mir-1299及其成熟miRNA的新用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体的涉及mir-1299及其成熟miRNA的新用途，更具 体的涉及mir-1299及其成熟miRNA的新用途在诊治骨肉瘤转移中的新用途。
【背景技术】
[0002] miRNA是一种内源性非编码小分子，通过特异性结合靶基因来调控基因的表达。其 调控的主要方式有两种：一种是与靶基因 mRNA的3'UTR不完全互补配对，阻断靶基因的翻 译，从而调苄基因表达；另一种是与siRNA类似，当miRNA与mRNA完全互补配对时，Ago2蛋白 通过切割mRNA直接导致其降解，实现基因沉默。总之，当前认为miRNA以何种方式与目的基 因作用和miRNA与目的基因的配对程度有关。miRNA与目的基因配对不完全时，miRNA就以抑 制目的基因的表达发挥作用;miRNA与目的基因某段序列配对完全时，就可能引起目的基因 在互补区断裂而导致基因沉默。另外，miRNAs有时候也导致组氨酸修饰和启动子区的DNA甲 基化，从而影响靶基因的表达。研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防 御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等，具有重要的基因表达调控作用。
[0003] 骨肉瘤(osteosarcoma，0SA)是常见的恶性骨肿瘤，由恶性增殖的肉瘤细胞直接产 生肿瘤性骨样组织或不成熟骨，其组织学特点是增生的梭形肿瘤细胞直接产生骨样基质或 不成熟骨，几乎所有骨肉瘤转移均经血液转移至肺，少数转移至脑、肾等内脏器官及经淋巴 结转移。骨肉瘤的侵袭和转移严重影响患者的生活质量和预后。基因水平的治疗已经成为 广大学者的研究热点，但是目前仍缺少骨肉瘤诊断和治疗的有效靶标，进一步寻找分子生 物标记，将具有重要的理论和临床应用价值。同时如能获得骨肉瘤血清诊断标志物，将对骨 肉瘤的诊断和治疗带来深远的影响。
[0004] 本发明基于高通量测序方法，对5例转移性骨肉瘤患者及5名健康对照人群进行测 序，获得其miRNA和mRNA的表达数据，进而进行生物信息学分析，选取后备miRNA和mRNA进行 分子生物学验证及靶标验证，结果显示，本发明提供的miR-1299及其靶基因与骨肉瘤密切 相关，可用于骨肉瘤的临床诊断及预防检测，具有很好的实际应用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供mir-1299及其成熟miRNA在制备诊断和/或防治骨肉瘤试 剂中的应用。miR-1299的序列见序列表SEQ ID NO l，mir-1299序列见序列表SEQ ID N0 2。
[0006] 进一步，骨肉瘤为转移性骨肉瘤。优选的，诊断和/或防治骨肉瘤试剂为诊断和/或 防治骨肉瘤细胞侵袭和转移的试剂。
[0007] 进一步，诊断骨肉瘤试剂包括基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或 基于探针杂交方法检测骨肉瘤样本中mir-1299及其成熟miRNA的转录或基于免疫检测方法 检测骨肉瘤样本中mir-1299及其成熟miRNA调控的革E1基因的表达情况，优选采用northern 杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞 术检测骨肉瘤样本中mir-1299及其成熟miRNA的转录;采用ELISA和/或胶体金试纸条检测 骨肉瘤样本中mir-1299及其成熟miRNA调控的靶基因的表达情况。优选所述mir-1299及其 成熟miRNA调控的靶基因为C5AR1和/或ITPRIP。
[0008]优选的，基于定量PCR方法包括特异性扩增mir-1299及其成熟miRNA的引物，进一 步优选，特异性扩增miR-1299的引物序列为SEQ ID N0 3;基于探针杂交方法包括与mir-1299 及其成熟 miRNA 的核酸序列杂交的探针; 免疫检测方法包括与 mir-1299 及其成熟 miRNA 调控基因表达蛋白特异性结合的抗体，进一步优选与C5AR1和/或ITPRIP蛋白特异性结合的 抗体。
[0009] 进一步，防治骨肉瘤试剂包括上调mir-1299及其成熟miRNA的转录和/或促进mir-1299 及其成熟 miRNA 的活性的试剂。
[0010] 优选的，采用基于RNA的microRNA功能获得性技术和/或基因特异性miR Mimics技 术上调mir-1299及其成熟miRNA的转录和/或促进mir-1299及其成熟miRNA的活性。优选人 工合成miR-1299的短发夹RNA或通过调控启动子上调mir-1299及其成熟miRNA。
[0011] 本发明的目的在于提供mir-1299及其成熟miRNA的靶基因在制备诊断和/或防治 骨肉瘤制剂中的应用。优选的，靶基因为C5AR1或ITPRIP。更优选的，靶基因为ITPRIP。
[0012] 进一步的，骨肉瘤为转移性骨肉瘤。
