一种装载siRNA的仿生型磁小体及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种装载siRNA的仿生型磁小体及其制备方法，属于化学及生物医学领域。所述仿生型磁小体以水溶性MNC为核，外包白细胞膜，MNC与白细胞膜间装载有siRNA；所述仿生型磁小体白细胞膜外可共价偶联有具有修饰基团的抗体或肽。通过制备MNC、M、MNC:siRNA，将MNC:siRNA溶液、M溶液和缓冲液混合，得到所述仿生型磁小体；通过修饰基团将肽或抗体修饰到所述仿生型磁小体的白细胞膜上，得到偶联抗体或肽的所述仿生型磁小体。所述仿生型磁小体中的MNC具有正电荷，可吸附siRNA，外部包覆M仿生，可高效、快速达到病灶，同时避免生物体的免疫清除。
【专利说明】
一种装载s i RNA的仿生型磁小体及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种装载siRNA的仿生型磁小体及其制备方法，属于化学及生物医学 领域。
【背景技术】
[0002] RNA干扰(RNAi)是指生物体细胞内，和靶向目标基因同源的外源性或内源性双链 小RNA(siRNA)诱导转录后引起特异性基因沉默。RNAi类药物在肿瘤、基因疾病等病症上表 现出极大的应用前景，但到目前为止，RNAi技术在治疗肿瘤方面仍然存在siRNA靶向性和脱 靶效应、体内不稳定、干扰素效应、药物运送系统、给药方式以及药物安全性等问题。
[0003]纳米载体介导的基因转染具有其他药物载体所没有的优势，特别是磁性纳米粒子 拥有良好的生物相容性、优越的磁学性能以及较高的稳定性，可以用于磁靶向siRNA输送。 超顺磁性Fe30 4纳米材料在外加磁场条件下有较强磁性，撤去外加磁场后磁性很快消失，使 得纳米粒子在磁场中不会被永久磁化，这种独特物理和磁学特性，可以作为siRNA药物的靶 向载体，在磁场作用下，革G向输送药物到肿瘤等病灶部位。
[0004] -定温度下，铁磁性粒子出现超顺磁转变的阈值由有效磁各向异性和玻耳兹曼常 数决定而不可改变，增大铁磁性粒子的粒径可以增强磁矩及所述粒子的稳定性，但同时也 导致了所述粒子从超顺磁性向铁磁性的转变，由此引起的剩磁致使所述粒子不能分散在溶 液中，严重降低了生物分离的效率和重复性。因此，如何在确保超顺磁性和高的比饱和磁化 强度的同时，增强磁矩和磁可操纵性、提高稳定性以及保证好水溶性，是利用磁分离技术在 生物医学领域实际应用中亟待解决的关键问题。
[0005] 另外，siRNA抗肿瘤药物在生物有机体内需要通过血液循环抵达病变部位，以发挥 治疗作用。超顺磁性纳米药物载体的设计目标之一是维持其在生物有机体内的长循环时 间。可通过对载体系统表面进行修饰或改性来实现其在生物有机体内部的长循环，目前大 多通过表面修饰，如聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)或其他改性来实现载体在生物 有机体内部的长循环，虽然延长了循环时间，但多具有细胞毒性。
【发明内容】
[0006] 针对于现有技术中，siRNA抗肿瘤药物的不稳定性，其易被RNA酶降解、易被机体的 肾脏器官清除以及机体内部的循环半衰期极短的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种装 载siRNA的仿生型磁小体，所述仿生型磁小体可高效、快速地聚集于细胞，达到肿瘤病灶部 位，同时避免生物有机体免疫系统的免疫清除、巨噬细胞的吞噬等机体障碍，达到肿瘤治疗 的良好效果。
[0007] 本发明的目的之二在于提供一种装载SiRNA的仿生型磁小体的制备方法，经所述 方法可制备得到的装载s iRNA的仿生型磁小体。
[0008] 本发明的目的之三在于提供一种装载siRNA的仿生型磁小体的修饰方法。
[0009] 本发明的目的是通过下述技术方案现的。
[0010] 一种装载siRNA的仿生型磁小体，所述仿生型磁小体以水溶性Fe3〇4纳米团簇为核， 其外包覆白细胞膜，在所述Fe3〇4纳米团簇与白细胞膜之间装载有s iRNA;所述Fe3〇4纳米团 簇由Fe304纳米单晶和聚乙稀亚胺(polyethyleneimine，PEI)组成，带正电荷，粒径为30nm~ 196nm〇
[0011 ] 其中，优选所述Fe3〇4纳米团簇的粒径为81nm;
[0012]优选白细胞膜为白细胞系J774A. 1的细胞膜。
[0013] 本发明所述的装载siRNA的仿生型磁小体还可在白细胞膜外共价偶联有具有修饰 基团的抗体或肽，得到一种偶联抗体或肽的装载siRNA的仿生型磁小体；
[0014] 所述抗体为Fc端具有赖氨酸残基的抗体；
[0015] 所述肽为具有氨基的靶向肽、融合肽和穿膜肽中的一种以上；
[0016] 所述修饰基团为 DBC〇-PEGn-NHS，η = 1 ~2000，优选η = 4;
[0017] 所述修饰基团通过环炔化修饰与抗体或肽上的氨基偶联。
[0018] -种装载siRNA的仿生型磁小体的制备方法，所述制备方法步骤如下：
[0019] 步骤一、Fe3〇4纳米团簇(简称为MNC)的制备
[0020] (1)在无氧环境下，将NaOH完全溶解到二乙二醇(Diethylene glycol，DEG)中，制 备得到NaOH储存液；
[0021 ]其中，无氧环境可通过采用惰性气体脱氧处理和保护实现；
[0022] 可加热至100 °C~150 °C使NaOH完全溶解到DEG中，NaOH完全溶解时停止加热，优选 加热至120°C使NaOH完全溶解到DEG中；
[0023] 可将NaOH储存液保持在50 °C~100 °C下储存备用，优选将NaOH储存液保持在70 °C 下储存备用；
[0024]优选NaOH储存液采用如下方法制备和储存：
[0025]将DEG在惰性气体的环境下做脱氧处理，待氧气清除完全后，将NaOH溶解到DEG中， 同时加热，升温至120°C，直到NaOH完全溶解时停止加热，所述制备过程全程都需惰性气体 保护，得浅黄色溶液为NaOH储存液，保持在70 °C下储存备用。
[0026] (2)将铁源、PEI与溶剂混合均匀后抽真空5min~30min，然后填充氩(Ar)气保护， 加热至100 °C~180 °C，加入步骤一（1)所得的NaOH储存液，至溶液中NaOH的浓度为0.03mo 1 / L~0.4mol/L，待溶液颜色变黑后加热至190°C~230°C，继续冷凝回流30min~2h，反应结 束，得到含有带正电荷的MNC的反应液；
[0027]待含有带正电荷的MNC的反应液冷却后，磁分离，移去反应液，将磁分离产物超声 洗涤，再磁分离，移去反应液，得到磁分离终产物为MNC;将MNC悬浮于无 RNA酶的双蒸水中制 备得到MNC溶液；
[0028] 其中，所述溶剂为DEG，或DEG和乙二醇(Ethylene gl ycol，EG)的混合液，所述混 合液中EG与DEG的体积比为1:14~1:4,优选为2:13;
[0029]所述铁源为含有Fe2+，常温下稳定、能够在所述溶剂中溶解且不发生反应的物质， 优选为FeS〇4 · 7H20或FeCh · 4H20;
[0030]所述PEI作为交联剂和稳定剂使用；
[0031] 铁源与PEI的质量比为1:60~128:60;
[0032] 优选混合均匀后抽真空25min;
[0033]优选加热至160°C，再加入步骤一（1)所得的NaOH储存液；
[0034]优选加热至220°C继续冷凝回流lh，反应结束；
[0035]优选将磁分离产物先分散于无水乙醇中超声洗涤，再分散于去离子水中超声洗 涤;更优选在无水乙醇中反复超声洗涤3次，在去离子水中反复超声洗涤5次；
[0036]可根据需要，通过调节抽真空的时间或NaOH储存液加入量制备不同粒径大小的 MNC，如：
[0037] (1)当加入NaOH储存液体积为固定值时，通过调节抽真空5miη~30miη，可以制备 粒径为30nm~196nm的MNC;
[0038] (2)当抽真空时间为固定值时，NaOH的加入量变化，可以制备得到粒径为30nm~ 196nm 的 MNC〇
[0039 ]步骤二、修饰有叠氮胆碱的白细胞膜碎片(简称为Μ)的制备
