一种黎豆种皮黑色素的分离纯化方法
【专利摘要】本发明提供一种黎豆种皮黑色素的分离纯化方法，分离纯化过程为：将黎豆种皮通过水煮除杂后，按照1∶8?12g/ml的料液比加入NaOH溶液超声浸提30?50min，之后加入HC1溶液调pH<2，室温静置,离心收集得到胶状沉淀；纯化过程为：将收集到的胶状沉淀悬浮于15?25倍体积的HCl溶液，在沸水浴中水解2?4h，冷却后离心收集固体颗粒；将收集的固体颗粒依次用乙醇、乙酸乙酯、丙酮洗涤，并在之后利用NaOH溶液和HCL溶液进行多次沉淀，得到黑色素颗粒。所述分离纯化方法操作简单，黎豆种皮黑色素的分离纯化量高并且纯度高，黑色素氧化程度低，分离纯化周期短，此外成本低廉，适合用于进行黎豆种皮黑色素的大规模分离纯化，提高了黎豆的经济价值，拓宽了黎豆的应用领域。
【专利说明】
一种黎豆种皮黑色素的分离纯化方法
技术领域
[0001]本发明涉及分离纯化工艺技术领域，尤其涉及一种黎豆种皮黑色素的分离纯化方法。
【背景技术】
[0002]黑色素是广泛存在于动物、植物和微生物中的棕黑到黑色难溶性色素的总称，具有重要的生理特征。在动植物体内黑色素具有防御、保护的功能。现有资料表明，黑色素一般为两种类型，即H引噪型(Eumelanin)和邻苯二酸型(Pheomelanin)。认为动物黑色素多属口引噪型(Eumelanin)，而植物源黑色素多属邻苯二酸型(Pheomelanin)。
[0003]黑色素可为生物体提供结构性强度或保护生物免紫外线、电离辐射、重金属污染、低温和高温等环境胁迫的伤害。它不仅是一类光保护剂、抗辐射剂、螯合剂、生物抗氧化剂和免疫促进剂，而且还是一类生物半导体材料。近年来的研究还发现，黑色素具有抗蛇毒、抗癌、抑制艾滋病毒复制、治疗帕金森症等作用，具有广泛的开发应用潜力。在食品方面的开发利用最为常见，可以将黑色素制成的食品添加剂，不仅无毒无害，还能对人体其保健作用。在保健功能食品上，可利用黑色素的功效成分生产口服液、营养保健片、多维胶囊等。
[0004]黎豆(Stizolobium capitatum Kuntze)又名猫猫豆、毛毛豆、龙爪豆、毛狗豆、小狗豆、狗爪豆、狸豆、虎豆、八升豆，是豆科黎豆属一年生草本植物。原产亚洲南部，分布于热带和亚热带(美洲除外)，我国四川、云南、广西、贵州、湖南、湖北、安徽等省均有栽培，日本也广为栽培。我国对黎豆种皮黑色素的研究开发尚未见报道，目前常用的分离纯化工艺无法从黎豆种皮中有效分离纯化黑色素。
[0005]因此，现有技术还有待于进一步改进。
【发明内容】
[0006]鉴于现有技术的不足，本发明在于提供一种黎豆种皮黑色素的分离纯化方法，旨在解决目前无相应技术能从黎豆种皮中有效分离纯化黑色素的问题。
[0007]本发明的技术方案如下:
一种黎豆种皮黑色素的分离纯化方法，其中，所述方法为:
提取过程:将黎豆种皮通过水煮除杂后，按照1:8-12g/ml的料液比加入NaOH溶液超声浸提30_50min，之后加入HCl溶液调pH〈2，室温静置，离心收集得到胶状沉淀；
纯化过程:将收集到的胶状沉淀悬浮于15-25倍体积的HCl溶液，在沸水浴中水解2-4h，冷却后离心收集固体颗粒；
将收集的固体颗粒依次用乙醇、乙酸乙酯、丙酮洗涤，并在之后利用NaOH溶液和HCL溶液进行多次沉淀，得到黑色素颗粒。
[0008]所述的黎豆种皮黑色素的分离纯化方法，其中，提取过程中按照1:10g/ml的料液比加入NaOH溶液。
