抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列及其 应用。
【背景技术】
[0002] 肌肉生长抑制素（Myostain，MSTN)，又称生长因子-8(⑶F-8)，属转化生长因 子-(TGF-)超家族，发现于1997年，是一种骨骼肌生长发育的负调控因子。其活性的丧失 或降低会引起肌肉的过度增长，导致双肌性状。鸭MSTN基因含有375个氨基酸，其功能和 表达量的变化可能会通过调节生肌因子（MRF)等基因的表达而调节肌肉的生长发育。该基 因的表达抑制有助于研宄该基因的功能。
[0003] RNA干扰（RNAinterference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的，由双链 RNA (double-stranded RNA，dsRNA)诱发的，同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用 RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能 和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。短发卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)是可 以克隆到表达载体并表达短的干扰RNA (siRNA，19-21个核苷酸的RNA双链）的DNA分子， 包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop)序列分隔的，由polIII启动子控制，随后 再连上5-6个T作为RNA聚合酶III的转录终止子。通过载体将"短干涉RNA"输送入细胞 或活体组织中，被细胞机制切割成siRNA，由SiRNA发挥作用达到沉默靶基因表达的作用。
[0004] 目前，缺乏一种有效抑制鸭MSTN基因表达的ShRNA的序列及其应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了提供一种抑制鸭MSTN基因表达的ShRNA的序列及其应用。
[0006] 本发明的一种抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列，所述shRNA序列选自下列核苷 酸序列中的一种：
[0007] (1)如 SEQ ID NO. 1-2 所示的 DNA 序列；
[0008] (2)如 SEQ ID NO. 3-4 所示的 DNA 序列；
[0009] (3)如 SEQ ID NO. 5-6 所示的 DNA 序列。
[0010] 一种包含抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列的重组表达载体。
[0011] 所述重组表达载体是基于PLL3. 7载体构建的载体。
[0012] 所述重组表达载体用于促进鸭成肌细胞的增殖。
[0013] 所述shRNA序列用于促进鸭成肌细胞的增殖。
[0014] 本发明的有益效果为：首次报道了抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列。上述三种 抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列均可明显抑制鸭成肌细胞中MSTN基因在mRNA水平的 表达，并且，通过抑制鸭成肌细胞中MSTN的表达促进了鸭成肌细胞的增殖，上调生肌调节 因子Myf5基因的表达，下调生肌调节因子MyoDl基因的表达。本发明所述的鸭MSTN基因 的三种shRNA序列均能有效抑制鸭成肌细胞中MSTN基因的表达，在基因水平的抑制效率分 别达到了 61. 6%、79· I %和 76. 9%。
【附图说明】
[0015] 图1是本发明抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列重组慢病毒侵染鸭成肌细胞的 侵染效率照片；
[0016] 图2是本发明shRNA序列重组慢病毒对鸭成肌细胞中MSTN基因表达的抑制效果 图；
[0017] 图3是本发明shRNA序列重组慢病毒影响鸭成肌细胞的增殖结果图；
[0018] 图4是本发明shRNA序列重组慢病毒影响鸭成肌细胞中生肌因子表达结果图。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合附图和实施例对本发明进行详细地解释说明。
[0020] 实施例1
[0021] shRNA序列的设计和合成：
[0022] (1)通过 GenBank 数据库（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/genbank)查询鸭 MSTN 基因的mRNA信息，根据shRNA设计原则，设计了针对鸭MSTN基因的MSTN-shRNA序列，同时 设计了 1条无关的对照shRNA序列，作为对照组（control)。上述设计完成的shRNA序列 交由中美泰和生物技术有限公司合成。3条shRNA分别靶向鸭MSTN基因（EU336991.1)的 318位点、767位点以及1096位点，长为21个碱基。
[0023] 其中，本发明所涉及的MSTN-shRNA-318的作用位点序列为：
[0024] 5' -GGAAGACGATGACTATCATGC-3'
[0025] MSTN-shRNA-767的作用位点序列为：
[0026] 5' -GAGTTACAGACACACCGAAAC-3'
[0027] MSTN-shRNA-1096的作用位点序列为：
[0028] 5, -GCCATGGTTGTAGATCGTTGC-3'
