Glp-1类似物的纯化方法
【专利说明】GLP-1类似物的纯化方法
[0001] 本发明涉及一个人胰高血糖素样肽GLP-I的纯化方法，其特征在于此方法可纯化 GLP-I 类似物（Aib8'35)GLP-l (7-36)NH2，其氨基酸序列为：His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-V aI-Ly s-Aib-Arg~NH2
[0002] GLP-I类似物可用一种混合方法合成，所述混合方法包括固相多肽合成方法 (SPPS)和液相肽片段偶联方法。
[0003] 多肽（Aib8,35) GLP-I (7-36) NH2是指人类天然多肽GLP-I (7-36) NH2类似物的衍生 物，它以α-氨基异丁酸（Aib)替换了天然肽第8位（Ala)和第35位（Gly)的残基。
[0004] 该多肽，其治疗应用以及它的固相多肽合成方法（SPPS)已在公开的PCT专利申请 W02000/34331所描述，但是该专利所描述的制备方法并不适用于大规模商业生产。
[0005] 公布的PCT专利申请W02007/147816描述了一种制备该GLP-I类似物的合成 方法，该方法利用三条肽中间体片段在液相中耦合来制备。另外，另一个PCT专利申请 W02010/033254则描述了一种Fmoc固相化学合成方法逐步制备此多肽。然而不管使用其中 哪一种制备方法，纯度一般小于95%。
[0006] 使用液相色谱法纯化人胰高糖素样肽GLP-I已在本领域被广泛描述。
[0007] 例如，根据公布的PCT专利申请W02007/147816的描述，使用两步反相液相色谱法 (RP-HPLC)纯化该GLP-I类似物。此方法使用了四氢呋喃作为流动相，然而四氢呋喃洗脱液 不利于在大规模反相高效液相色谱法生产中使用，因为它可以形成过氧化物。
[0008] PCT专利申请W02011/161007提出的纯化方法首先在反相高效液相色谱法采用酸 性RP-HPLC流动相，随后采用高pH值的流动相。然而高pH值条件下多肽不稳定，产生新的 杂质，导致批次之间纯度不一致。
[0009] 因此，有必要开发一个商业化规模可获得高纯度（Aib8'35) GLP-I (7-36) NH2的纯化 方法。旨在减少杂质含量及相应的副作用，以增加治疗的耐受性。
[0010] 申请人发现，通过加入离子交换色谱法作为纯化（Aib8'35) GLP-I (7-36) NH2的一个 正交步骤，可获得高纯度的产品，适合商业规模生产水平。
[0011] 本发明方法的特点在于可以更好地分离具有相似疏水性密切相关的杂质，而这些 杂质只通过使用单一的RP-HPLC方法不能得到有效的纯化。
[0012] 本发明中优选实施方案最终产品的纯度要求高于99. 3%，单个杂质含量不超过 0. 3 %。例如，最终产品的纯度约为99. 3 %，约为99. 4 %，约为99. 5 %，约为99. 6 %，约为 99. 7 %，约为99. 8 %，约为99. 9 %，单个杂质含量约为0. 3 %，约为0. 2 %，约为0. 1 %。在 另一个优选实施方案中，最终产品的纯度至少是99. 9%，单个杂质小于0. 1%。高纯度的 (Aib8'35) GLP-I (7-36) NH2在临床评价中至关重要。
[0013] 另外，由于离子交换柱的负荷容量大约是反相高效液相色谱法的3倍，从而大幅 度减少了纯化时间。采用本发明的一种优选实施方案，乙酸根的含量不大于〇. 3%。