[0009]所述的黎豆种皮黑色素的分离纯化方法，其中，所用NaOH溶液的质量分数为4%。
[0010]所述的黎豆种皮黑色素的分离纯化方法，其中，提取过程中浸提时间为40min。
[0011]所述的黎豆种皮黑色素的分离纯化方法，其中，提取过程中浸提温度条件为60°C。
[0012]所述的黎豆种皮黑色素的分离纯化方法，其中，提取过程中利用浓度为0.5mol/LHCl溶液调pH为I。
[0013]所述的黎豆种皮黑色素的分离纯化方法，其中，纯化过程中将收集的胶状沉淀悬浮于15倍体积的HCl溶液中水解。
[0014]所述的黎豆种皮黑色素的分离纯化方法，其中，纯化过程中沸水浴中水解并冷却后在4000-5000r/min离心1min后，收集固体颗粒。
[0015]所述的黎豆种皮黑色素的分离纯化方法，其中，将纯化过程中对固体颗粒的洗涤方法为:依次用固体颗粒质量的50倍体积的乙醇洗涤3次、乙酸乙酯洗涤2次、丙酮洗涤I次，每次洗涤过程中进行混合并震荡30min，然后4000r/min离心分离lOmin。
[0016]所述的黎豆种皮黑色素的分离纯化方法，其中，所述利用NaOH溶液和HCL溶液进行多次沉淀具体为:将洗涤后的固体颗粒首先用0.5 mol/L NaOH在超声波辅助下溶解30min，离心除去未溶解部分，然后用2 mol/L HCl调节pH I?2，沉淀I?2 h后离心，然后再次加入NaOH调节至pH 11使固体颗粒溶解，离心取上清液酸化使之沉淀，如此反复沉淀。
[0017]有益效果:本发明提供一种黎豆种皮黑色素的分离纯化方法，所述分离纯化方法操作简单，黎豆种皮黑色素的分离纯化量高并且纯度高，黑色素氧化程度低，分离纯化周期短，此外成本低廉，适合用于进行黎豆种皮黑色素的大规模分离纯化，提高了黎豆的经济价值，拓宽了黎豆的应用领域。
【具体实施方式】
[0018]本发明提供一种黎豆种皮黑色素的分离纯化方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0019]本发明提供一种黎豆种皮黑色素的分离纯化方法，所述分离纯化方法为:
分离纯化过程包括如下步骤:
S1:将黎豆种皮进行水煮除杂:称取黎豆种皮，将其放入锥形瓶中，加入蒸馏水煮沸15min后过滤，以除去水溶性杂质和排除材料中的气体，有利于后续实验。
[0020]S 2:按照质量比1: 8 -12 g /m I的料液比向溶液中加入Na OH溶液，并超声浸提3 O -50mino
[0021]由于黑色素具有溶于碱性溶液而在酸性溶液中沉淀的性质，并且碱液对黑色素的选择性高，溶解力强，萃取率也高，因此碱溶酸沉法是黎豆种皮黑色素的有效分离纯化方法。而碱液中，NaOH溶液的碱性强，对黑色素的溶解力更强，分离纯化效果好。当NaOH溶液的质量分数为4%时，黑色素的溶解力最强，分离纯化效率最高。
[0022]在一定范围内，黎豆种皮黑色素的分离纯化量随NaOH溶液的量增加而提高，但是当NaOH溶液的量过多时，黎豆种皮黑色素的分离纯化量基本不再改变，此时过多的NaOH溶液会提高分离纯化的成本，造成浪费。当按照质量比1: 8-12g/ml的料液比向溶液中加入NaOH溶液时，黎豆种皮黑色素的分离纯化效率高，成本较低。优选地，当料液比为比I: 1g/ml时，黎豆种皮黑色素的分离纯化量达到最高，并且消耗NaOH溶液的量最少。
