靶向沉默Kif2a的shRNA的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域，具体涉及特异性靶向沉默Kif2a的shRNA，首先是根据鼠源的Kif2a序列设计出19bp的目的片段，合成的目的片段两端带有合适的酶切位点，将目的片段连接到pSUPER载体上，连接转化，挑取阳性克隆鉴定，并进行DNA测序验证，最后进行沉默效率的检测。设计合成了能够靶向鼠源Kif2a的19bp的shRNA，序列为GCTGAAGAAG CCAAACTAT。
【专利说明】
靶向沉默Kif2a的shRNA
技术领域
[0001]本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域，具体涉及特异性靶向沉默Kif 2a的 shRNA〇
【背景技术】 [0002] Kif2a是1995年在小鼠的脑中发现的一种驱动蛋白，属于驱动蛋白-13(Kinesin-13)家 族中的一种，Kif2a分子由头部、颈部、马达区和尾部四个结构域组成，其头部结构主要参与 分子的亚细胞定位，马达结构位于中间区域，与带正电荷的颈部结构域结合后在解聚微管 的过程中发挥重要作用，主要通过ATP水解释放的能量使微管末端不稳定，进而触发微管发 生解聚，其尾部结构位于分子的C末端，主要负责驱动蛋白的二聚化及ATP酶活性的调节。
[0003] 近期研究发现，Kif 2a在神经系统发育过程中发挥一定的作用，其对神经元的形态 发生和维持至关重要，另外有报导，Kif 2a在乳腺癌的发生发展过程中同样起到一定的影 响。因此，构建特异性沉默Kif2a的载体尤为重要。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是合成特定的靶向沉默Kif2a的shRNA。为更加深入的研究Kif2a在 疾病发生发展过程中的作用提供了有效的手段。
[0005] 本发明中所需要构建的主要是Kif2a的沉默表达载体。核心沉默表达载体构建分 为两个大的步骤，首先是根据鼠源的Kif2a序列设计出19bp的目的片段，合成的目的片段两 端带有合适的酶切位点，将目的片段连接到PSUPER载体上，连接转化，挑取阳性克隆鉴定， 并进行DNA测序验证，最后进行沉默效率的检测。
[0006] 本发明中设计合成了能够靶向鼠源Kif2a的19bp的靶向沉默Kif2a的shRNA。序列 为GCTGAAGAAG CCAAACTAT 能够特异性沉默Kif2a的表达载体的构建包括以下步骤： 第一步，序列设计 根据鼠源Kif2a基因序列在Invitrogen公司主页上用相应的软件设计特异性识别 Kif2a的序列。
[0007] 第二步，沉默载体pSUPER-Kif2a shRNA的构建 将沉默载体pSUPER双酶切后，利用回收试剂盒回收线性化载体。将合成序列与其连 接、转化、挑取单克隆进行验证，最后进行DNA序列测定。
[0008] 第三步，沉默靶蛋白效率的检测 经转染细胞后提取蛋白，利用western blot等试验手段检测沉默效率。
[0009]
【附图说明】： 图1为pSUPER沉默载体Bgl Π 和Hindm双酶切电泳图； 左1: Bgl Π 单酶切;左2:: Hindm单酶切;右1: Bgl Π 和Hindm双酶切。
[0010] 图2为菌液PCR验证单克隆菌落是否正确； 图3为Western blot免疫印迹分析，转入Kif2ashRNA沉默载体后Kif2a表达量降低90%。
[0011] 本发明中设计合成的19bp的目的片段，能够特异性的沉默Kif2a，同时也为构建Kif2a_ shRNA提供关键的序列片段。由于Kif2a在神经元形态的发生及维持过程中发挥重要的作 用，因此，Kif2a沉默载体的构建为Kif2a在神经发育过程中的研究提供了必要的工具。
[0012]
【具体实施方式】： 实施例一：特异性沉默靶标蛋白Kif2a的载体构建 1、 特异性沉默靶蛋白Kif2a的序列设计 (1)根据鼠源Kif2a基因序列在Invitrogen公司主页上用相应的软件设计，设计的原 贝lj:19bp的特异性结合Kif2a的序列的GC含量为45%-55%，退火温度45°C_65°C，同时避免起 始端有两个以上的A，尾端不能有两个以上的T。将选取的片段进行BLAST人基因组比对，选 择特异性序列。
[0013] (2)以Bgin- N19-TT-loop- N'19-Hindm形式合成一段59bp序列，~'19为价9的 反向互补，5 '端为Bgl Π 酶切位点，3 '端为Hindm酶切位点。设计合成的片段分别靶向Kif2a 的cDNA序列963- 981(Kif2a shRNA 1)和 1452-1470(Kif2ashRNA 2)，Scramble shRNA非特 异靶向片段为 GTGAGATCGTAGTGCGTGA。
[0014] 2、 特异性沉默靶蛋白Kif2a的序列的合成与储存 (1)将合成的两段olig溶解至50 μΜ，各取100μΙ混合。
[0015] (2)95 °C变性5min，快速转移至70 °C水浴锅中，孵育10min，关闭水浴锅电源，过 夜。
[0016] (3)次日取出混匀，放在冰上备用，或者-20 °C长期保存。
[0017] 3、 沉默载体pSUPER-Kif2a shRNA的构建 (1)取1μg pSUPER载体，Bg 1 Π 和HindΙΠ 双酶切，电泳，回收线性大片段（图1)。
[0018] (2)连接和转化。将线性pSUPER浓度调整至200ngAil，连接反应(NEB公司的T4 DNA 连接酶）
室温连接4小时，将连接产物转化DH5a感受态细胞，涂布在具有Kan+的LB平板上。
[0019] (3)阳性克隆鉴定。在转化平板上挑取单克隆摇菌，加入到2ml液体LB培养基中进 行小摇，l〇h后进行菌液PCR(图2)，并小提质粒送北京华大基因测序。
[0020] 实施例二： 沉默靶蛋白效率的检测 (l)Kif2a-shRNA以及control电转进入NLT细胞，48h提取细胞总蛋白，利用Western blot免疫印迹分析，转入Kif2a-shRNA沉默载体后，Kif2a表达量降低90%(图3)。
【主权项】
1.靶向沉默Kif2a的shRNA，其特征是序列为GCTGAAGAAG CCAAACTAT。
【文档编号】C12N15/113GK105950624SQ201610362554
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】俞华莉, 朱筱娟, 孙栋
【申请人】东北师范大学