[0014] 与PCT专利申请WO 2007/147816和WO 2011/61007所描述的方法不同，离子交换 方法的另一个优点是纯化的第一步不使用价格较高的乙腈洗脱液，这样可以进一步降低成 本。
[0015] 最后，本发明的纯化方法可带来好的产品收率。例如，本发明的纯化方法达到至少 15 %的收率，至少16 %的收率，至少17 %的收率，至少18 %的收率，至少19 %的收率，以及 至少20%的收率。采用本发明的优选实施方案，可达到约21 %的收率。
[0016] 本发明的主题为多肽（Aib8'35)GLP-l(7-36)My^-种纯化方法，主要包括以下两 个步骤：
[0017] a)离子交换色谱法纯化步骤，和
[0018] b)反相高效液相色谱法纯化步骤。
[0019] 在以下文本中，除非另有表明，某个范围内的一系列值包括其限值，尤其是在表达 "范围从某值开始"的时候。
[0020] 酸性缓冲液是一种含缓冲剂酸性溶液，可防止pH值的变化。
[0021] "单个杂质"是指非（Aib8'35)GLP-l (7-36)NH2的一种多肽。
[0022] "RP-HPLC"是指反相高效液相色谱法。
[0023] 除非另有表明，本发明使用的各种术语的含义和范围描述如下。
[0024] 针对本发明，"正交"术语表示使用两个互补但又不同形式的色谱法来纯化化合 物。
[0025] 根据本发明，正交色谱纯化过程由两个步骤组成：
[0026] a)离子交换纯化法，这是基于被分离组分电荷差异的色谱分离法，和
[0027] b)反相高效液相色谱法，这是基于组分疏水性不同的色谱分离法。
[0028] 在优选的方案中a)步骤在b)之前执行，但也可以同时进行。
[0029] 根据本发明，步骤a)是在酸性缓冲液中进行。
[0030] 步骤a)的流动相可以是一个酸性缓冲液或其混合物。因此，作为步骤a)的流动 相的酸性缓冲液优选包括两个洗脱液，洗脱液A和洗脱液B，并且洗脱液A和洗脱液B总和 为100%。洗脱液A和B可从本领域技术人员熟知的酸性缓冲液选出。例如，乙酸或其盐的 酸性缓冲液，尤其是其铵盐和钠盐；甲酸或其盐的酸性缓冲液，尤其是其铵盐和钠盐；磷酸 或其盐的酸性缓冲液，尤其是其铵盐和钠盐。
[0031] 优选的洗脱液A和B为乙酸及其相对应的某一种盐。更优选的洗脱液A和B是乙 酸和其相应的乙酸铵。
[0032] 本发明的另一个方案为，步骤a)酸性缓冲液的pH值应在从I. 0到6. 0范围内，或 者1. 25到5. 0范围内，优选的pH值在1. 5到4. 6范围内。
[0033] 本发明的另一个方案为，步骤a)用两种洗脱液进行，即洗脱液A和洗脱液B。优选 方案为步骤a)用乙酸铵溶液作为洗脱液A和乙酸溶液作为洗脱液B。更优选方案为，步骤 a)要在步骤b)之前执行，并选择乙酸铵溶液和乙酸溶液分别作为步骤a)的洗脱液A和洗 脱液B。
[0034] 本发明优选方案为，选择用乙酸铵溶液和乙酸溶液分别作为步骤a)的洗脱液A和 洗脱液B，且pH值范围从I. 0到6. 0,1. 25到5. 0,更优选的pH值范围是从1. 5到4. 6。
[0035] 本发明更优选方案为，步骤a)在乙酸铵溶液流动相中乙酸含量梯度增加。
[0036] 优选方案为，步骤a)选择乙酸溶液作为洗脱液B，其浓度梯度范围应在0到60 % (v/v)内，选择乙酸铵溶液作为洗脱液A且浓度范围从100到40% (v/v)。更优选方案为， 步骤a)选择乙酸溶液作为洗脱液B，其浓度梯度范围从O到50% (v/v)，选择乙酸铵溶液作 为洗脱液A，浓度梯度范围从100到50% (v/v)。