[0040] 将白细胞在细胞培养完全培养基中培养20h~28h，换入含有0.1 mM~0.4mM叠氮胆 碱(N3)的细胞培养完全培养基中培养22h~28h，收集白细胞，重新悬浮于缓冲溶液中，用匀 浆机对重新悬浮于缓冲溶液中的白细胞进行间歇破碎，采用蔗糖密度梯度离心对间歇破碎 后的白细胞碎片进行分离提取，得到M;将Μ溶解与Hepes C缓冲液(购自赛默飞世而科技公 司）中，得到Μ溶液
[0041 ]其中，优选白细胞为J774A.1细胞系；
[0042]优选在37°C，C02浓度为5%的恒温培养箱中培养；
[0043]优选在细胞培养完全培养基中培养24h;
[0044] 优选换入含有N3的细胞培养完全培养基中培养24h;
[0045] 优选所述细胞培养完全培养基为内含10%体积分数胎牛血清(FBS)，60yg/mL青霉 素和100yg/mL链霉素的DMEM完全培养基(购自赛默飞世尔科技公司）；
[0046]优选含有N3的细胞培养完全培养基中含有0.1 mM的N3;
[0047] 优选用[KA_?Dispersers and Shakers勾衆机2档对白细胞进行间歇破碎。
[0048] 步骤三、装载s iRNA的仿生型磁小体(简称为M-M: s iRNA)的制备
[0049] (1)将步骤一制得的MNC溶液与siRNA混合，在4°C~8°C下垂直混悬5min~70min， 磁分离，将磁分离后物质再悬浮于无 RNA酶的PEI水溶液中，在0°C~8°C下垂直混悬20min~ 60min，磁分离得到MNC: s iRNA; MNC: s iRNA溶于无 RNA酶的双蒸水中，得到MNC: s iRNA溶液；
[0050] 其中，siRNA与MNC的摩尔比为1:5~1:15,优选为1:15;
[0051 ] 优选siRNA溶于无 RNA酶的双蒸水中，得到siRNA溶液与MNC溶液混合；
[0052] 优选加入s iRNA，在4°C下垂直混悬60min;
[0053] 优选无 RNA酶的PEI水溶液的浓度为0.024g/mL;
[0054] 优选将磁分离后物质再悬浮于无 RNA酶的PEI水溶液中，在4°C下垂直混悬30min。
[0055] (2)将步骤三（1)制得的丽C: siRNA溶液、步骤二制得的Μ溶液和缓冲液混合，Μ相对 于MNC: siRNA过量，在0 °C~8°C下垂直混悬6h~15h，磁分离收集得到表面包裹Μ的MNC: s iRNA，即M-MNC: s iRNA，为本发明所述的一种装载s iRNA的仿生型磁小体；
[0056] 其中，优选在4°C下垂直混悬8h;
[0057] 步骤（1)和(2)中，优选置于垂直混悬仪上垂直混悬，更优选以20r/min的转速进行 垂直混悬。
[0058]根据不同的使用需要，可对本发明所述的一种装载siRNA的仿生型磁小体进行生 物修饰，获得一种偶联抗体或肽的装载siRNA的仿生型磁小体:例如根据靶向肿瘤细胞的需 要，通过修饰基团将肽或抗体修饰到本发明所述的一种装载siRNA的仿生型磁小体的白细 胞膜上，步骤如下：
[0059] (1)将修饰基团水溶液与抗体或肽水溶液混合得到混合液，在室温下垂直混悬8h ~12h，除去未反应的修饰基团、抗体或肽小分子，制备得到带有环炔化修饰基团的抗体或 肽的溶液。
[0060]其中，修饰基团与抗体或肽的摩尔比为1:5;
[0061 ] 优选置于垂直混悬仪上垂直混悬，更优选以20r/min的转速进行垂直混悬10h;
[0062] 未反应的修饰基团、抗体或肽小分子可采用透析或超滤的方法除去。
[0063] (2)将M-MNC: s iRNA溶于无 RNA酶的双蒸水中得到M-MNC: s iRNA溶液，和带有环炔化 修饰基团的抗体或肽的溶液混合，在0 °C~8 °C下垂直混悬lh~3h，磁分离，其中，Μ上带有N3 基团，通过N3和带有环炔化修饰基团的抗体或肽的点击(click)化学反应，使带有环炔化修 饰基团的抗体或肽修饰到M-MNC: s iRNA表面，得到生物修饰后功能化的装载siRNA的仿生 型磁小体，即一种偶联抗体或肽的装载siRNA的仿生型磁小体。
[0064] 其中，M-MNC: siRNA与带有环炔化修饰基团的抗体或肽的摩尔比为1:5~1:15，优 选为1:10;
[0065] 优选在4Γ下垂直混悬lh。
[0066] 优选置于垂直混悬仪上垂直混悬，更优选以20r/min的转速进行垂直混悬。
[0067]具体生物修饰方法可为：
[0068] (1)将二苯基环辛炔-聚乙二醇（2000)-马来酰亚胺（DBC0-PEG(2000)-Mal (maleimide)，简称为DBCO-PEG-Mal)水溶液与精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，简 称为RGD)水溶液混合，在室温下垂直混悬8h~12h，然后除去未反应的DBCO-PEG-Mal及RGD， 得到DBC〇-PEG-Ma 1与R⑶的连接产物（简称为DBC〇-PEG-Ma 1-RGD)溶液；
[0069] (2)将M-MNC: siRNA溶于无 RNA酶的双蒸水中得到M-MNC: siRNA溶液，与DB⑶-PEG-Mal-R⑶溶液混合，在0°C~8°C下垂直混悬lh~3h，磁分离，其中，Μ上带有N3基团，通过N 3和 DBCO-PEG-Mal的click化学反应，使DBC〇-PEG-Mal-R⑶修饰到M-MNC: s iRNA表面，得到生物 修饰后功能化的装载siRNA的仿生型磁小体(简称为DBC〇-PEG-Mal-RGD-M-MNC : siRNA)，即 一种偶联抗体或肽的装载siRNA的仿生型磁小体。
[0070] 有益效果
[0071] 1.本发明提供了一种装载siRNA的仿生型磁小体，所述仿生型磁小体中的MNC具有 正电荷，可吸附siRNA，外部包覆Μ仿生，可高效、快速地聚集于细胞，达到肿瘤病灶部位，同 时避免生物体免疫系统的免疫清除、巨噬细胞的吞噬等机体障碍，达到肿瘤治疗的良好效 果；
[0072] 2.本发明提供了一种装载s iRNA的仿生型磁小体的制备方法，所述制备方法在MNC 制备过程中，以PEI为稳定剂，Fe2+铁源为反应前体，DEG和/或EG为溶剂，在碱性环境中，利用 反应体系溶剂中剩余氧气的氧化作用，氧化部分Fe 2+生成Fe3+，然后通过共沉淀反应生成 Fe3〇4单晶；在Fe3〇4单晶表面包裹PEI，通过PEI的交联作用，组装成MNC;
[0073]通过所述制备方法制得的MNC粒径均匀，通过改变制备时的抽真空时间或NaOH加 入量，可调控MNC粒径大小，其水溶性和分散性良好，具有很强的超顺磁性，且磁矩随着粒径 的增大明显增强;解决了现有MNC制备方法反应操作复杂、可重复性差、成本昂贵的问题，以 满足生物医学等领域对高性能磁性Fe 3〇4纳米材料的需求；
[0074] 3.本发明提供了一种装载siRNA的仿生型磁小体的制备方法，所述制备方法利用 MNC带有正电荷，可用来吸附带有负电荷的siRNA，装载siRNA方法，简单，操作方便，易分离； 利用PEI将丽C: siRNA表面转变为正电荷，再次利用静电作用将其包覆在Μ内，操作简单；由 于Μ的仿生效果，M-M: siRNA在生物体内循环过程中无法被白细胞识别，可以逃避白细胞的 吞噬，延长siRNA在生物体内的循环时间；
[0075] 4.本发明提供了一种装载s i RNA的仿生型磁小体的修饰方法，所述修饰方法在白 细胞培养过程中换入含有叠氮胆碱的培养基，可以将白细胞膜成功修饰上叠氮基团，白细 胞膜上的叠氮基团可与DBC0发生条件温和、高效的点击化学反应;很多功能蛋白及肽段可 修饰上DBC0，因此可以将所述多功能蛋白及肽段连接到白细胞膜上，继而完成所述仿生型 磁小体的多功能生物修饰；
[0076] 5.本发明提供了一种装载s i RNA的仿生型磁小体的修饰方法，所述修饰方法制得 的通过修饰基团连有抗体或肽的M-MNC: siRNA的核心为具有超顺磁性的MNC，粒径大小约为 30nm~196nm，可通实体瘤的高通透性和滞留（EPR)效应及磁富集作用聚集在肿瘤部位；同 时抗体或肽(RGD)还可靶向肿瘤细胞表面高表达的α νβ3整合素，也可进一步加快M-MNC: s iRN 富集在肿瘤部位，发挥siRNA药物的抗肿瘤作用。
