先天性疾病以及再生不良贫血也可以本发明的医疗组成物治疗。此外，本发明的医疗组成物可用于造血干细胞捐赠者以及颗粒球细胞生长因子(G-CSF)不敏感患者。在本发明又一实施例中，TAT-H0XB4H是被用来动员造血干细胞的唯一活性剂，并且氟脲嘧啶(5-FU)并未给予捐赠者，不论是作为预处理或综合治疗计划。可以用本发明医疗组成物治疗的额外的疾病或与增加细胞生存相关的症状包括恶性肿瘤及相关疾病的进行及/或转移，例如早幼粒细胞白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病，急性髓细胞性白血病(包括髓细胞、早幼粒细胞、粒细胞、单核细胞、红白血病))和慢性白血病(例如慢性粒细胞(颗粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病)，骨髓形成异常症(myelodysplasticsyndrome),真性红血球增多症(polycythemiavera)，淋巴瘤(例如霍奇金氏症和非霍奇金氏症)，多发性骨髓瘤，Waldenstr5m巨球蛋白血症以及实体瘤，包括肉瘤和癌瘤，例如纤维肉瘤，黏液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，内皮细胞肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管内皮瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤文氏瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，胰脏癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，囊腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝癌，胆道癌，绒癌，精母细胞瘤，胚胎瘤，威姆氏瘤，子宫颈癌癌，睾丸肿瘤，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，胶质瘤，星形细胞瘤，髓母细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果腺瘤，血管母细胞瘤，听神经瘤,胶质瘤,黑色素瘤,神经母细胞瘤以及视网膜母细胞瘤。本发明并不限于特定的方法、实验计划、细胞株、动物物种或属或下述的试剂。所用来描述特定实施例的术语不能用以限定本发明的范围，本发明的范围应以权利要求书的范围为准。此处使用的，单数形式的“一”与“该”，除非文意另有所指外，也包含复数个。因此，举例来说，“一个细胞”是指一个或多个细胞，并且包括本
技术领域：
中已知的均等物。除非另外定义，否则所有的技术和科学所用词汇具有与本发明所属
技术领域：
中熟悉此技术者相同涵义的理解。虽然任何方法，组件和材料相似或均等于在此描述的，都可用于实践或试验本发明，优选的方法，组件和材料于现在描述。所有此处提及的刊物和专利在此并入用以描述和公开，举例来说，描述于刊物内的构造和方法，可与目前所描述的发明结合。先前以及本文中讨论的刊物仅提供作为本案有效日期前的公开。所有皆不可解释为承认发明人无法凭借先前发明来预见此公开。定义“干细胞”是一种多能或多潜能细胞，其有能力自我更新，以保持未分化，以及成为已分化。干细胞，至少在动物自然存在的一生中，可以无限分裂。干细胞并非末期分化，即它们不是在分化途径末端。当干细胞分裂，每个子细胞，可仍然是一个干细胞或可以走向出一条导致末期分化的路。“嵌合体”干细胞是指干细胞的一部分DNA属于一个异种生物体。“造血”细胞是指涉及造血过程(也即前体细胞形成成熟血液细胞的过程)的一种细胞。在成人，造血发生在骨髓。在发育早期，在不同发育阶段，造血发生在不同的地点；原始血液细胞出现于卵黄囊，后来，血液细胞形成在肝、脾和骨髓。造血有复杂的调控，包括激素(例如红血球生成素，生长因子(例如集落刺激因子和细胞因子(例如介白素)))。此处使用的“载体”是指能够运送另一种核酸的核酸分子，该另一种核酸连接于该核酸分子上。一种类型的载体是一个“质体”，这指的是一个圆形双股DNA环，额外的DNA片段可接合在其中。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA片段可接合在病毒基因体中。