[0029] 对照 shRNA 序列（Control-shRNA)为：
[0030] 5' -GATGGATCGATAGGTAACGGAG-3，
[0031] 针对上述3种shRNA及Control-shRNA的作用位点序列设计合成相应的shRNA正 义链与反义链DNA序列：
[0032] MSTN-shRNA-318 正义链：
[0033] 5' -GGAAGACGATGACTATCATGCtcaagagGCATGATAGTCATCGTCTTCCTTTTTc-3' （SEQ ID NO. 1)
[0034] MSTN-shRNA-318 反义链：
[0035] 5'-tcgagAAAAAGGAAGACGATGACTATCATGCctcttgaGCATGATAGTCATCGTCTTCC-3' （SEQ ID NO. 2)
[0036] MSTN-shRNA-767 正义链：
[0037] 5' -GAGTTACAGACACACCGAAACtcaagagGTTTCGGTGTGTCTGTAACTCTTTTTc-3' （SEQ ID NO. 3)
[0038] MSTN-shRNA-767 反义链：
[0039] 5'-tcgagAAAAAGAGTTACAGACACACCGAAACctcttgaGTTTCGGTGTGTCTGTAACTC-3' （SEQ ID NO. 4)
[0040] MSTN-shRNA-1096 正义链：
[0041] 5, -GCCATGGTTGTAGATCGTTGCtcaagagGCAACGATCTACAACCATGGCTTTTTc-3, （SEQ ID NO. 5)
[0042] MSTN-shRNA-1096 反义链：
[0043] 5'-tcgagAAAAAGCCATGGTTGTAGATCGTTGCctcttgaGCAACGATCTACAACCATGGC-3' （SEQ ID NO. 6)
[0044] Control-shRNA 正义链：
[0045] 5' -GATGGATCGATAGGTAACGGAGcgaaCTCCGTTACCTATCGATCCATCTTTTTc-3' （SEQ ID NO. 7)
[0046] Control-shRNA 反义链：
[0047] 5' -tcgagAAAAAGATGGATCGATAGGTAACGGAGttcgCTCCGTTACCTATCGATCCATC-3' （SEQ ID NO. 8)
[0048] 上述正义链模板的3'端添加了 c，反义链模板的5'端均添加了 tcgag，与XholI 形成粘端互补。
[0049] (2)将等量的正义链（100μΜ，2μ1)和反义链（100μΜ，2μ1)?ΝΑ混合，加入 IOXshDNA Annealing Buffer (2 μ 1)，再加双蒸水 14 μ 1，总体积 20 μ 1。在 PCR 仪上按照 如下程序进行退火处理：95°C 5min ;72°C IOmin ;放室温60min。退火处理后获得10 μΜ的 shRNA模板。取5 μ 1模板加水95 μ 1作为退火产物工作浓度用，工作浓度为500ηΜ。
[0050] (3)将PLL3. 7载体进行Hpal和Xhol双酶切，进行载体的线性化处理，酶切条件 如下所述：取1〇μ1的PLL3. 7载体，ΙμL的HpalI内切酶、ΙμL的XholI内切酶、6μ1的 lOXbuffer，CldH2O 42 μ 1，总体积60 μ 1，与37°C酶切3h，回收纯化后做连接反应。
[0051] (4)将线性化的PLL3. 7载体3 μ 1、经退火处理的shRNA模板2 μ I (500nM)，T4连接 酶1 μ 1、10 X T4连接缓冲液1 μ 1，双蒸水3 μ 1，共10 μ 1，混勾，于22°C连接过夜。取10 μ 1 连接产物转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，将细胞均勾涂布于含50 μ g/ml Ampicillin 的LB培养基平板上，平板倒置于37°C培养箱中，培养16小时。从每块平板上分别挑取5 个菌落，接种到含50 μ g/ml Ampicillin的LB培养基中，37°C培养16小时。使用碱裂解 法提取质粒，所得质粒用Xhol进行单酶切鉴定，同时进行测序鉴定后大量制备重组质粒 PLL3. 7-MSTN-shRNA。
[0052] (5)将重组载体 PLL3. 7-MSTN-shRNA-318、PLL3. 7-MSTN-shRNA-767、 PLL3. 7-MSTN-shRNA-1096 和 PLL3. 7-Control-shRNA 分别与含 VSV-g 的 PMD2. G 及含 gag/ pol的psPAX2包装质粒在生理盐水中混合，并加入转染试剂Fitran，孵化20min后缓慢均 匀滴入含293T细胞的培养皿中。放置37°C、5% CO2、饱和湿度培养箱中过夜培养。转染4-6 小时后换液，分别在转染48h和72h收集上清，3000rpm 4°C离心10min，取上清用0. 45 μ m 微孔滤器过滤。给慢病毒上清铺上20 %蔗糖垫50000g超高速离心浓缩2h，用PBS重溶慢 病毒颗粒。
[0053] 实施例2
[0054] 重组慢病毒感染鸭成肌细胞：
[0055] 将上述3种shRNA重组慢病毒和Control-shRNA的慢病毒颗粒转染鸭原代成肌细 胞，利用荧光显微镜技术检测不同shRNA的感染效率。
[0056] (1)实验分组：实验分 PLL3. 7-Control-shRNA 对照组（Control)、 PLL3.7-MSTN-shRNA-318 感染组、PLL3.7-MSTN-shRNA-767 感染组、 PLL3. 7-MSTN-shRNA-1096感染组，共4组，所有组的细胞数量和培养条件均