【附图说明】
[0077]图1为实施例1中蔗糖密度梯度离心分离提取细胞膜蛋白结果（左）以及蛋白斑点 杂交(Dot Blot)分析结果(右）。
[0078]图2为实施例1中不同平均粒径的MNC的透射电子显微镜(TEM)图。
[0079] 图3为实施例1中平均粒径为81nm的MCN的高分辨透射电子显微镜(HRTEM)图。
[0080] 图4为实施例1中平均粒径为81nm的MNC的能谱图（EDS)。
[0081 ]图5为实施例1中不同平均粒径的MNC的X射线衍射(XRD)图谱。
[0082] 图6为实施例1中平均粒径为81nm的MNC的红外光谱(FTIR)图。
[0083]图7为实施例1中平均粒径为81nm的MNC在磁场中的分离前(左)后(右)的照片。 [0084]图8为实施例1中不同平均粒径的MNC的磁化曲线经Langewan方程拟合后的曲线。 [0085] 图9为实施例1中加入DBCO-Fluor 525的修饰有叠氮胆碱的白细胞膜、加入DB⑶- Fluor 525的未修饰叠氮胆碱的白细胞膜以及未加入DBCO-Fluor 525的未修饰叠氮胆碱的 白细胞膜的激光共聚焦显微镜图像及流式细胞仪荧光强度表征曲线。
[0086] 图10为实施例1中DBC〇-PEG-Mal与R⑶连接后，DBC〇-PEG-Mal-R⑶的基质辅助激光 解吸电离飞行时间质谱(MALDI-T0F-MS)。
[0087] 图11为实施例1中制得的M-MNC: s ihTERT的HRTEM成像图。
[0088] 图 12 为实施例 1 中制得的 M、M-MNC:sihTERT、MlPM--MNC:sihTERI^DBTO-Fluor 525染料染色后的激光共聚焦显微镜成像图。
[0089] 图13为实施例l中琼脂糖凝胶电泳检测MNC:sihTERT、M-MNC:sihTERT和DBC0-PEG-Mal-RGD-M-MNC: s ihTERT对s iRNA的保护作用的结果。
[0090] 图 14为实施例 1 中检测白细胞对MNC: s ihTETR，M-MNC: s ihTERT，R-M-MNC: s ihTETR 以及PEG-MNC:sihTERT内吞作用的激光共聚焦显微镜成像图。
[0091] 图15为实施例1中检测人乳腺癌细胞（MCF-7细胞）对MNC:sihTETR、M-MNC: sihTERT、R-M-MNC:sihTET和R-M-MNC:sihTERT(m+)的吞噬效果的激光共聚焦显微镜成像 图。
[0092] 图16为实施例1中用蛋白免疫印迹法(Western-blot)检测sihTERT沉默hTERT蛋白 的效果图。
[0093]图17为实施例1中采用检测细胞毒性方法检测sihTERT抑制肿瘤细胞能力结果图。 [0094] 图18为实施例3中检测人乳腺癌细胞(MB-MDA-231细胞系）对MNC: s iGFP、M-MNC: siGFP、R-M-MNC: siGFP和R-M-MNC: siGFP(m+)吞噬效果的激光共聚焦显微镜成像图。
[0095]图 19为实施例3 中检测MNC: s iGFP、M-MNC: s iGFP、R-M-MNC: siGFP和R-M-MNC: s iGFP (m+)沉默绿色荧光蛋白（GFP)能力的激光共聚焦显微镜成像图。
【具体实施方式】
[0096]下面结合实施例与附图对本发明进行详细说明。
[0097]以下实施例中：
[0098]所述磁分离具体采用方法为:使用磁吸附，将反应液用移液枪除去，获得剩余物质 即为磁分离产物。
[0099] 所述垂直混悬为置于垂直混悬仪上以20r/min的转速进行垂直混悬。
[0100]无 RNA酶的双蒸水购自北京索莱宝科技有限公司；
[0101]无定形碳膜铜网为D200，购自北京达济科仪科技有限公司；
[0102] Hepes B缓冲液和Hepes C缓冲液均购自赛默飞世尔科技公司；
[0103] 蛋白酶抑制剂购自罗氏公司；
[0104] 所述细胞培养完全培养基为内含10%体积分数胎牛血清(FBS)、60yg/mL青霉素和 l〇〇yg/m链霉素的DMEM完全培养基，购自赛默飞世尔科技公司；
[0105] 环块化的染料DBCO-Fluor 525购自Click Chemistry Tools;
[0106] SUPER Green II、罗丹明-鬼笔环肽染料以及hochest染料购自北京泛博生物化学 有限公司；
[0107] -抗CD45和辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠二抗购自艾博抗(上海）贸易有限公 司；
[0108] Tris-Buffered Saline Tween-20(TBST)、磷酸盐缓冲液（PBS)和聚偏二氟乙烯 (PVDF)膜和质量分数为1 %的羊血清购自北京索莱宝科技有限公司；
[0109] CCK-8细胞活性检测试剂盒购自碧云天，中国；
[0110] 荧光定量PCR试剂盒购自Takara，日本；
[0111] Western-blot试剂盒购自 Invent Biotechnologies，美国；
[0112] 其他所用试剂均购自西格玛公司；
[0113] 透射电子显微镜(TEM)采用日本电子株式会社(JE0L)的JEM-2100F;
[0114] 能谱仪(EDS)采用牛津仪器公司的Aztec;
[0115] X射线衍射(XRD)仪采用XPert PRO MPD，PANalytical，荷兰；
[0116] 红外光谱(FTIR)仪采用JASC0公司的FT/IR660;
[0117] 勾衆机米用德国IKA公司的丨丨(A?Dispersers and Shakers勾衆机，IKA?T18;
[0118] 离心机和离心管均购自美国贝克曼库尔特有限公司(Beckman Coulter, Inc.)，离 心机米用Beckman Coulter L-100XP Ultracentrifuge;
[0119] 激光共聚焦显微镜来自UltraVIEW VoX，PerkinElmer，美国；
[0120] 流式细胞仪来自Beckman Coulter，cyan;
[0121] LCQ DecaXP spectrometer MALDI质谱仪来自Thermo Fisher，美国。
[0122] 实施例1
[0123] -种装载siRNA的仿生型磁小体的制备方法，所述方法具体步骤如下：
[0124] 步骤一、MNC的制备
[0125] (1)将DEG在Ar气的环境下，待氧气清除完全后，将固体NaOH溶解到DEG中，同时加 热，升温至120°C，直到固体NaOH完全溶解时停止加热，所述制备过程全程都用Ar气保护，制 备得到浅黄色溶液，为NaOH储存液，保持在70°C下储存备用；
[0126] (2)将FeS〇4 · 7H20、PEI与溶剂混合均匀后抽真空25min，之后填充Ar气保护；加热 升温至160°C，加入步骤一（1)所得的NaOH储存液，至溶液中NaOH的摩尔浓度为0.03mol/L， 约3min后溶液颜色变成黑色，然后升温至220°C，继续冷凝回流lh，反应结束，得到含有带正 电荷的MNC的反应液；
[0127] 待含有带正电荷的MNC的反应液冷却后，磁分离，移去反应液，将磁分离产物分散 于无水乙醇中超声洗涤，反复3次，磁分离，将磁分离产物分散于去离子水中，超声洗涤5次， 得到磁分离终产物，为丽C;将MNC溶解于无 RNA酶的双蒸水中，得到MNC溶液，浓度为50yg/ mL〇
[0128] 其中，溶剂为DEG和EG的混合液，其中EG与DEG的体积为1:7。
[0129] PEI作为交联剂和稳定剂；
[0130] FeS〇4 · 7H20与PEI的质量比为 1:60。
[0131] 可根据需要，在其他制备条件不变的情况下，通过调节抽真空的时间制备不同粒 径大小的MNC，如表1所示：
[0132] 表1
[0133]
[0134] 或在其他制备条件不变的情况下，调节NaOH储存液的加入量为0.4mL，0.6mL， 0 · 75mL，0 · 8mL，0 · 85mL，1 · 2mL，1 · 5mL和2mL，制备不同粒径大小的MNC，如表2所示
