哈蟆油真伪鉴别的方法及专用引物与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种哈蟆油真伪鉴别的方法及专用引物。

背景技术：

哈蟆油(Ranae oviductus)为蛙科动物中国林蛙(Rana temporaria chensinensis David)雌蛙的输卵管，经采制干燥而得。具有补肾益精，养阴润肺的功效，用于病后体弱，神疲乏力，心悸失眠，盗汗，痨嗽咳血。是一种集食用药用于一身的名贵中药材。由于多方面原因导致哈蟆油严重的供不应求，致使伪品充斥于市。目前市场上的伪品哈蟆油主要有黑龙江林蛙油、青蛙油、蟾蜍油、牛蛙油4类，其它伪品类型少见。2015年版《中国药典》规定哈蟆油的鉴别方法为性状鉴定、高效液相色谱法鉴定及膨胀度测定法，但这些方法易受人为因素、环境条件或药材本身的限制，实践中哈蟆油的鉴定仍感到十分困难。

随着分子生药学的发展，分子鉴定技术在哈蟆油药材的鉴别中得到不断的应用，很大程度上弥补了传统鉴别方法的不足。但是，已建立的哈蟆油分子鉴别方法，从模板的提取、PCR反应到最终结果分析，单个样品的鉴定步骤繁琐，耗时长，且需要电泳检测或序列分析比对，不利于现场快速鉴别的使用。

随着分子生物学的发展，分子鉴定技术已成为中药材传统鉴别方法的有益补充。有关哈蟆油的PCR鉴别方法已有报道，但是由于哈蟆油药材本身遇水膨胀，给哈蟆油的DNA提取带来极大的困难，提取过程复杂，成功率低，制约了该方法的深入应用。

快速PCR在保证PCR反应特异性和准确性的前提下，通过缩短反应时间来达到快速检测目的，尤其是和荧光检测技术相结合，进一步提高了检测效率，有望实现中药材的现场、快速检测。快速PCR技术和产物荧光检测的实现，对引物设计有严格的要求。为达到快速扩增的目的，设计引物时上下游引物距SNP位点尽可能近，PCR产物应尽可能短；引物Tm值与延伸温度接近，以减少PCR反应的升降温温差。为达到使用荧光检测的目的，引物设计应避免引物二聚体对检测结果的影响，这就要求引物质量要好，扩增过程中无引物二聚体的产生；使用的酶质量要好，能有效抑制引物二聚体的形成；有些情况下引物二聚体是不可避免的，可以通过调整酶、引物用量、加入PCR增强剂等方法，减少其对荧光检测结果的影响。

近年来，快速PCR方法已成功用于金银花，蛇类，太子参，人参、西洋参等中药材的真伪鉴别。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供用于哈蟆油真伪鉴别的引物对。

本发明提供的引物对，为能扩增出DNA片段A的引物对；

所述DNA片段A是以哈蟆油为模板，用序列1和序列2所示引物对进行扩增得到的产物。

上述引物对中，所述DNA片段A的核苷酸序列为序列5；

或，所述引物对由引物1和引物2组成；

所述引物1为如下1)或2)：

1)为序列1所示的单链DNA分子；

2)为序列1删除和/或增加和/或改变一个或几个核苷酸得到的单链DNA分子；

所述引物2为如下3)或4)：

3)为序列2所示的单链DNA分子；

4)为序列2删除和/或增加和/或改变一个或几个核苷酸得到的单链DNA分子。

本发明第二个目的是提供一种用于鉴定或辅助哈蟆油的PCR试剂。

上述PCR试剂中，包括上述的引物对、DNA聚合酶和dNTP。

上述PCR试剂中，

所述引物对中每条引物在所述PCR试剂中的浓度均为2nmol/l；

和/或，各个dNTP在所述PCR试剂中的浓度具体为2.5nmol/l；

和/或，所述DNA聚合酶具体为SpeedStar HS Taq DNA聚合酶或Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶。

本发明第三个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定哈蟆油的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，，包括上述的引物或上述的PCR试剂。

上述DNA片段A也是本发明保护的范围。

上述的引物或上述的PCR试剂或上述的试剂盒或上述的DNA片段A在如下(A1)-(A5)中任一种中的应用也是本发明保护的范围：

(A1)鉴定或辅助鉴定哈蟆油；

(A2)鉴别或辅助鉴别哈蟆油；

(A3)鉴别或辅助鉴别哈蟆油及其伪品；

(A4)鉴定或辅助鉴定待测样品是否为哈蟆油；

(A5)鉴定或辅助鉴定待测样品是哈蟆油还是其伪品。

本发明第四个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品是否为哈蟆油的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：检测待测样品中是否含有权利要求6所述的DNA片段A；如果含有，则待测样品为或候选为哈蟆油；如果不含有，则待测样品不为或候选不为哈蟆油。