[0013] 进一步，诊断骨肉瘤制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、免疫方法检测骨肉 瘤患者外周血中C5AR1和/或ITPRIP3基因的表达。优选的，所述的荧光定量PCR试剂盒中含 有特异性扩增C5AR1和/或ITPRIP基因的引物;所述的基因芯片中包括与C5AR1和/或ITPRIP 基因的核酸序列杂交的探针。更优选的，荧光定量PCR试剂盒内含有特异性检测C5AR1和/或 ITPRIP基因的上游引物和下游引物，扩增C5AR1的上游引物序列为SEQ ID N0 4,下游引物 序列为SEQ ID N0 5;扩增ITPRIP基因的上游引物序列为SEQ ID N0 6,下游引物序列为SEQ ID NO 7〇
[0014] 进一步，骨肉瘤的诊断制剂采用免疫方法检测骨肉瘤外周血中C5AR1和/或ITPRIP 基因的表达产物。优选的，免疫方法为ELISA检测和/或胶体金检测。进一步，检测C5AR1和/ 或ITPRIP蛋白的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。试剂盒中的抗体可采用市售的C5AR1和/ 或ITPRIP单克隆抗体或多克隆抗体。进一步，试剂盒包括:包被C5AR1和/或ITPRIP抗体的固 相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。
[0015] 进一步，检测C5AR1和/或ITPRIP蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，抗体可采用 市售的C5AR1和/或ITPRIP单克隆抗体或多克隆抗体。进一步，胶体金检测试剂盒采用胶体 金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步，胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区（T) 喷点有抗C5AR1和/或ITPRIP抗体、质控区（C)喷点有免疫球蛋白IgG。
[0016] 本发明的目的在于提供上述骨肉瘤诊断制剂在制备骨肉瘤诊断工具中的应用。
[0017] 本发明的目的在于提供一种防治骨肉瘤的制剂，制剂中含有抑制C5AR1和/或 ITPRIP基因的转录或表达的试剂或化合物。进一步的，C5AR1和/或ITPRIP基因、基因的表达 产物在骨肉瘤转移组中高表达。
[0018] 本领域人员熟知抑制基因及其表达产物的表达通常可以采用下述方法中的一种 和/或几种:激活该基因的抑制基因、加入抑制该基因的蛋白、加入抑制该基因的化学品（如 siRNA等）、加入促进蛋白降解或阻断蛋白成熟的分子、去除激活该基因的蛋白等。
[0019] 本发明的目的在于提供一种防治骨肉瘤试剂，所述试剂包含：
[0020] (a)上调mir-1299及其成熟miRNA的转录和/或促进mir-1299及其成熟miRNA的活 性的试剂；
[0021] (b)药剂学上能接受的载体。
[0022] 优选的，采用基于RNA的microRNA功能获得性技术和/或基因特异性miR Mimics技 术上调mir-1299及其成熟miRNA的转录和/或促进mir-1299及其成熟miRNA的活性。优选人 工合成miR-1299的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)或通过调控启动子上调mir-1299及其成熟miRNA的表达。
[0023] 进一步的，所述骨肉瘤为转移性骨肉瘤。
[0024]本发明的目的在于提供一种骨肉瘤诊断试剂，骨肉瘤诊断试剂能够检测骨肉瘤样 本中mir-1299及其成熟miRNA的转录或免疫检测方法检测骨肉瘤样本中mir-1299及其成熟 miRNA调控的靶基因的表达情况。
[0025] 进一步，骨肉瘤诊断试剂基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于 探针杂交方法检测骨肉瘤样本中mir-1299及其成熟miRNA的转录或基于免疫方法检测骨肉 瘤样本中mir-1299及其成熟miRNA调控的革E1基因的表达情况，优选采用northern杂交方法、 miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测骨肉 瘤样本中-^299及其成熟miRNA的转录;采用ELISA和/或胶体金试纸条检测骨肉瘤样本 中mir-1299及其成熟miRNA调控的靶基因的表达情况。优选所述mir-1299及其成熟miRNA调 控的靶基因为C5AR1和/或ITPRIP，ELISA和/或胶体金试纸条中含有与C5AR1和/或ITPRIP蛋 白特异性结合的抗体。
[0026] 本发明的目的在于提供上述防治骨肉瘤的制剂在制备骨肉瘤治疗药物或试剂中 的应用。
[0027]定义：
[0028] 现阶段检测miRNA的表达水平的方法主要包括基于高通量测序技术、基于核苷酸 杂交和基于PCR的miRNA检测方法。基于探针杂交技术的miRNA检测方法是一种直接检测法， 不需要对样本RNA进行预扩增，包括northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技 术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术等技术。
[0029] (1 )Northern 杂交
[0030]又称RNA印迹技术为最经典的检测真核生物RNA大小，估计其丰度的实验方法。基 本原理如下：首先在载体(如娃片、微球或膜等)上固定miRNA样本，再与经过标记的探针杂 交，洗涤多余的杂交探针后进行信号检测；也可以在载体上先固定与靶mi