[0135] 表2
[0136]
[0137] 步骤二、Μ的制备
[0138] 将白细胞1774六.1细胞系置于37°(：，0)2浓度为5%的恒温培养箱中，用细胞培养完 全培养基培养24h，换入含有0.1 mM的叠氮胆碱的细胞培养完全培养基中继续培养24h，收集 白细胞，弃掉培养基。
[0139] 将收集到的白细胞用pH 7.6的Hepes B缓冲液重新悬浮，加入10yL/mL的蛋白酶抑 制剂，用勾衆机2档间歇破碎细胞:破碎2min，停lmin，重复10次，然后1000r/min离心3min， 收集上清，沉淀用加了 1 OyL/mL蛋白酶抑制剂的Hepes B缓冲液重新悬浮，用勾楽:机2档间歇 破碎细胞:破碎2min，停lmin，重复10次，然后1000r/min离心3min，收集上清，上清液同样悬 浮于含蛋白酶抑制剂的Hepes B缓冲液中，两次上清液混入最后一次的细胞破碎液，得到在 缓冲溶液中破碎后的白细胞碎片，采用蔗糖密度梯度离心进行分离提取细胞膜蛋白，得到 Μ，将Μ溶解于Η印es C缓冲液，得到Μ溶液，浓度为20.33yg/mL。
[0140] 所述蔗糖密度梯度离心分离提取细胞膜蛋白具体为:在离心管中，从下到上依次 铺设质量分数为55 %、40 %和30 %的蔗糖溶液，4°C静置4h;加入Μ溶液，使用离心机在4°C、 28000g离心2h，如图1左所示，离心管中出现三个梯度的条带，由下向上依次为质量分数为 55%、40%和30%的条带，分别收集所述条带，分别用Hepes C缓冲液重新悬浮分离在质量 分数为55%、40%和30%的蔗糖溶液中的蛋白条带，用离心机在4°(：，2800(^离心301^11进行 脱糖处理，得到沉淀为M，对Μ进行蛋白斑点杂交(Dot blot)分析，具体方法为:将所述三个 条带分别每个取5yL样品依次点在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，风干后用质量分数为1%的羊 血清封闭过夜，将封闭好的PVDF膜浸泡至用PBS稀释过的一抗⑶45溶液中，CD45与roS的体 积比为1:200，震荡孵育111后取出，用1^8-81^€6代(13 &1丨1^1'冊611-20〇831')缓冲液震荡 洗3次，再将PVDF膜浸泡至用PBS稀释过的辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠二抗溶液中，所 述二抗与PBS的体积比为1:2000，震荡孵育lh后取出，用TBST缓冲液震荡洗3次，最后将PVDF 膜浸泡在DAB溶液中震荡孵育10min~30min，之后取出PVDF膜，用去离子水冲洗后晾干，在 凝胶成像仪上观察膜上的斑点，分析结果如图1右所示，PVDF膜出现由下向上三个斑点，依 次为质量分数为55%、40 %和30%的条带，可见质量分数为40%的条带对应斑点的颜色最 深，效果最好，因此选择40 %蔗糖浓度梯度分离提取的Μ包覆MNC。
[0141] 步骤三、M-M:siRNA的制备
[0142] (1)将平均粒径为81nm的MNC溶液中加入无 RNA酶双蒸水溶解的sihTERT(hTETR:人 端粒酶逆转录酶基因），sihTERT与MNC的摩尔比为1:10;置于垂直混悬仪，在4°C下以20r/ min垂直混悬60min，磁分离，去除未吸附的sihTERT，将磁分离后物质再悬浮于0.024g/mL无 RNA酶的PEI水溶液中，置于垂直混悬仪，在4°C下以20r/min垂直混悬60min，磁分离得到带 正电荷的MNC: sihTERT，溶解于无 RNA酶的双蒸水中，得到MNC: sihTERT溶液，浓度为50yg/ mL〇
[0143] (2)将MNC: sihTERT溶液、Μ溶液和Hepes C缓冲液混合，置于垂直混悬仪，在4°C下 以20r/min垂直混悬8h，磁分离收集得到表面包裹Μ的MNC: sihTERT，即M-MNC: sihTERT，为本 发明所述的一种装载s iRNA的仿生型磁小体。
[0144] 对M-MNC: s ihTERT进行生物修饰，修饰方法如下：
[0145] (1)将DBCO-PEG-Mal水溶液与R⑶水溶液混合，其中，DBCO-PEG-Mal与RGD的摩尔比 为1:5,置于垂直混悬仪，在室温下以20r/min垂直混悬12h，透析除去未反应的DB⑶-PEG-Mal及RGD，得到DBC〇-PEG-Mal-R⑶溶液，浓度为37mM;
[0146] (2)将M-MNC: sihTERT溶解于无 RNA酶的双蒸水得到浓度为50yg/mL M-MNC: sihTERT溶液，与DBC〇-PEG-Mal-R⑶溶液混合，其中M-MNC: sihTERT与DBC〇-PEG-Mal-R⑶的 摩尔比为1:10,置于垂直混悬仪，在4°C下以20r/min垂直混悬lh，磁分离，得到DB ω-PEG-Mal-RGD-M-MNC: sihTER T (可简写为R-M-MNC: sihTERT)，为经过生物修饰后的一种装载 siRNA的仿生型磁小体，。
[0147] 测试表征实验：
[0148] 1.对制备得到的MNC溶液进行测试表征实验如下：
[0149] I、分别取实施例1制得的不同粒径的MNC溶液各10yL，分别分散在lmL去离子水中， 得到稀释后的MNC溶液，取10yL稀释后的MNC溶液分别滴在无定形碳膜铜网载体，经干燥后， 通过透射电子显微镜（JEM-2100F)进行观察，如图2所示。抽真空时间为30min、25min、 20min、15min和5min时，获得的MNC依次分别如图2中图i、图ii、图iii、图iv和图v所示，可知 MNC的平均粒径分别为31nm、81nm、110nm、140nm和196nm，同时，可观察到所述MNC的分散性 良好且粒径较均一;对平均粒径为81nm的丽C用高分辨透射电子显微镜进行观察，如图3所 示，显示平均粒径为81nm的MNC并不是一个完整的单晶颗粒，而是由许多粒径约为llnm的 Fe3〇4单晶构成的团簇，同时还可以观察到外部模糊的PEI层，图3左中方框及图3右中右上角 的插图为晶格方向的放大图，通过测量相邻晶面的间距为〇.29nm，与面心立方结构的Fe 3〇4 晶体(220)晶面的晶格间距一致。
[0150] Π 、将平均粒径为81nm的MNC用能谱仪分析，结果如图4所示，可见其元素组成为C、 0、Fe，图4中有未标出的峰来源于无定形碳膜铜网载体。
[0151] 分别取实施例1制得的不同平均粒径的MNC各0.5g，分别采用X射线衍射仪进行X射 线衍射测试，采用波长为〇. 15406nm的Cu-Κα射线采集数据，衍射角2Θ为25°~70°，得到相应 的衍射图谱结果，如图5所示，可见图5中由上向下的曲线依次表示平均粒径为31nm、81nm、 11 Onm、140nm和196nm的MNC衍射曲线，衍射曲线中出现特征峰的2Θ角依次分别为30 · 4°、 35.6°、43.4°、53.4°、57.4°和62.7°，与JCPDS卡片对比后证明该所述特征峰的峰型为Fe 3〇4 晶体的特征衍射峰，分别所对应的Fe3〇4晶面依次为（220)、（311)、（400)、（422)、（511)和 (440 )，没有杂峰，衍射峰较尖锐，表明所述MNC结晶度较高。
[0152] m、将平均粒径为81nm的MNC经真空干燥，取少量与KBr晶体研磨，经压片处理后制 得样品，将样品采用红外光谱仪进行红外光谱分析，结果如图6所示，由图6可知在波数为 586.70CHT 1处有吸收峰，峰型尖锐，为Fe-Ο键特征吸收峰；1613.76CHT1处为氨基中N-H键弯 曲振动吸收峰，1053.07CHT 1为C-N键伸缩振动吸收峰;游离氨基在βδΟΟαιΓ1~3400011-1处应 有两条明显吸收带，但是在3418.20^^ 1处只有一个宽而强的吸收峰，证明PEI包裹在所述 MNC表面致使其化变化而导致两条吸收峰变为一条。
[0153] IV、所述MNC具有很强的磁可操纵性，取平均粒径为81nm的MNC分散于水中，呈现如 图7左所示的黑色溶液，通过磁铁磁分离，仅约10s即可完全富集分离，溶液由黑色变澄清， 如图7右所示;平均粒径为31nm、110nm、140nm和196nm的MNC进行所述磁可操纵性实验，结果 类似。