[0023]浸提的时间越长，黑色素分离纯化的量越多，但是时间过长时，容易由于微生物的滋生而污染分离纯化物。当浸提时间控制在30-50min，黑色素分离纯化效率高，并且品质好。优选地实施例中，在分离纯化过程中浸提时间为40min，此时能保证最大程度地分离纯化黎豆种皮黑色素。
[0024]由于随着分离纯化温度的升高，黑色素得率不断上升。但是60°C后，黑色素的氧化程度进一步加深，抗氧化能力不断降低，黑色素含量明显呈下降趋势，粗提物中杂质含量提高，黑色素含量下降，，这将对下一步的纯化带来不便，因此，在分离纯化过程中，浸提温度条件为60°C时，黑色素的分离纯化率最高，有利于后续的纯化。
[0025]S3:向溶液中加入HCl溶液直至将溶液的pH〈2.0，收集得到胶状沉淀。当溶液的PH调为小于2时，溶液中黑色素溶解度低，极易沉淀下来。优选地，分离纯化过程中利用浓度为
0.5mol/L HCl溶液调PH为I，溶液中黎豆种皮黑色素溶解度达到最低，分离纯化量最高。
[0026]纯化方法包括以下步骤:
S4:将收集到的胶状沉淀悬浮于15-25倍体积的HCl溶液，在沸水浴中水解2_4 h，冷却后离心收集固体颗粒。这能有效分离胶状沉淀与黑色素结合的杂质，并去除一部分能溶于酸的杂质。
[0027]由于HCl浓度越大，黑色素纯度越高，当HCl浓度过高时，黎豆黑色素的生物活性会受到破坏，而且还会带来不必要的能源损耗，提高成本。优选地，所用HCl溶液浓度为1.5mol/L，此种条件下分离和溶解杂质的效果最好。
[0028]优选地，纯化过程中将收集的胶状沉淀悬浮于15倍体积的HCl溶液中水解，此种条件下分离和溶解杂质的效果最好。
[0029]优选地，纯化过程中沸水浴中水解并冷却后在4000-5000r/min离心1min后，收集固体颗粒。此种条件下获得的固体颗粒的得率最高。
[0030]S5:将收集的固体颗粒依次用乙醇、乙酸乙酯、丙酮洗涤。这个步骤是用于高效去除固体颗粒中的脂溶性杂质。
[0031]具体地，将纯化过程中对固体颗粒的洗涤方法为:依次用固体颗粒质量的50倍体积的乙醇洗涤3次、乙酸乙酯洗涤2次、丙酮洗涤I次，每次洗涤过程中进行混合并震荡30min，然后4000r/min离心分离lOmin。这种条件下，洗涤效果最好，去除脂溶性杂质效率最尚O
[0032]S6:并在之后利用NaOH溶液和HCL溶液进行多次沉淀，得到黑色素颗粒。
[0033]上述步骤具体为:将洗涤后的固体颗粒首先用0.5mol/L NaOH在超声波辅助下溶解30 min，离心除去未溶解部分，然后用2 mol/L HCl调节pH I?2，沉淀I?2 h后离心，然后再次加入NaOH调节至pH 11使固体颗粒溶解，离心取上清液酸化使之沉淀，如此反复沉淀。
[0034]由于黎豆种皮黑色素在pHI?2的环境下溶解度最低，以沉淀形式最大程度地析出，而在pH 11时溶解度最高，溶解在溶液上清中。因此，采用上述的条件利用NaOH溶液和HCL溶液进行反复沉淀，能最大程度的去除黎豆种皮黑色素中的剩余杂质，获得高纯度的黎豆种皮黑色素。
[0035]在纯化后，还可对纯化产物进行以下的处理，进一步提高产物的品质。
[0036]S7:将得到的黑色素颗粒进行冷冻，得到的冷冻后在室温下解冻，用蒸馏水洗涤沉淀，至离心上清液Cl一定性检测为阴性后，在室温下真空干燥至恒重，得到黑色素纯品。由于多次沉淀，获得的黑色素颗粒中存在Cl—，为避免Cl 一影响黎豆种皮黑色素的纯度及品质，需要蒸馏水洗涤沉淀去除Cl—杂质。