上述方法中，

所述检测待测样品中是否含有DNA片段A的方法包括如下步骤：

1)用上述的引物对待测样品进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

2)用如下a或b检测所述PCR扩增产物：

a、向所述PCR扩增产物中加入DNA荧光染料，紫外检测，若PCR扩增产物有荧光，则待测样品含有所述DNA片段A，若PCR扩增产物无荧光，则待测样品不含有所述DNA片段A；

b、检测所述PCR扩增产物大小，若大小为520-530bp，则所述待测样品含有所述DNA片段A，若大小不为520-530bp，则所述待测样品不含有所述DNA片段A。

上述方法中，所述PCR扩增的模板为待测样品的基因组DNA；

所述PCR扩增条件为90℃3s，62℃20s，32个循环。

所述DNA片段A的核苷酸序列为序列表中序列5。

所述引物1和所述引物2的摩尔比为1:1。

所述PCR试剂由上述的引物对、DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液和水组成。

所述伪品具体为黑龙江林蛙油、黑斑蛙油、蟾蜍油和/或牛蛙油。

本项研究基于快速PCR方法对哈蟆油及其常见混伪品(黑龙江林蛙油、黑斑蛙油、蟾蜍油、牛蛙油)进行鉴别研究，有效的提高哈蟆油鉴别反应效率，为哈蟆油药材的鉴别提供更加符合实际需要、简便快捷的方法。

上述待测样品通过碱裂解法获得DNA，整个提取过程仅需5min即可完成，为后续快速PCR方法的建立奠定了基础。

本研究通过对位点特异性PCR进行条件优化，实现了在40min内简单、快速、直观的鉴别哈蟆油及其常见混伪品的目的，有助于实现哈蟆油药材现场、准确、快速鉴定。本研究对哈蟆油常见的4种蛙类混伪品进行了鉴别研究，对于哈蟆油非蛙类的伪品如：鳕鱼精巢及琼脂蛋白胨、马铃薯加工品没有涉及，因此本研究所建立方法对于非蛙类伪品的适用性有待于进一步研究。

附图说明

图1为mcb398/mcb869通用引物扩增。

图2为引物筛选电泳图。

图3为样品验证图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中药材为收集不同产地中国林蛙10批、黑龙江林蛙4批、黑斑蛙4批、中华大蟾蜍4批，牛蛙2批、哈蟆油3批、牛蛙油1批。所有基原动物按传统加工方法分别制成哈蟆油、黑龙江林蛙油、黑斑蛙油、蟾蜍油、牛蛙油，另选取哈蟆油药材3批进行快速PCR方法研究。样品分别采自吉林、黑龙江、辽宁、内蒙古、山东、江苏、湖南、四川等地。经黑龙江中医药大学中药资源与开发教研室王振月教授鉴定，凭证标本保存于哈尔滨市食品药品检验检测中心，见表1。

表1 实验材料

下述实施例中部分仪器如下：S1000型梯度PCR仪(Bio-rad公司)；ETC811型PCR仪(东胜兴业科学仪器有限公司)；22R型高速冷冻微量离心机(Beckman公司)；ZH-2型漩涡震荡器(天津药典标准仪器厂)；MM400型球磨机(Retsch公司)；DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)；310型凝胶成像系统(UVP公司)，2000C型分光光度计(NanoDrop公司)。

下述实施例中部分试剂如下：琼脂糖(西班牙Biowestagarose)；Gelred购自Biotium公司；SpeedStar HS TaqDNA聚合酶、r Taq DNA聚合酶、DL 2000 DNAMarker购自TaKaRa公司；Transfast Taq DNA聚合酶购自Transgen公司，Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶购自Vazyme公司；SYBR Green Ⅰ购自Invitrogen公司；其他试剂均为国产分析纯。

实施例1、哈蟆油真伪鉴别引物的设计和方法的建立

一、基于Cytb序列的哈蟆油位点特异性鉴别引物设计

从GenBank中下载得到中国林蛙、黑龙江林蛙、黑斑蛙、中华大蟾蜍、牛蛙Cyt b序列。测序所得序列使用软件CodonCode Aligner校对拼接，去除引物区，将下载和测序获得序列使用BioEdit软件进行比对，筛选出哈蟆油特有的变异位点，根据变异位点使用Primer premier 5.0软件进行引物设计，在引物3′末端倒数第二位引入人为错配。设计出2对鉴别引物，别命名为155S-F/155S-R(扩增片段约为530bp，序列5)，698S-F/698S-R(扩增片段约为105bp)，序列见表2。引物由Invitrogen公司合成。