某些载体有能力在所送入的宿主细胞中自主复制(例如具有一个细菌复制来源的细菌载体和附加体质粒Gpisomal)哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加体质粒(episomal)哺乳动物载体)可以在送入宿主细胞时整合到宿主细胞的基因体中，从而随着宿主基因体复制。此外，某些载体，是有能力指挥其所连接的基因表现。这种载体在此是称为“重组表现载体”(或简单地说“表现载体”)。一般来说，用于DNA重组技术的表现载体通常是以质体的形式。在本发明中，“质体”与“载体”可以互换使用，因为质体是最常用的载体形式。然而，本发明包括具有等同功能的其它形式的表现载体，例如病毒载体(例如复制缺陷的反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。此处使用的“转化”是指将一个外源多核苷酸送入宿主细胞，不论用什么方法送入举例来说，直接吸收转化、转染以及感染等。特定的转染方法见于下文。外源多核苷酸可能是以未插入载体的形式(例如质粒)，或者可能被整合到宿主基因体中。一般来说，“蛋白质”是指任何两个或两个以上的个别氨基酸由胜肽键(peptidebond)接合的聚合物(不论是否自然发生)，该胜肽键指当键结在一个氨基酸(或氨基酸残基)的α碳的羧酸基的羧基碳原子，与键结在相邻氨基酸(或氨基酸残基)的α碳的胺基的氨基氮原子，所形成的共价键结。该胜肽键连接及其所包含的原子(也即α碳原子、羧基碳原子(以及其氧原子取代基)以及氨基氮原子(以及其氢原子取代基))形成蛋白质的“多胜肽骨架”。此外，此处使用的“蛋白质”可以理解为包括“多胜肽”以及“胜肽”(其有时可以交互使用)。同样，蛋白质片段，类似物，衍生物以及突变物可在此称为“proteins”，除非另有说明，也应被视为是一“蛋白质”。蛋白质“片段”是指包含少于一个蛋白质所有氨基酸残基的多胜肽。可以理解的是，蛋白质“片段”可能是一个在N端、C端或内部(例如受天然的剪接(splicing)所致)截短的蛋白质，可以是突变物及/或衍生物。蛋白质“功能区块(domain)”也是一个片段，其包含赋予蛋白质生化活性所需的氨基酸残基，对应于自然存在的蛋白质。“重组”在此处指一个核酸分子，基因组，基因，病毒，半合成，或合成的，其一部分或全部的多核苷酸并非天然。“重组”相对于一蛋白质或多胜肽而言，指以重组多核苷酸表现产生的多胜肽。一个“单离的”、“纯化的”、“实质上单离的”或“实质上纯化的”分子(如一个多胜肽或核苷酸)指被人为操作使相较于自然有较高的浓度。举例来说，当标的蛋白质被单离、纯化、实质上单离或实质上纯化，指至少有50%，70%，75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或以上的天然存在的非标的蛋白质物质被移除。此处使用的“单离的”、“纯化的”、“实质上单离的”或“实质上纯化的”分子包括重组分子。SCID“小鼠”指重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠模型，SCID会造成免疫系统发育的严重缺陷。无论是T或B淋巴球，这些小鼠皆不足或完全缺乏。该SCID突变似乎损害抗原受体基因的重组，导致缺乏功能性的T与B淋巴球。其它造血细胞类型可正常发展和运作。SCID小鼠随时支持正常淋巴球分化，并且可与来自同基因或异基因小鼠的正常淋巴球重组或与人类淋巴球重组。这些小鼠还支持异基因和异种基因肿瘤的生长。因此，SCID小鼠允许一些人类肿瘤的扩散增长，特别是血液系统疾病以及恶性黑色素瘤，因此可用于研究恶性肿瘤。“使用者”、“个人”、“宿主”以及“病人”在此处可互换使用，用以指活的动物，包括人类和非人类的动物。使用者可能是，举例来说，一个拥有免疫细胞的有机体，该免疫细胞能对抗源刺激产生反应，并且能对经由细胞表面的受体结合传递的刺激和抑制信号产生反应。使用者可以是一个哺乳类动物，例如人或非人类的哺乳动物，例如狗，猫，猪，牛，绵羊，山羊，马，大鼠以及小鼠。“使用者”并不排除，相对于疾病或各方面，完全正常的个人。“治疗”指的是一个治疗性或预防性的措施。治疗可施加于具有医疗疾病的使用者或最终会得到疾病者，用以预防、治疗、延误、减少严重性或改善一个或一个以上疾病或反复发生的疾病的症状，或用以延长使用者生存期间使其超过没有治疗所预期的生存期间。“治疗有效量”是指主化合物可引起预期反应(例如经由研究员、兽医、医生或其它的临床医师所认定的组织、制度、动物、动物或人类的生物或医学反应)的量。以下具体的例子是，以被视为仅仅是说明性的，无论在任何情况皆不是用以限定本发明的其它部分。本
