一种金线莲茎腐病菌分子检测引物及其检测方法与流程

本发明涉及一种金线莲茎腐病菌分子检测引物及其检测方法，专用于金线莲茎腐病菌高灵敏度快速分子检测，克服了传统的培养鉴定方法繁杂且准确性低的缺点，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术的领域。

背景技术：

金线莲又称金线兰，兰科开唇兰等，属多年生草本植物，珍稀民间中草药，素有“药王”“金草”“神药”等美称，具有清热退火、滋养强壮、润肺保肝及消肿解毒等功效，已广泛应用于高血压、糖尿病、肾病、肿瘤等的治疗和保健等方面。野生金线莲对生长环境要求苛刻，繁殖率低，生长缓慢，且由于其独有的营养价值和药用价值，致使人工过度采挖，已面临灭绝的境地。目前金线莲主要通过人工栽培，但在栽培过程中病害问题也日渐突显。

最近，在福建省多个金线莲种植地出现了茎腐病病样，该病对金线莲不同生长期皆可造成危害，发病时植株茎基部先出现黄褐色水渍状病斑，病斑扩大至绕茎周，病部组织腐烂干枯缢缩呈线状。该病蔓延迅速，病情越来越严重，幼苗迅速倒伏死亡，出现大面积猝倒，严重威胁金线莲的健康生产。通过对病样采集、病菌分离鉴定，柯赫氏法则验证，最终确定金线莲茎腐病的病原菌为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。

目前对金线莲茎腐病的鉴定大多仍沿用传统培养方法。传统的病原菌鉴定技术是在分离培养获得相应病原物的基础上，通过形态学观察和柯赫氏法则来判断病原物的种类。整个过程常常需要耗费大量的劳动力和时间，一般需要几天才能完成，而且要求操作者具备专业的病原菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验，因此以病原菌形态学特征为判断基础的传统病原菌诊断方法，因其耗时长，效率低，难以满足对金线莲茎腐病诊断的实际需要，因其很容易错过病害防治的最佳时期。

近年来随着分子生物学技术的发展，以PCR技术为代表的分子检测方法得到了迅速的发展和应用，尤其是聚合酶链式反应(PCR)技术的应用在很大程度上弥补了传统方法的不足。这类方法普遍具有快速、准确、灵敏且不需要进行病原菌分离培养的特点，在控制植物病害的传播、成灾中已经开始发挥重要作用。因此，建立一套快速、灵敏、准确的金线莲茎腐病菌检测诊断技术不仅非常必要，而且十分迫切。

核糖体转录间隔区ITS序列是由交替的保守区和可变区组成，在微生物基因组中以多拷贝出现，具有种的特异性，因此该序列成为在种的水平鉴定病原菌极好的目标。为此，我们利用真菌通用引物ITS1/ITS4扩增金线莲茎腐病菌的转录间隔区并进行克隆测序，通过序列比对，设计出一对金线莲茎腐病菌特异性引物，建立金线莲茎腐病菌快速、简便、特异性强、灵敏度高的监测技术体系。此技术可应用于金线莲茎腐病菌引起病害显症之前的早期监测，对于确定病害防治最佳时期具有重要的作用，为防治策略的制定提供科学依据。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中金线莲茎腐病菌传统检测方法对操作者的实验技能和实际经验有很高的要求，且十分耗时，无法达到快速检验的问题，提供金线莲茎腐病菌的特异分子检测引物以及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的金线莲茎腐病菌的快速分子检测体系和程序。该方法可用于金线莲茎腐病菌引起病害显症之前的早期监测，对确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

1．根据金线莲茎腐病菌核糖体转录间隔区ITS序列由交替的保守区和可变区组成的特点，设计了对金线莲茎腐病菌具有特异扩增作用的一对PCR引物，序列如下：

ITS403f：5’-CCCAACCCCTGTGACATAC-3’；

ITS403r：5’-ATTACCAGTAACGAGGGTT-3’。

2． 金线莲茎腐病菌快速检测体系的建立

（1）金线莲茎腐病菌特异PCR快速检测体系的建立

所述PCR反应体系25.0 μl，包括2×Taq PCR Master Mix12.5μL，10 μmol/L 的引物(ITS403f / ITS403r)各0.5 μL， DNA模板25ng，不足部分由dd H₂O补足。PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性1min，58℃退火30sec ，72℃延伸1min，共25个循环；72 ℃延伸10 min。