[0154] V、常温下（300K)，将所述不同平均粒径的MNC真空干燥后，进行振动样品磁强计 (VSM)测试后得到磁化曲线，如图8所示，可见图8中五个曲线图中的曲线分别代表平均粒径 为31]1111、8111111、11〇11111、14〇111]1和196111]1的丽(]的磁化曲线，所对应的比饱和磁化强度分别依次 为61 · 99emu/g、71 · 39emu/g、73 · 05emu/g、76 · 37emu/g和 80 · 78emu/g，数值随着平均粒径的 增大而增大；同时可以看出磁化曲线都为"S"型，剩磁和矫顽力都为0,说明，常温下尽管丽C 粒径在24.8nm以上，但仍表现超顺磁性。
[0155] 2.对制备得到的Μ溶液进行测试表征实验如下：
[0156] (1)利用点击化学(Click)反应，使环炔化的染料(DBCO-Fluor 525)标记白细胞系 J774A.1的细胞膜，通过激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对所述细胞膜的叠氮胆碱修饰情 况进行表征，具体步骤如下:将J774A.1细胞系的白细胞置于37°C，C0 2浓度为5%的恒温培 养箱中，用细胞培养完全培养基培养24h，分别换入含有0.1 mM和0.4mM的叠氮胆碱的细胞培 养完全培养基继续培养24h。
[0157] 弃掉培养液，加入lmL的体积分数为4%的多聚甲醛固定15min，除去多聚甲醛，用 磷酸盐缓冲液洗涤2次;之后加入ΙΟμΜ的DBCO-Fluor 525染料，37°C孵育lh后，倒掉染料，再 用PBS洗涤2次，加入PBS获得样品溶液，进行激光共聚焦荧光成像和流式细胞仪表征荧光强 度检测。
[0158] 经过含有0.1 mM的叠氮胆碱的细胞培养完全培养基继续培养24h后获得的样品溶 液进行激光共聚焦荧光成像检测结果如图9中cl所示，有红色荧光信号，说明细胞膜上有叠 氮胆碱并被DBCO-Fluor 525染料所染色;流式细胞仪表征荧光强度检测结果如图9中c2所 示，有荧光信号值为1215.25,比a2，b2都要高，表明细胞膜上的叠氮基团已经被DBCO-Fluor 525染料所染色，同时也证明J774A. 1细胞膜上已经成功修饰有叠氮基团。
[0159] 经过含有0.4mM的叠氮胆碱的细胞培养完全培养基继续培养24h后获得的样品溶 液进行激光共聚焦荧光成像检测结果如图9中dl所示，有红色荧光信号，说明细胞膜上有叠 氮胆碱并被DBCO-Fluor 525染料所染色;流式细胞仪表征荧光强度检测结果如图9中d2所 示，有荧光信号值为1768.98，出现双峰，为叠氮基团过多及分布不均，说明0.4mM叠氮胆碱 浓度较〇. ImM叠氮胆碱浓度较高，结合的DBCO-Fluor 525也较多。
[0160] (2)对照实验1:将J774A. 1细胞系的白细胞置于37°C，C02浓度为5%的恒温培养箱 中，用细胞培养完全培养基培养48h。
[0161 ]弃掉培养液，加入lmL的体积分数为4 %的多聚甲醛固定15min，用PBS洗两次，进行 激光共聚焦荧光成像和流式细胞仪表征荧光强度检测。
[0162] 激光共聚焦荧光成像检测结果如图9中al所示，无红色荧光信号，说明细胞膜上无 叠氮胆碱，也未加入DBCO-Fluor 525染料;流式细胞仪表征荧光强度检测结果如图9中a2所 示，流式图荧光信号值为2.59，信号值较低。
[0163] (3)对照实验2:将J774A. 1细胞系的白细胞置于37°C，C02浓度为5%的恒温培养箱 中，用细胞培养完全培养基培养培养48h。
[0164] 弃掉培养液，加入lmL的体积分数为4 %的多聚甲醛固定15min，用roS具体洗两次； 之后加入1〇μΜ的DBCO-Fluor 525染料，37°C孵育lh后，倒掉染料，再用PBS洗涤2次，加入PBS 获得样品溶液，进行激光共聚焦荧光成像和流式细胞仪表征荧光强度检测。
[0165] 激光共聚焦荧光成像检测结果如图9中bl所示，有较弱的红色荧光信号，说明细胞 膜上无叠氮胆碱，不能与DBCO-Fluor 525发生点击化学反应，但因 DBCO-Fluor 525少量非 特异吸附在细胞上，因此激光共聚焦荧光成像图有较弱的红色荧光信号;流式细胞仪表征 荧光强度检测结果如图9中b2所示，流式图流式图荧光信号值为94.95,为DB⑶-Fluor 525 染料的非特异性吸附荧光值。
[0166] 综上所述，可以证明制备得到的Μ为修饰有叠氮基团的白细胞膜碎片，选用含有 0.1 mM的叠氮胆碱的细胞培养完全培养基进行培养。
[0167] 图9中，DBCO-Fluor 525( + )表示加入有DBCO-Fluor 525，DBC〇-Fluor 525(-)表示 未加入DBCO-Fluor 525; Az ide-Cho表示叠氮胆碱。
[0168] 3.对制备得到的DBC〇-PEG-Mal-RGD溶液进行测试表征实验如下：
[0169] 取DBC〇-PEG-Mal-R⑶溶液，在LCQ DecaXP spectrometer MALDI质谱仪上检测，检 测结果如图10所示，a表明DB⑶-PEG-Mal与RGD连接形成DBC〇-PEG-Mal-RGD，分子量为 1382 · 025; b为DBC〇-PEG-Mal，分子量为707 · 627，c为RGD，分子量为674 · 755;说明DBC0-PEG-Mal与R⑶已经连接。
[0170] 4.对制备得到的M-MNC:sihTERT进行测试表征实验如下：
[0171] I、将10yL实施例1制得的M-MNC: sihTERT溶液分散在lmL去离子水中得到样品，取 约1〇此样品滴在无定形碳膜的铜网上，通过高分辨透射电子显微镜进行观察，结果如图11 所示，可见MNC外围一层稍透明的白细胞膜。
[0172] Π 、将Μ和M-MNC:sihTERT用DB⑶-Fluor 525染料染色，在激光共聚焦显微镜下观 察。
[0173] 对照试验1:将实施例1步骤二中的白细胞J774A. 1细胞系用细胞培养完全培养基 培养24h，换入含有0.1 mM的叠氮胆碱的细胞培养完全培养基中继续培养24h改为用细胞培 养完全培养基培养48h，其余步骤同实施例1的步骤，可得到未修饰叠氮胆碱的的白细胞膜 碎片（简称为M-)溶液以及M--MNC: s i hTERT溶液。将M-以及M--MNC :sihTERT用DB⑶-Fluor 525染料染色，在激光共聚焦显微镜下观察。
[0174] 激光共聚焦显微镜下观察结果如图12所示，标尺为ΙΟμπι。其中，al为Μ用DB⑶-Fluor 525染料染色后的观察结果，图中有红色荧光，说明细胞膜上修饰有叠氮胆碱;bl为 M-MNC: sihTERT用激光共聚焦显微镜，激发光488，发射光488-500处得到的反射图，表现为 绿色荧光，说明M-MNC:sihTERT的细胞膜上修饰有叠氮胆碱;clMerge为al和bl的叠加图，图 中有绿色和红色荧光，说明M-MNC: s ihTERT的细胞膜上修饰有叠氮胆碱。
[0175] a2为ΙΓ用DB⑶-Fluor 525染料染色后的观察结果，图中没有荧光，说明细胞膜上 没有修饰叠氮胆碱，不能被DBCO-Fluor 525染料染色;b2*M_-MNC: sihTERT用激光共聚焦 显微镜，激发光488，发射光488-500处得到的反射图，表现为绿色荧光为『-MNC: sihTERT; c2Merge为a2和b2的叠加图，图中只有绿色荧光，说明M--MNC: sihTERT的细胞膜上没有修饰 有叠氮胆碱。
[0176] IΠ 、用琼脂糖凝胶电泳检测sihTERT、MNC:sihTERT、M-MNC:sihTERT和DBCO-PEG-Mal-RGD-M-MNC: sihTERT，具体方法如下：