表2 引物及PCR反应条件

二、哈蟆油真伪鉴别方法的建立

1、基因组DNA提取及检测

称取10mg研磨好的表1所示的药材粉末，使用碱裂解法提取总DNA，采用10％的Chelex-100进行纯化，并用超微量分光光度计检测DNA的浓度及纯度。

将浓度稀释为20ng·μL^-1，于-20℃保存备用。选择通用引物mcb398和mcb869对哈蟆油及其混伪品样品进行扩增。引物序列及扩增程序见表2。

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统中观察并记录，并对PCR产物进行双向测序。

结果如图1所示，M:DL2000Marker；1-13：哈蟆油；14-17：黑龙江林蛙油；18-21：蟾蜍油；22-25：黑斑蛙油；26-27：牛蛙油；28：阴性对照；表明提取的DNA可以满足PCR反应的要求。

2、引物的优化

根据引物的Tm值及产物长度设置PCR反应的初始反应条件如下：

20μL PCR反应体系：2.0μL 10×buffer，1.6μL dNTPs(2.5mmol·L-1)，0.5μL上游及下游引物(10mmol·L-1)，0.1μL SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，1μL(约20ng)模板DNA，无菌双蒸水补足至20μL。PCR反应在S1000型PCR仪上进行，初始反应程序见表2。

上述上游及下游引物分别为155S-F/155S-R和698S-F/698S-R。

反应结束后取PCR反应产物6μL，加入2μL 6×Loading buffer混匀后于Gelred染色的1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察、成像。

结果如图2所示，A为698S-F/698S-R扩增电泳图，其中，左到右的泳道分别为M：Marker；1，2：哈蟆油；3：黑龙江林蛙油；4：黑斑蛙油；5：蟾蜍油；6：牛蛙油；B为155S-F/155S-R扩增电泳图，其中，左到右的泳道分别为M：Marker；1，2：哈蟆油；3：黑龙江林蛙油；4：黑斑蛙油；5：蟾蜍油；6：牛蛙油,可以看出，设计的2对位点特异性鉴别引物中，155S-F/155S-R的PCR扩增特异性较698S-S/698S-R引物好，故本研究选取155S-F/155S-R作为哈蟆油及其伪品的鉴别引物，具体方法如下：

用155S-F/155S-R扩增待测样本，若得到155S-F/155S-R对应的扩增产物，则待测样本为或候选为哈蟆油，若未得到该扩增产物，则为或候选为哈蟆油伪品。155S-F/155S-R对应的扩增产物大小为530bp，530bp扩增产物的核苷酸序列为序列5。

3、PCR反应体系及反应条件的优化

在位点特异性PCR引物设计中人为的引入了错配位点，因此要求严格的反应条件，兼顾快速PCR的扩增效率，本文采用两步法，30个循环进行PCR反应条件的优化。在此基础上依次对退火温度、循环数、变性温度、变性时间、退火时间、引物用量、dNTP用量、哈蟆油模板DNA用量进行考察。

20μL PCR反应体系：2.0μL 10×buffer(TaKaRa公司，RR070A)，1.6μL dNTPs，0.5μL 155S-F，0.5μL 155S-R，0.2μL DNA聚合酶，1μL(约20ng)模板DNA，无菌双蒸水补足至20μL。

上述Taq酶种类分别如下：rTaq DNA聚合酶，SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，Phanta Max Super-Fidel ity DNA聚合酶，Transfast Taq DNA聚合酶；

上述各条引物在反应体系中的终浓度分别为2、3、5pmol/L；

上述dDNP在反应体系中的终浓度分别为2.5nmol、4nmol/L。

上述模板DNA在反应体系中的终浓度分别为10—60ng；

上述PCR扩增采用不同PCR仪分别如下：S1000型PCR仪(Bio-rad公司)，ETC811型PCR仪(东胜兴业科学仪器有限公司)，

上述PCR扩增的反应程序如下：95，90，88，86℃变性5，3，1s；65，64，62，61，60℃退火20，18，16，10s；35，32，30，28个循环。

结果如下，①在退火温度60-64℃，哈蟆油扩增条带随温度的升高逐渐减弱，62℃时目的条带亮度较强，混伪品均未检出条带，荧光检测结果与电泳结果一致，故本研究选择62℃作为退火延伸温度。②当循环数≥30时，哈蟆油样品可以得到目的条带，但是循环数为30时，荧光检测结果不明显，兼顾扩增产量与反应时间，故本文选择32次循环。③当变性温度≥88℃时，可以得到目的条带，随着变性温度的降低，PCR成功率随着降低，但是88℃时条带弱，故选择90℃作为变性温度。④变性时间为3s时仍然可以进行有效扩增，故选择3s作为变性时间。⑤退火延伸时间对扩增成功率有着重要影响，退火时间超过18s时才能获得有效的扩增，此次选择20s为退火时间。⑥当引物用量在2-5nmol时，哈蟆油样品有目的条带，但是随着引物用量的提高，正品与混伪品的荧光检测结果区别越不显著，这可能是生成了引物二聚体，影响到荧光检测结果，故本文选择其用量为2nmol。⑦当dNTP用量为2.5nmol时，能够扩增出明显的条带，随着其用量的增加条带逐渐变弱，因此将其用量定为2.5nmol，引物和dNTP用量均不宜太高，这与学者报道相符。⑧当模板用量10—60ng时均只有哈蟆油样品扩增出单一的目的条带，荧光检测结果与电泳结果一致。