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中普通技术人员可基于本申请文件的叙述而实施本发明。实例例I:pET21b-His-TAT-H0XB4-His质体的构筑(a)N-端及C-端含有组胺酸标记及TAT讯号胜肽的pET21b质体的修改N-端含有组胺酸标记及TAT讯号胜肽的pET21b表现载体由在pET21b质体插入下列寡核苷酸而得5’-TATGCACCACCACCACCACCACTACGGCCGCAAGAAACGCCGCCAGCGCCGCCGGCG-3’(正股(sense))及5，-CTAGCGGCGCTGGCGGCGTTTCTTGCGGCCGTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCA-3’(反股(antisense))。C-端组胺酸标记原本就存在于pET21b质体中。(b)将H0XB4选殖入修改后的pET21b表现质体含有H0XB4开放读框(ORF)以及额外六组胺酸编码序列的DNA片段，以MGC54130质体(GeneDiscovery,Taipei,Taiwan.Cat.No.5533346)为模板，利用聚合酵素链锁反应(PCR)放大而得，将PCR所得的H0XB4cDNA片段次选殖(subclone)到修改后的pET21b表现质体。构筑的质体以及核酸序列系如图2及图3所示。实例例2:在大肠杆菌表现TAT-H0XB4H重组蛋白质将pET21b-His-TAT-H0XB4_His表现质体转化至BL21(DE3)pLysS(Novagen)大肠杆菌株。令经转化的细胞于37°C下生长过夜。将过夜培养物稀释成起始0D_值为O.05，并置于37°C下生长至D6c值为O.5，接着以ImM异丙基硫代-β-D-半乳糖(IPTG)于37°C下进行诱导表现3小时，期间伴随剧烈摇晃。实例例3TAT-H0XB4H重组蛋白质的纯化在诱导作用后，将细胞以离心收集并再悬浮于缓冲液A(8M尿素，20mMHEPES,O.5mMDTT及IOOmMNaClpH8.O)中。将细胞悬浮液通过Frenchpress三次，并将细胞溶解产物以20，OOOXg于4°C下离心30分钟使其澄清。将上清液调整至IOmM咪唑并加样至HisTrap整合管柱(AmershamPharmacia)。将结合的蛋白以50、100及250mM配制于缓冲液A中的咪唑进行溶离。将含有TAT-H0XB4H的流份(fraction)加样至存在缓冲液B(4M尿素，20mMHEPES及50mMNaClpH6.5)的MonoSP管柱，以I.5MNaCl及20mMHEPES(pH8.O)溶离。实例例4:ΤΑΤ_Η0ΧΒ4Η重组蛋白质的复性(renaturation)将溶离流份中的TAT-H0XB4H蛋白质溶解并变性于一含有变性盐类(例如胍盐酸盐(guanidinehydrochloride))的溶液，然后将其与D-PBS-T缓冲溶液(含有0.I%TritonX-100的两倍磷酸盐缓冲溶液)混合。TAT-H0XB4H蛋白质溶液与D-PBS-T缓冲溶液的比例为I:4。将所成的混合液加入以水(10mlor3ml)前处理的10K蛋白浓缩管柱(centricontube)(50mlor15ml),离心3000rpm,10分钟。在此步骤中，变性盐类系被D-PBS-T缓冲液置换，D-PBS-T缓冲液中的TritonX-100系可与H0XB4H蛋白质的疏水性(Hydrophobic)区域结合接着以10K蛋白浓缩管柱(centricontube)进行超过滤或缓冲溶液置换步骤10次，以1000-2500g/min离心速度，依序将缓冲液置换为含lmM、2mM、3mM、4mM及5mMβ-环糊精(beta-cyclodextrin)的IMDM储存缓冲液，其中于各离心速度下以每种浓度置换离心两次。收集浓缩管柱中留存的样品，并保存于_20°C冰箱。纯化后TAT-H0XB4H蛋白质的均一性系以SDS-polyacrylamide凝胶以及coomassie染色分析。如图5所不，经HisTrapandMonoSP纯化的TAT-H0XB4H较原始TAT-H0XB4蛋白质的产率增加大约3-5倍。pTAT-HA_H0XB4质体，系加拿大蒙特娄大学(UniversityofMontreal)的盖·萨瓦格(GuySauvageau)博士所赠。