[0177] 将sihTERT和DBC〇-PEG-Mal-R⑶-M-MNC:sihTERT分别溶解在无 RNA酶双蒸水溶液 制得浓度为5nM sihTERT溶液和DBC〇-PEG-Mal-RGD-M-MNC: sihTERT溶液，将所述4种溶液分 别放入含有体积分数10 %的FBS的roS中处理4h，得到4个样品；对照样品为sihTERT溶液。将 4个样品和1个对照样品分别于l%(w/v)琼脂糖凝胶的3，13，(3，(1，6五个点样孔处点样3以1^，显 色剂为SUPER Green II，在80V电压下电泳30min。电泳结果如图13所示，由左向右的a、b、c、 d和e分别依次为处理后sihTERT、MNC:sihTERT、M-MNC:sihTERT和DB⑶-PEG-Mal-RGD-M-MNC: sihTERT电泳结果；a中sihTERT被血清降解后，条带变淡，b中由于sihTERT与MNC吸附， MNC可减少血清对sihTERT的降解，同时MNC吸附siRNA后限制siRNA条带速度，故条带较淡， 并靠后；c 和d分别为 M-MNC:sihTERT和 DBC〇-PEG-Mal-R ⑶-M-MNC:sihTERT，均无条带出现， 说明M-MNC: sihTERT和DBC〇-PEG-Mal-RGD-M-MNC: sihTERT均对sihTERT有保护作用，且限制 s i R N A电泳。e为对照组的s i h T E R T，出现条带，说明没有放入10 %的F B S血清中处理的 s ihTETR不会被降解，为正常的s ihTERT出现的电泳条带。
[0178] 5.对制备得到的M-MNC: sihTERT的抑瘤能力进行测试表征实验如下：
[0179] I、检测仿生磁小体降低白细胞对其吞噬效果。
[0180] 将J774A. 1细胞系的白细胞置于37°C，C02浓度为5%的恒温培养箱中，用细胞培养 完全培养基培养24h，将实施例1中步得到的MNC: s ihTETR，M-MNC: s ihTERT，R-M-MNC: sihTETR以及将步骤三（2)步中的Μ换为PEG，其余同实施例1，得到的PEG-MNC:sihTERT四种 样品分别加入J774A. 1细胞，在37 °C孵育24h，弃掉培养基，PBS洗涤三次，分别用罗丹明-鬼 笔环肽染料染细胞膜，Hochest染料染细胞核，用激光共聚焦显微镜观察白细胞对四种样品 吞噬能力。如图14所示，图中红色代表细胞膜，蓝色代表细胞核，绿色为细胞内吞的各样品， 由图可见，包覆白细胞膜的M-MNC: sihTERT及R-M-MNC: sihTERT可逃避白细胞的吞噬，细胞 中的绿色荧光少于MNC: s ihTERT及PEG-MNC: s ihTERT组。
[0181] Π 、检测人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)对仿生磁小体的吞噬效果。
[0182] 将人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)细胞系置于37°C，C02浓度为5%的恒温培养箱中，用 细胞培养完全培养基培养24h，得到细胞培养液，将实施例1得到的MNC: sihTETR，M-MNC: sihTERT和R-M-MNC: sihTET分别加入细胞培养液中，其中R-M-MNC: sihTERT组分成两份加入 细胞培养液，分别为加磁组(R-M-MNC: sihTERT (m+))及不加磁组(R-M-MNC: sihTERT)，四组 样品在MCF-7培养体系中继续培养24h，移出细胞培养液，细胞染色同51中J774A.1中染色， 细胞膜，细胞核，样品颜色同51。
[0183] 如图 15所示，MCF-7细胞吞噬R-M-MNC: sihTERT(m+)组及R-M-MNC: sihTERT组较多， 细胞中的绿色荧光多于MNC: sihTERT及M-MNC: sihTERT组。
[0184] m、抑制肿瘤细胞能力实验
[0185] 人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)细胞系置于37°C，C02浓度为5%的恒温培养箱中，用细 胞培养完全培养基培养24h。将sihTERT、实施例1得到的MNC: sihTETR，M-MNC: sihTERT和R-M-MNC: sihTETR分别加入细胞培养液中，其中R-M-MNC: sihTERT组分成两份加入细胞培养 液，分别为加磁组（R-M-MNC: s ihTERT (m+))及不加磁组（R-M-MNC: s ihTERT )，五组样品在 MCF-7培养体系中继续培养24h，收集细胞;按荧光定量PCR试剂盒(Takara，日本)方法检测 仿生磁小体所装载的sihTETR沉默人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因 mRNA的能力；用Western-blot试剂盒 （Invent Biotechnologies， 美国）检测sihTETR 沉默 hTERT蛋白表达能力 ，结果 如图16所示。
[0186] 由图16可见装载sihTERT的并带有R⑶肽的仿生磁小体组(R-M-MNC:sihTERT)组与 其加磁组（R-M-MNC: sihTERT(m+))相比较于s ihTERT，MNC: s ihTERT和M-MNC: siTERT沉默 hTETR基因效果更好，更多的减少hTERT基因表达蛋白量，可见s i hTERT: R-M-MNC有更好的沉 默肿瘤s ihTERT基因的效果。
[0187] 用CCK-8细胞活性检测试剂盒(碧云天，中国）检测sihTERT抑制肿瘤细胞能力，结 果如图17所示，装载sihTERT的并带有R⑶肽的仿生磁小体组(R-M-MNC:sihTERT)组与其加 磁组（R-M-MNC: s ihTERT (m+))相比较于s ihTERT、MNC: s ihTERT和M-MNC: siTERT对细胞的毒 性作用更大，可更有效的抑制肿瘤细胞生长。
[0188] 实施例2
[0189] -种装载siRNA的仿生型磁小体的制备方法，所述方法具体步骤如下：
[0190] 步骤一、MNC的制备
[0191] (1)将DEG在Ar气的环境下，待氧气清除完全后，将固体NaOH溶解至IjDEG中，同时加 热，升温至l〇〇°C，直到固体NaOH完全溶解时停止加热，所述制备过程全程都用Ar气保护，制 备得到浅黄色溶液，为NaOH储存液，保持在70°C下储存备用；
[0192] (2)将FeCl2 · 4H20、PEI与溶剂混合均匀后抽真空25min，之后填充Ar气保护；加热 升温至100°C，加入步骤一（1)所得的NaOH储存液，至溶液中NaOH的摩尔浓度为0.03mol/L， 约3min后溶液颜色变成黑色，然后升温至190°C，继续冷凝回流30min，反应结束，得到含有 带正电荷的MNC的反应液；
[0193] 待含有带正电荷的MNC的反应液冷却后，磁分离，移去反应液，将磁分离产物分散 于无水乙醇中超声洗涤，反复3次，磁分离，将磁分离产物分散于去离子水中，超声洗涤5次， 得到磁分离终产物，为丽C;将MNC溶解于无 RNA酶的双蒸水中，得到MNC溶液，浓度为50yg/ mL〇
[0194] 其中，溶剂为DEG;
[0195] PEI作为交联剂和稳定剂；
[0196] FeCh · 4H20与PEI的质量比为 128:60。
[0197] 步骤二、Μ的制备
[0198] 将白细胞1774六.1细胞系置于37°(：，0)2浓度为5%的恒温培养箱中，用细胞培养完 全培养基培养20h，换入含有0.4mM的叠氮胆碱的细胞培养完全培养基中继续培养22h，收集 白细胞，弃掉培养基。
[0199] 将收集到的白细胞用pH 7.6的Hepes B缓冲液重新悬浮，加入10yL/mL的蛋白酶抑 制剂，用勾衆机2档间歇破碎细胞:破碎2min，停lmin，重复10次，然后1000r/min离心3min， 收集上清，沉淀用加了 1 OyL/mL蛋白酶抑制剂的Hepes B缓冲液重新悬浮，用勾楽:机2档间歇 破碎细胞:破碎2min，停lmin，重复10次，然后1000r/min离心3min，收集上清，上清液同样悬 浮于含蛋白酶抑制剂的Hepes B缓冲液中，两次上清液混入最后一次的细胞破碎液，得到在 缓冲溶液中破碎后的白细胞碎片，采用蔗糖密度梯度离心进行分离提取，得到Μ，将Μ溶解于 ifepes C缓冲液，得到Μ溶液，浓度为20.33yg/mL。