[0037] 本发明的一个重要方案在于，步骤a)的实施选用乙酸铵溶液，且pH值范围从4. 0 到5. 0,4. 1到4. 9,4. 2到4. 8,4. 3到4. 7或者4. 4到4. 6等。更优选方案是步骤a)选用 乙酸铵溶液，且pH值范围从4. 2到4. 8,更优选的pH值范围从4. 4到4. 5。
[0038] 根据本发明，步骤a)中选用乙酸铵溶液，其浓度范围从0. 1到50mM，0. 25到40mM， 0. 5到30mM，或0. 75到25mM等。更优选方案是，步骤a)中选用乙酸铵溶液，其浓度范围从 1到20mM，更优选地从1到12mM，进一步优选浓度范围是10mM(10±0. 5mM)左右。
[0039] 本发明的一个重要方案在于，步骤a)选用乙酸溶液，其pH值范围从0.5到3.0， 0. 75到2. 75,0. 8到2. 5,0. 9到2. 25等。更优选方案是的乙酸溶液pH值范围从I. 0到 2. 0,进一步更优选方案pH的范围是从1. 5到1. 7。
[0040] 用于步骤a)乙酸溶液可以是乙酸稀溶液，尤其是用如HPLC等级的水来稀释。
[0041] 优选方案中，步骤a)选用乙酸水溶液，其浓度范围从40%到60%，更优选范围是 45%到55%，进一步更优选范围是49到51%。
[0042] 根据本发明，步骤b)采用反相高效液相色谱梯度洗脱方法。
[0043] 优选方案中，步骤b)选用酸性缓冲液。优选方案中，步骤b)选用酸性缓冲液pH 值范围从I. 〇至6. 0,1. 25至5. 75,1. 5至5. 5,或1. 75至5. 25等。更优选范围是pH值从 2. 0至4. 5,进一步更优选范围是pH值范围从2. 5至3。
[0044] 根据本发明，在步骤b)中，梯度洗脱可以用一种或多种酸性洗脱液，特别是用两 种酸性洗脱液，即洗脱液C和洗脱液D，并且两种洗脱液C和洗脱液D总和是100%。洗脱 液C和洗脱液D可以是一种酸性水溶液或有机溶液。溶液可以是如乙酸水溶液或乙酸的有 机溶液。有机溶剂如乙腈或酒精，其中酒精包括甲醇、乙醇和丙醇。
[0045] 优选方案中，步骤b)选用酸性洗脱液C和酸性洗脱液D梯度洗脱，更优选方案中， 选用乙酸水溶液作为洗脱液C和乙酸乙腈溶液作为洗脱液D。
[0046] 本发明的优势在于，步骤b)选用梯度从0至70% (v/v)的酸性洗脱液D以及100 至30 % (v/v)的酸性洗脱液C。更优选方案是，步骤b)选用梯度从0至60 % (v/v)的酸性 洗脱液D以及100至40% (v/v)的酸性洗脱液C。
[0047] 本发明的优势在于，步骤b)选用乙酸乙腈溶液作为酸性洗脱液D，其乙腈浓度梯 度从0至70% (v/v)，以及选用乙酸水溶液作为酸性洗脱液C，其中水浓度梯度100至30% (v/v)。更优选方案是，步骤b)选用乙腈浓度梯度从0至60% (v/v)的乙酸乙腈溶液作为 酸性洗脱液D以及水浓度梯度100至40% (v/v)的乙酸水溶液作为酸性洗脱液C。
[0048] 在另一个优选方案中，步骤b)选用洗脱液C和洗脱液D作为流动相时，乙酸浓度 范围从0. 1至0. 5N。更为优选方案中，步骤b)选用洗脱液C和洗脱液D作为流动相时乙酸 浓度范围从0. 2到0. 3N。
[0049] 本发明的优势在于，通过本发明的纯化方法获得的GLP-I类似物（Aib8' 35) GLP-I (7-36) NH2产品乙酸含量小于10% (w/w)。<