[0037]为了更详尽的描述本发明的制备方法，以下列举几个实施例更进一步的说明。
[0038]实施例1
本发明提供的黎豆种皮黑色素的分离纯化方法如下:
分离纯化过程:将黎豆种皮通过水煮除杂后，按照1:10g/ml的料液比加入质量分数为4%的NaOH溶液，60°C条件下超声浸提40min，再加入0.5 mol/L的HCl溶液调PH为I，离心收集得到胶状沉淀。
[0039]纯化过程:将收集到的胶状沉淀悬浮于15倍体积的1.5mol/L的HCl溶液，在沸水浴中水解2 h，冷却后在5000r/min条件下离心1min后，收集固体颗粒。
[0040]依次用固体颗粒质量的50倍体积的乙醇洗涤3次、乙酸乙酯洗涤2次、丙酮洗涤I次，每次洗涤过程中进行混合并震荡30min，然后4000r/min离心分离lOmin。
[0041 ]将洗涤后的固体颗粒首先用0.5 mol/L NaOH在超声波辅助下溶解30 min，离心除去未溶解部分，然后用2 mol/L HCl调节pH I，沉淀Ih后离心，然后再次加入NaOH调节至pH11使固体颗粒溶解，离心取上清液酸化使之沉淀，如此反复沉淀，最后得到黑色素颗粒。
[0042]将得到的黑色素颗粒冷冻后在室温下解冻，用蒸馏水洗涤沉淀，至离心上清液Cl 一定性检测为阴性后，在室温下真空干燥至恒重，得到黑色素纯品。
[0043]实验结果显示，黎豆种皮黑色素的得率有3.2%，黑色素含量纯度为89%。
[0044]实施例2
本发明提供的黎豆种皮黑色素的分离纯化方法如下:
分离纯化过程:将黎豆种皮通过水煮除杂后，按照I: 8g/ml的料液比加入质量分数为4%的NaOH溶液，50°C条件下超声浸提30min，再加入0.5 mol/L的HCl溶液调PH为I，离心收集得到胶状沉淀。
[0045]纯化过程:将收集到的胶状沉淀悬浮于20倍体积的1.5mol/L的HCl溶液，在沸水浴中水解3 h，冷却后在4000r/min条件下离心1min后，收集固体颗粒。
[0046]依次用固体颗粒质量的50倍体积的乙醇洗涤3次、乙酸乙酯洗涤2次、丙酮洗涤I次，每次洗涤过程中进行混合并震荡30min，然后4000r/min离心分离lOmin。
[0047]将洗涤后的固体颗粒首先用0.5mol/L NaOH在超声波辅助下溶解30 min，离心除去未溶解部分，然后用2 mol/L HCl调节pH I，沉淀Ih后离心，然后再次加入NaOH调节至pH11使固体颗粒溶解，离心取上清液酸化使之沉淀，如此反复沉淀，最后得到黑色素颗粒。
[0048]将得到的黑色素颗粒冷冻后在室温下解冻，用蒸馏水洗涤沉淀，至离心上清液Cl 一定性检测为阴性后，在室温下真空干燥至恒重，得到黑色素纯品。
[0049]实验结果显示，黎豆种皮黑色素的得率有3.0%，黑色素含量纯度为85%。
[0050]实施例3
本发明提供的黎豆种皮黑色素的分离纯化方法如下:
分离纯化过程:将黎豆种皮通过水煮除杂后，按照1:12g/ml的料液比加入质量分数为4%的NaOH溶液，70°C条件下超声浸提50min，再加入0.5 mol/L的HCl溶液调PH为2，离心收集得到胶状沉淀。[0051 ]纯化过程:将收集到的胶状沉淀悬浮于25倍体积的1.5mol/L的HCl溶液，在沸水浴中水解4h，冷却后在5000r/min条件下离心1min后，收集固体颗粒。