[0200] 所述蔗糖密度梯度离心具体同实施例1。
[0201] 步骤三、M-M: siRNA的制备
[0202] (1)将平均粒径为81nm的MNC溶液中加入无 RNA酶双蒸水溶解的sihTERT中， sihTERT与MNC的摩尔比为1: 5;置于垂直混悬仪，在8°C下以20r/min垂直混悬60min，磁分 离，去除未吸附的sihTERT，将磁分离后物质再悬浮于0.024g/mL无 RNA酶的PEI水溶液中，置 于垂直混悬仪，在〇°C下以20r/min垂直混悬20min，磁分离得到带正电荷的MNC: sihTERT，溶 解于无 RNA酶的双蒸水中，得到MNC:sihTERT溶液，浓度为50yg/mL。
[0203] (2)将MNC: sihTERT溶液、Μ溶液和Hepes C缓冲液混合，置于垂直混悬仪，在0°C下 以20r/min垂直混悬6h，磁分离收集得到表面包裹Μ的MNC: sihTERT，即M-MNC: sihTERT，为本 发明所述的一种装载s iRNA的仿生型磁小体。
[0204] 对M-MNC: s ihTERT进行生物修饰，修饰方法如下：
[0205] (1)将DBCO-PEG-Mal水溶液与R⑶水溶液混合，其中，DBCO-PEG-Mal与RGD的摩尔比 为1:5，置于垂直混悬仪，在室温下以20r/min垂直混悬8h，透析除去未反应的DBCO-PEG-Mal 及RGD，得到DBC〇-PEG-Mal-R⑶溶液，浓度为37mM;
[0206] (2)将M-MNC: sihTERT溶解于无 RNA酶的双蒸水得到浓度为50yg/mL M-MNC: sihTERT溶液，与DBC〇-PEG-Mal-R⑶溶液混合，其中M-MNC: sihTERT与DBC〇-PEG-Mal-R⑶的 摩尔比为1: 5，置于垂直混悬仪，在0°C下以20r/min垂直混悬lh，磁分离，得到DBTO-PEG-Mal-RGD-M-MNC: sihTER T (可简写为R-M-MNC: sihTERT)，为经过生物修饰后的一种装载 siRNA的仿生型磁小体。
[0207] 测试表征实验方法同实施例1，测试样品为实施2制得，测试结果与实施例1测试结 果相似。
[0208] 实施例3
[0209] -种装载siRNA的仿生型磁小体的制备方法，所述方法具体步骤如下：
[0210] 步骤一、MNC的制备
[0211] (1)将DEG在Ar气的环境下，待氧气清除完全后，将固体NaOH溶解到DEG中，同时加 热，升温至150°C，直到固体NaOH完全溶解时停止加热，所述制备过程全程都用Ar气保护，制 备得到浅黄色溶液，为NaOH储存液，保持在70°C下储存备用；
[0212] ⑵将FeS〇4 · 7H20、PEI与溶剂混合均匀后抽真空25min，之后填充Ar气保护；加热 升温至180°C，加入步骤一（1)所得的NaOH储存液，至溶液中NaOH的摩尔浓度为0.4mol/L，约 3min后溶液颜色变成黑色，然后升温至230°C，继续冷凝回流2h，反应结束，得到含有带正电 荷的MNC的反应液；
[0213] 待含有带正电荷的MNC的反应液冷却后，磁分离，移去反应液，将磁分离产物分散 于无水乙醇中超声洗涤，反复3次，磁分离，将磁分离产物分散于去离子水中，超声洗涤5次， 得到磁分离终产物，为丽C;将MNC溶解于无RNA酶的双蒸水中，得到MNC溶液，浓度为50yg/ mL〇
[0214] 其中，溶剂为DEG和EG的混合液，其中，EG与DEG的体积比为1:4;
[0215] PEI作为交联剂和稳定剂；
[0216] FeS04·7H20与PEI的质量比为128:60。
[0217] 步骤二、Μ的制备
[0218]将白细胞1774六.1细胞系置于37°(：，0)2浓度为5%的恒温培养箱中，用细胞培养完 全培养基培养28h，换入含有0.4mM的叠氮胆碱的细胞培养完全培养基中继续培养28h，收集 白细胞，弃掉培养基。
[0219] 将收集到的白细胞用pH 7.6的Hepes B缓冲液重新悬浮，加入lOyL/mL的蛋白酶抑 制剂，用勾衆机2档间歇破碎细胞:破碎2min，停lmin，重复10次，然后1000r/min离心3min， 收集上清，沉淀用加了 1 OyL/mL蛋白酶抑制剂的Hepes B缓冲液重新悬浮，用勾楽:机2档间歇 破碎细胞:破碎2min，停lmin，重复10次，然后1000r/min离心3min，收集上清，上清液同样悬 浮于含蛋白酶抑制剂的Hepes B缓冲液中，两次上清液混入最后一次的细胞破碎液，得到在 缓冲溶液中破碎后的白细胞碎片，采用蔗糖密度梯度离心进行分离提取，得到Μ，将Μ溶解于 ifepes C缓冲液，得到Μ溶液，浓度为20.33yg/mL。
[0220] 所述蔗糖密度梯度离心具体同实施例1。
[0221] 步骤三、M_M:siRNA的制备
[0222] (1)将平均粒径为81nm的MNC溶液中加入无 RNA酶双蒸水溶解的siGFP(GFP为绿色 荧光蛋白基因）中，siGFP与MNC的摩尔比为1:15;置于垂直混悬仪，在8°C下以20r/min垂直 混悬70min，磁分离，去除未吸附的siGFP，将磁分离后物质再悬浮于0.024g/mL无 RNA酶的 PEI水溶液中，置于垂直混悬仪，在0°C下以20r/min垂直混悬30min，磁分离得到带正电荷的 MNC: siGFP，溶解于无 RNA酶的双蒸水中，得到MNC: siGFP溶液，浓度为50yg/mL。
[0223] (2)将MNC: siGFP溶液、Μ溶液和Hepes C缓冲液混合，置于垂直混悬仪，在8 °C下以 20r/min垂直混悬15h，磁分离收集得到表面包裹Μ的MNC: siGFP，即M-MNC: siGFP，为本发明 所述的一种装载siRNA的仿生型磁小体。
[0224] 对M-MNC: s iGFP进行生物修饰，修饰方法如下：
[0225] (1)同实施例1生物修饰方法步骤(1);
[0226] (2)将M-MNC: siGFP溶解于无 RNA酶的双蒸水得到浓度为50yg/mL M-MNC: siGFP溶 液，与DB⑶-PEG-Mal-R⑶溶液混合，其中M-MNC: siGFP与DB⑶-PEG-Mal-RGD的摩尔比为1: 15，置于垂直混悬仪，在8°C下以20r/min垂直混悬3h，磁分离，得到DB⑶-PEG-Mal-RGD-M-丽C: siGFP(可简写为R-M-MNC: siGFP)，为经过生物修饰后的一种装载siRNA的仿生型磁小 体。
[0227] 测试表征实验：
[0228] 测试表征实验方法1~4以及51同实施例1，测试样品为实施3制得，测试结果与实 施例1测试结果相似。
[0229] 5.对制备得到的M-MNC: siGFP的抑瘤能力进行测试表征实验如下：
[0230] Π 、检测人乳腺癌细胞(MB-MDA-231)对仿生磁小体的吞噬效果。
[0231] 将人乳腺癌细胞(MB-MDA-231)细胞系置于37°C，C02浓度为5%的恒温培养箱中， 用细胞培养完全培养基培养24h，得到细胞培养液，将实施例3得到的MNC: siGFP，M-MNC: siGFP和R-M-MNC: siGFP分别加入细胞培养液中，其中R-M-MNC: siGFP组分成两份加入细胞 培养液，分别为加磁组(R-M-MNC: siGFP(m+))及不加磁组(R-M-MNC: siGFP)，四组样品在MB-MDA-231培养体系中继续培养24h，移出细胞培养液，加入PBS。
[0232] 在激光共聚焦显微镜下观察，结果如图18所示，绿色代表细胞，紫色为细胞内吞的 各样品；MB-MDA-231 细胞吞噬R-M-MNC: siGFP(m+)组及R-M-MNC: siGFP组较多，多于MNC: s ihTERT 及 M-MNC: s ihTERT 组。
[0233] ΙΠ 、抑制肿瘤细胞能力实验