pTAT-HA_H0XB4质体系转化至BL21(DE3)pLysS(Novagen)，TAT-H0XB4蛋白质的纯化系如Krosl等人(2003)所述。实例例5TAT-H0XB4H重组蛋白质的安定性TAT-H0XB4H的安定性系以SDS-polyacirlamide凝胶分析。储存时，全长的TAT-H0XB4H可能会降解为30kD与IOkD片段。如图6所示，本发明的TAT-H0XB4H蛋白质即使在PBS，-4°C中储存16小时依然安定。此外，储存在-4°C以及-200C，PBS以及MDM缓冲液的TAT-H0XB4H，以10%SDS-polyacrylamide凝胶电泳以及coomassie染色分析。如图7所示，当储存在IMDM储存缓冲液中，本发明的TAT-H0XB4H蛋白质可维持4星期。实例例6TAT-H0XB4H重组蛋白质对于Balb/c小鼠的造血影响TAT-H0XB4H重组蛋白质对于造血干细胞由骨髓动员至外围血液的可能影响系利用Balb/c小鼠研究。每天四次皮下注射4天给予小鼠TAT-H0XB4H重组蛋白质(在PBS中)。为了解剂量反应性，试验组(η=21)的剂量为lug、5ug、10ug、15ug...to100μg/kg体重。一组对照组只施打PBS，另一组对照组则每天两次皮下注射4天5μg/kg体重的G-CSF0取各组周边血液进行流式细胞仪分析，可得到CD34+干细胞在单核细胞(MNC)中的比例。结果以平均值土标准差的形式列于表一。表一组另IjTAT-H0XB4H(g/kg)CD34+/MNC(%)~II0+0.03~250.3+0.05~100.45+0.03~150.42+0.015200.38+0.05~6250.41+0.02~300.35+0.21~8350.33+0.11~9400.29+0.16~10450.46+0.01~Π500.45+0.02~12550.42+0.06~13600.44+0.0权利要求1.一种用于活体内投药以改善造血干细胞移植患者、放射线治疗患者或化疗患者的恢复时间的医疗组成物，其特征在于至少包含一有效量的TAT-H0XB4H重组蛋白质，该蛋白质的量系足以增加一有需要的使用者骨髓内造血干细胞的绝对数目。2.根据权利要求I所述的用于活体内投药以改善造血干细胞移植患者、放射线治疗患者或化疗患者的恢复时间的医疗组成物，其特征在于所述有需要的使用者系为一造血干细胞捐赠者。3.根据权利要求I所述的用于活体内投药以改善造血干细胞移植患者、放射线治疗患者或化疗患者的恢复时间的医疗组成物，其特征在于所述有需要的使用者系为一进行自体造血干细胞移植的患者。4.根据权利要求I所述的用于活体内投药以改善造血干细胞移植患者、放射线治疗患者或化疗患者的恢复时间的医疗组成物，其特征在于所述有需要的使用者系为一颗粒球细胞生长因子不敏感患者。5.根据权利要求4所述的用于活体内投药以改善造血干细胞移植患者、放射线治疗患者或化疗患者的恢复时间的医疗组成物，其特征在于所述使用者系罹患先天性造血干细胞缺乏而造成的疾病。6.根据权利要求5所述的用于活体内投药以改善造血干细胞移植患者、放射线治疗患者或化疗患者的恢复时间的医疗组成物，其特征在于所述使用者系罹患先天性再生不良贫血。7.根据权利要求I所述的用于活体内投药以改善造血干细胞移植患者、放射线治疗患者或化疗患者的恢复时间的医疗组成物，其特征在于所述使用者指罹患血液疾病、实体瘤或免疫疾病。8.根据权利要求7所述的用于活体内投药以改善造血干细胞移植患者、放射线治疗患者或化疗患者的恢复时间的医疗组成物，其特征在于所述血液疾病指选自由淋巴瘤、白血病、霍奇金氏症以及骨髓增生性疾病所组成的族群。全文摘要本发明公开了一种作为体内造血刺激剂的TAT-HOXB4H重组蛋白质及其医疗组成物，涉及一种C-端含有组胺酸标记的HOXB4重组蛋白质。解决了现有技术中由培养液纯化而得到的重组蛋白质产量少且安定性差的技术问题。本发明用以改善造血干细胞移植患者、放射线治疗患者或化疗患者的恢复时间的医疗组成物，至少包含一有效量的TAT-HOXB4H重组蛋白质，该蛋白质的量足以直接用于体内投药，而增加使用者骨髓内造血干细胞的绝对数目。本发明应用于增加骨髓内以及周边血液内的造血干细胞的数目。文档编号A61P7/00GK102805859SQ20121027551公开日2012年12月5日申请日期2008年5月27日优先权日2008年3月4日发明者吴国瑞,黄济鸿申请人:台湾尖端先进生技医药股份有限公司