（2）金线莲茎腐病菌巢式PCR快速检测体系的建立

以真菌通用引物（ITS1/ ITS4）进行第一轮PCR扩增，反应体系25.0 μL，包括2×TaqPCR Master Mix12.5μL，10 μmol/L的引物（（ITS1/ ITS4）各0.2 μL， DNA模板25ng，不足部分由dd H₂O补足。PCR反应条件为: 94℃预变性3min，94℃变性1min，55℃退火30 sec ，72℃延伸1min，共30个循环，72 ℃延伸10 min。

分别取1 μL第一轮PCR产物做为DNA模板，用引物(ITS403f / ITS403r)进行第二轮PCR扩增。反应体系25.0 μl，包括2×Taq PCR Master Mix12.5μL，10 μmol/L 的引物(ITS403f / ITS403r)各0.5 μL，25ng DNA模板1 μL，不足部分由dd H₂O补足。PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性1min，58℃退火30sec ，72℃延伸1min，共25个循环；72 ℃延伸10 min。

本发明的关键性技术是金线莲茎腐病菌的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法。为了检测金线莲茎腐病菌特异引物准确性，本发明以我国福建、浙江、江西、台湾等省的18株金线莲茎腐病菌和其它25种真菌为供试材料，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA，具体方法如下：

取50mg 冷冻干燥后的菌丝粉于1.5ml离心管中，加入900µl 2% CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液（2% CTAB；100 m mol/L Tris-HCl, PH 8.0；20mmol/L EDTA,pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90μl 10% SDS（十二烷基苯磺酸钠）后振荡混匀，于55～60℃水浴1.5 h，每10 min颠倒混匀一次,水浴1.5h后离心（12,000rpm）8min，取上清液加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（体积比25:24:1），颠倒使充分混匀，12,000rpm离心12 min，取上清液（水相），加入等体积氯仿/异戊醇(体积比24:1)，颠倒使充分混匀，12,000rpm离心5min，吸上清，加0.1体积的3mol/L NaAC溶液和2倍体积的冰无水乙醇, 置-20℃冰箱中沉淀30 min以上，12,000rpm离心5 min，轻轻地倒去上清液，加入700µl冰70%乙醇进行洗涤（稍离心，倾掉上清），在超净工作台上自然晾干无酒精味后用1×TE（10mmol/LTris-HCL,0.1mmol/LEDTA,pH8.0）溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至25ng/μL待用。

经对供试25种真菌和18株金线莲茎腐病菌的特异性进行PCR验证。PCR反应体系25.0μL，包括2×Taq PCR Master Mix12.5μL，10 μmol/L 的引物(ITS403f / ITS403r)各0.5 μL， DNA模板25ng，不足部分由dd H₂O补足。PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性1min，58℃退火30sec ，72℃延伸1min，共25个循环；72 ℃延伸10 min。此特异引物在金线莲茎腐病菌中特异性地扩增出403bp的产物。这说明该引物可被用于发病植株中金线莲茎腐病菌快速可靠的检测和鉴定。

本发明有益效果：本发明方法适用于植株中金线莲茎腐病菌的快速可靠的检测和鉴定，对于农业生产中金线莲茎腐病菌引起的病害防治具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

1、特异性强：本发明检测方法是根据ITS序列由交替的保守区和可变区组成的特点，设计了一对金线莲茎腐病菌特异引物进行检测。已经对来自我国福建、浙江、江西、台湾等省的金线莲茎腐病菌和其它25种不同真菌进行验证，结果具有很强的特异性。

2、灵敏度高：巢式PCR对金线莲茎腐病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10fg/25 μL，具有很高的灵敏性。