[0234] 人乳腺癌细胞(MB-MDA-231)细胞系置于37°C，C02浓度为5%的恒温培养箱中，用 细胞培养完全培养基培养2411。将8丨6??、实施例3得到的1叱：8丨6??，1-丽(：：8丨6??和1?-1-丽C: siGFP分别加入细胞培养液中，其中R-M-MNC: siGFP组分成两份加入细胞培养液，分别 为加磁组(R-M-MNC: siGFP(m+))及不加磁组(R-M-MNC: siGFP)，五组样品在MB-MDA-231培养 体系中继续培养24h，在激光共聚焦显微镜下观察，结果如图19所示。R-M-MNC: siGFP组与R-M-MNC:siGFP(m+)，沉默绿色荧光蛋白后，表现为细胞中的绿色较少，相比较于siGFP，MNC: s iGFP和M-MNC: s iGFP沉默GFP基因效果更好，可见R-M-MNC: s iGFP (m+)有更好的沉默肿瘤 siGFP基因的效果。
【主权项】
1. 一种装载siRNA的仿生型磁小体，其特征在于:所述仿生型磁小体以水溶性Fe3〇4纳米 团簇为核，其外包覆白细胞膜，在所述Fe 3〇4纳米团簇与白细胞膜之间装载有siRNA;所述 Fe3〇4纳米团簇由Fe3〇4纳米单晶和聚乙稀亚胺组成，带正电荷，粒径为30nm~196nm。2. 根据权利要求1所述的一种装载s i RNA的仿生型磁小体，其特征在于:所述Fe3〇4纳米 团簇的粒径为81nm;白细胞膜为白细胞系J774A. 1的细胞膜。3. -种偶联抗体或肽的装载siRNA的仿生型磁小体，其特征在于:在实施例1或2所述的 装载siRNA的仿生型磁小体的白细胞膜外共价偶联有具有修饰基团的抗体或肽； 所述抗体为Fc端具有赖氨酸残基的抗体； 所述肽为具有氨基的靶向肽、融合肽和穿膜肽中的一种以上； 所述修饰基团为DBC〇-PEGn-NHS，n = 1~2000; 所述修饰基团通过环炔化修饰与抗体或肽上的氨基偶联。4. 根据权利要求5所述的一种偶联抗体或肽的装载siRNA的仿生型磁小体，其特征在 于:n = 4〇5. -种如权利要求1或2所述的装载siRNA的仿生型磁小体的制备方法，其特征在于:步 骤如下： 步骤一、Fe3〇4纳米团簇，即MNC的制备 (1) 在无氧环境下，将NaOH完全溶解到DEG中，制备得到NaOH储存液； (2) 将铁源、PEI与溶剂混合均匀后抽真空5min~30min，填充氩气保护，加热至100°C~ 180 °C，加入NaOH储存液，至溶液中NaOH的浓度为0.03mo 1/L~0.4mo 1 /L，待溶液颜色变黑后 加热至190°C~230°C，继续冷凝回流30min~2h，得到MNC反应液； 待MNC反应液冷却后，磁分离，移去反应液，将磁分离产物超声洗涤，再磁分离，移去反 应液，得到磁分离终产物为MNC;将MNC悬浮于无RNA酶的双蒸水中得到MNC溶液； 所述溶剂为DEG，或DEG和EG的混合液，混合液中EG与DEG的体积比为1:14~1:4; 所述铁源为含有Fe2+，常温下稳定、能够在所述溶剂中溶解且不发生反应的物质； 铁源与PEI的质量比为1:60~128:60; 步骤二、修饰有叠氮胆碱的白细胞膜碎片，即M的制备 将白细胞在细胞培养完全培养基中培养20h~28h，换入含有0.1 mM~0.4mM叠氮胆碱的 细胞培养完全培养基中培养22h~28h，收集白细胞，重新悬浮于缓冲溶液中，用匀浆机对所 述白细胞进行间歇破碎，采用蔗糖密度梯度离心对间歇破碎后的白细胞碎片分离提取，得 到M;将M溶解与H印es C缓冲液中，得到M溶液； 步骤三、装载siRNA的仿生型磁小体，即M-M: siRNA的制备 (1) 将MNC溶液与siRNA混合，在4°C~8°C下垂直混悬5min~70min，磁分离，将磁分离后 物质再悬浮于无RNA酶的PEI水溶液中，在0°C~8°C下垂直混悬20min~60min，磁分离得到 MNC: siRNA;MNC: siRNA溶于无RNA酶的双蒸水中，得到MNC: siRNA溶液； siRNA与MNC的摩尔比为1:5~1:15; (2) 将MNC: siRNA溶液、M溶液和缓冲液混合，在0 °C~8 °C下垂直混悬6h~15h，磁分离收 集得到M-MNC: s iRNA，为所述一种装载s iRNA的仿生型磁小体。6. 根据权利要求5所述的一种装载s i RN A的仿生型磁小体的制备方法，其特征在于：步 骤一中： (1) 无氧环境通过采用惰性气体脱氧处理和保护实现； 加热至100 °C~150 °C使NaOH完全溶解到DEG中，NaOH完全溶解时停止加热； (2) DEG和EG混合液中EG与DEG的体积比为2:13; 铁源为FeS〇4 ? 7H20或FeCh ? 4H20; 混合均勾后抽真空25min; 加热至160°C，再加入NaOH储存液； 加热至220°C继续冷凝回流lh; 将磁分离产物先分散于无水乙醇中超声洗涤，再分散于去离子水中超声洗涤； 步骤二中： 白细胞为J774A.1细胞系； 在37 °C，C02浓度为5 %的恒温培养箱中培养； 在细胞培养完全培养基中培养24h; 换入含有N3的细胞培养完全培养基中培养24h; 细胞培养完全培养基为内含1 〇 %体积分数胎牛血清，60yg/mL青霉素和100yg/mL链霉 素的DMEM完全培养基； 含有N3的细胞培养完全培养基中含有0.1 mM的N3; 用丨KA?Dispersers and Shakers勾衆机2档对白细胞进行间歇破碎； 步骤三中： (1) siRNA与MNC的摩尔比为1:15; siRNA溶于无RNA酶的双蒸水中，得到siRNA溶液与MNC溶液混合； 加入siRNA，在4°C下垂直混悬60min; 无RNA酶的PE I水溶液的浓度为0.024g/mL; 将磁分离后物质再悬浮于无RNA酶的PEI水溶液中，在4°C下垂直混悬30min; (2) 置于垂直混悬仪上在4 °C下垂直混悬8h。7. 根据权利要求6所述的一种装载s i RN A的仿生型磁小体的制备方法，其特征在于：步 骤一中： (1) 将DEG在惰性气体的环境下做脱氧处理，待氧气清除完全后，将NaOH溶解到DEG中， 同时加热，升温至120°C，直到NaOH完全溶解时停止加热，所述制备过程全程都需惰性气体 保护，得到NaOH储存液； (2) 在无水乙醇中反复超声洗涤3次，在去离子水中反复超声洗涤5次； 步骤三中： (2)以20r/min的转速进行垂直混悬。8. -种如权利要求3或4所述的偶联抗体或肽的装载siRNA的仿生型磁小体的制备方 法，其特征在于:步骤如下： (1) 将修饰基团水溶液与抗体或肽水溶液混合得到混合液，在室温下垂直混悬8h~ 12h，除去未反应的修饰基团、抗体或肽小分子，制备得到带有环炔化修饰基团的抗体或肽 的溶液， 修饰基团与抗体或肽的摩尔比为1:5; (2) 将如权利要求1或2所述的M-MNC: siRNA溶于无RNA酶的双蒸水中得到M-MNC: siRNA 溶液，和带有环炔化修饰基团的抗体或肽的溶液混合，在0 °C~8 °C下垂直混悬lh~3h，磁分 离，得到偶联抗体或肽的装载siRNA的仿生型磁小体， M-MNC:siRNA与带有环炔化修饰基团的抗体或肽的摩尔比为1:10。9. 根据权利要求8所述的一种偶联抗体或肽的装载siRNA的仿生型磁小体的制备方法， 其特征在于:步骤如下： (1) 置于垂直混悬仪上以20r/min的转速进行垂直混悬10h; 未反应的修饰基团、抗体或肽小分子采用透析或超滤的方法除去； (2) M-MNC:siRNA与带有环炔化修饰基团的抗体或肽的摩尔比为1:10; 在4 °C下置于垂直混悬仪上以20r/min的转速垂直混悬lh。10. 根据权利要求8所述的一种偶联抗体或肽的装载siRNA的仿生型磁小体的制备方 法，其特征在于： (1 )DBC〇-PEG-Mal水溶液与R⑶水溶液混合，在室温下垂直混悬8h~12h，除去未反应的 DBCO-PEG-Mal 及 RGD，得到 DBCO-PEG-Mal-R ⑶溶液； (2)将M-MNC: siRNA溶于无RNA酶的双蒸水中得到M-MNC: siRNA溶液，与DB⑶-PEG-Ma 1-R⑶溶液混合，在0 °C~8 °C下垂直混悬lh~3h，磁分离，得到偶联抗体或肽的装载siRNA的仿 生型磁小体。
【文档编号】A61P35/00GK106039324SQ201610547657
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月12日
【发明人】谢海燕, 张帆, 马光辉, 魏炜, 赵龙剑
【申请人】北京理工大学, 中国科学院过程工程研究所