采用以上反应条件分别使用四种快速DNA聚合酶，其中SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶均能实现对哈蟆油的真伪鉴别，r Taq DNA聚合酶，Transfast Taq DNA聚合酶未能得到有效扩增。使用不同厂家型号的PCR仪对哈蟆油及同属近缘种样品进行快速PCR扩增，结果表明：S1000型PCR仪(Bio-rad公司)，ETC811型PCR仪(东胜兴业科学仪器有限公司)，电泳检测后均可获得样品的特异性目的条带，反应条件优化见表3。

表3 哈蟆油PCR反应条件优化

注：“+”表示条带亮；“±”表示条带暗；“－”表示无条带。

表中，1：哈蟆油；2：黑龙江林蛙油；3：黑斑蛙油；4：蟾蜍油；5：牛蛙油。HS Taq为SpeedStar HSTaq DNA聚合酶，Phanta为Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶，TransTaq为Transfast Taq DNA聚合酶，rTaq为TaKa Ra r Taq DNA聚合酶。S1000为Bio-rad公司PCR仪(完成时间为29min)，ETC811为东胜兴业科学仪器有限公司型PCR仪(完成时间为31min)。

综合以上优化结果，确定哈蟆油快速PCR鉴别方法中的最佳反应体系如下:

PCR反应体系为20μL：2.0μL 10×buffer，1.0μL dNTPs(2.5mmol·L-1)，0.2μL上游及下游引物(终浓度为2nmol)，0.1μL SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，1μL(约20ng)模板DNA，无菌双蒸水补足至20μL。

最佳PCR反应参数为90℃3s，62℃20s，32个循环。

实施例2、哈蟆油真伪鉴别引物的应用

提取表1的各个药材的基因组DNA作为模板，用上述实施例1中的二的3的最佳反应体系和最佳PCR反应参数进行扩增，得到PCR扩增产物。

检测PCR扩增产物，若得到155S-F/155S-R对应的扩增产物，则待测样本为或候选为哈蟆油，若未得到该扩增产物，则为或候选为哈蟆油伪品。

用如下两种方法检测PCR扩增产物：

1)向PCR扩增产物中加入2μL 100×SYBR GreenⅠ，并于365nm紫外波长下进行检测，出现绿色荧光为阳性扩增产物；可以看出，哈蟆油样品均显示出明亮绿色荧光，而伪品不发出荧光。

2)电泳检测上述PCR扩增产物。

155S-F/155S-R对应的扩增产物大小为530bp，进一步测序530bp扩增产物的核苷酸序列为序列5。

结果如图3所示，M：Marker；1-13：哈蟆油；14-17：黑龙江林蛙油；18-21：黑斑蛙油；22-25：蟾蜍油；26-28：牛蛙油29：阴性对照；哈蟆油正品均扩增出目的条带，混伪品均无条带。

序列表

<110> 中国中医科学院中药研究所

<120> 哈蟆油真伪鉴别的方法及专用引物

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

gatgtaaaca acggctgacc a 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

ggggataagg ttgataggg 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

gttcctccat caaacaggct ca 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

ggggtgtaac tacggggtcg 20

<210> 5

<211> 501

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

gggcttcgga tgttacaagc cgacagatct ttaaaggaaa agtaggggtg gaaggagact 60

ttgtctaggt tggaattaag ccctgtgggg ttggatgagc ccgtttggtg gagaaataag 120

aggtggatta tacttacagc tgcgatgatg aatgggagaa tgaagtggaa tgtaaagaat 180

cgggtaaggg tggcgttgtc tactgagaag ccccctcaga ttcattgaac taagtcaaag 240

ccgatgtaag gggcggctga gaggaggtta gtaattactg tagcgcctca gaaggacatt 300

tgacctcatg gtaagacata gcccacaaaa gctgtggcta tcactaagaa taggaggatt 360

acaccaatgt ttcacgtttc tttatagagg taggagccgt agtaaaggcc tcgtccgatg 420

tggaagtaaa tgcagatgaa gaagaatgac gcaccgttgg cgtggaggtt gcgaagaggt 480

cagccgtggt tttacatcaa t 501