3、实用性好：本发明所设计一对特异性引物，可用于金线莲茎腐病菌的高灵敏度快速检测，因此本方法的实用性强，可满足金线莲茎腐病菌进行快速可靠的检测和鉴定的需要。

4、操作简便快速：应用本发明方法，对带金线莲茎腐病菌的植株进行病菌DNA提取、PCR扩增和常规的琼脂糖凝胶电泳后即可判定结果，无需对扩增产物进行限制性内切酶酶切，整个检测过程可在数小时内完成。

附图说明

图1为本发明所要检测的金线莲茎腐病菌的特异PCR扩增图

图中：M为DL2000 DNA Marker；1为阴性对照；2-5为尖孢镰刀菌；6：黄色镰刀菌；7：燕麦镰刀菌；8：雪腐镰刀菌；9：禾谷镰刀菌；10：炭疽病菌。

图2为本发明金线莲茎腐病菌的灵敏性检测扩增结果图

图中：M为DL2000 DNA Marker ；1为阴性对照；2-9分别为1 ng/µL，

100pg/μL，10 pg/μL，1 pg/μL，100 fg/μL，10 fg/μL，1 fg/μL，100 ag/μL的不同浓度金线莲茎腐病菌DNA。

具体实施方式

本发明的技术内容包括金线莲茎腐病菌的特异检测引物，所设计的引物及其序列为（ITS403f：5’-CCCAACCCCTGTGACATAC-3’和ITS403r：5’-ATTACCAGTAACGAGGGTT-3’）。利用该引物可从金线莲茎腐病菌中特异扩增出403bp的产物。

实施例1：引物对金线莲茎腐病菌的特异性扩增

1．金线莲茎腐病菌的特异检测

PCR反应体系25.0 μl，包括2×Taq PCR Master Mix12.5μL，10 μmol/L 的引物(ITS403f / ITS403r)各0.5 μL， DNA模板25ng，不足部分由dd H₂O补足。PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性1min，58℃退火30sec ，72℃延伸1min，共25个循环；72 ℃延伸10 min。

2．检测结果

检测的特异性：除了来自我国福建、浙江、江西、台湾等省等省的金线莲茎腐病菌DNA可特异地扩增出403bp的产物外，检测了25种其他真菌DNA均未能扩增出任何产物，具有很强的特异性。

实施例2：引物对金线莲茎腐病菌的灵敏度检测

1．DNA浓度稀释：提取的金线莲茎腐病菌基因组DNA，经分光光度计测定浓度后，采用系列浓度稀释。

2．金线莲茎腐病菌的灵敏度检测

采用10倍浓度系列稀释法将提取的金线莲茎腐病菌DNA依次稀释成，1 ng/µL，100 pg/μL，10 pg/μL，1 pg/μL，100 fg/μL，10 fg/μL，1 fg/μL，100 ag/μL共8个不同浓度梯度，采用巢式PCR对引物的灵敏度进行测定。

分别取1μL不同浓度的金线莲茎腐病菌基因组DNA为模板，以真菌通用引物（ITS1/ITS4）进行第一轮PCR扩增，反应体系25.0 μL，包括2×Taq PCR Master Mix12.5μL，10 μmol/L 的引物（（ITS1/ ITS4）各0.2 μL， DNA模板25ng，不足部分由dd H₂O补足。

PCR反应条件为: 94℃预变性3min，94℃变性1min，55℃退火30 sec ，72℃延伸1min，共30个循环，72 ℃延伸10 min。分别取1 μL第一轮PCR产物做为DNA模板，用引物(ITS403f / ITS403r)进行第二轮PCR扩增。反应体系25.0 μl，包括2×Taq PCR Master Mix12.5μL，10 μmol/L 的引物(ITS403f / ITS403r)各0.5 μL， DNA模板25ng，不足部分由dd H₂O补足。PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性1min，58℃退火30sec ，72℃延伸1min，共25个循环；72 ℃延伸10 min。

3．检测结果：

在25.0μL反应体系中，金线莲茎腐病菌基因组DNA可获得明显扩增条带，检测灵敏度可达10 fg/25μL。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 一种金线莲茎腐病菌分子检测引物及其检测方法

<130> 2

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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attaccagta acgagggtt 19