[0052]依次用固体颗粒质量的50倍体积的乙醇洗涤3次、乙酸乙酯洗涤2次、丙酮洗涤I次，每次洗涤过程中进行混合并震荡30min，然后4000r/min离心分离lOmin。
[0053]将洗涤后的固体颗粒首先用0.5 mol/L NaOH在超声波辅助下溶解30 min，离心除去未溶解部分，然后用2 mol/L HCl调节pH I，沉淀Ih后离心，然后再次加入NaOH调节至pH11使固体颗粒溶解，离心取上清液酸化使之沉淀，如此反复沉淀，最后得到黑色素颗粒。
[0054]将得到的黑色素颗粒冷冻后在室温下解冻，用蒸馏水洗涤沉淀，至离心上清液Cl 一定性检测为阴性后，在室温下真空干燥至恒重，得到黑色素纯品。
[0055]实验结果显示，黎豆种皮黑色素的得率有3.15%，黑色素含量纯度为86%。
[0056]本发明提供的一种黎豆种皮黑色素的分离纯化方法不仅操作简单，黎豆种皮黑色素的分离纯化量高并且纯度高，黑色素氧化程度低，分离纯化周期短，此外成本低廉，适合用于进行黎豆种皮黑色素的大规模分离纯化，提高了黎豆的经济价值，拓宽了黎豆的应用领域。
[0057]应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
【主权项】
1.一种黎豆种皮黑色素的分离纯化方法，其特征在于，所述方法为: 提取过程:将黎豆种皮通过水煮除杂后，按照1:8-12g/ml的料液比加入NaOH溶液超声浸提30_50min，之后加入HCl溶液调pH〈2，室温静置，离心收集得到胶状沉淀； 纯化过程:将收集到的胶状沉淀悬浮于15-25倍体积的HCl溶液，在沸水浴中水解2 -4h，冷却后离心收集固体颗粒； 将收集的固体颗粒依次用乙醇、乙酸乙酯、丙酮洗涤，并在之后利用NaOH溶液和HCL溶液进行多次沉淀，得到黑色素颗粒。2.根据权利要求1所述的黎豆种皮黑色素的分离纯化方法，其特征在于，提取过程中按照1:10g/ml的料液比加入NaOH溶液。3.根据权利要求1所述的黎豆种皮黑色素的分离纯化方法，其特征在于，所用NaOH溶液的质量分数为4%。4.根据权利要求1所述的黎豆种皮黑色素的分离纯化方法，其特征在于，提取过程中浸提时间为40min。5.根据权利要求1所述的黎豆种皮黑色素的分离纯化方法，其特征在于，提取过程中浸提温度条件为60°C。6.根据权利要求1所述的黎豆种皮黑色素的分离纯化方法，其特征在于，提取过程中利用浓度为0.5mol/L HCl溶液调pH为I。7.根据权利要求1所述的黎豆种皮黑色素的分离纯化方法，其特征在于，纯化过程中将收集的胶状沉淀悬浮于15倍体积的HCl溶液中水解。8.根据权利要求1所述的黎豆种皮黑色素的分离纯化方法，其特征在于，纯化过程中沸水浴中水解并冷却后在4000-5000r/min离心1min后，收集固体颗粒。9.根据权利要求1所述的黎豆种皮黑色素的分离纯化方法，其特征在于，将纯化过程中对固体颗粒的洗涤方法为:依次用固体颗粒质量的50倍体积的乙醇洗涤3次、乙酸乙酯洗涤2次、丙酮洗涤I次，每次洗涤过程中进行混合并震荡30min，然后4000r/min离心分离lOmin。10.根据权利要求1所述的黎豆种皮黑色素的分离纯化方法，其特征在于，所述利用NaOH溶液和HCL溶液进行多次沉淀具体为:将洗涤后的固体颗粒首先用0.5 mol/L NaOH在超声波辅助下溶解30 min，离心除去未溶解部分，然后用2 mol/L HCl调节pH I?2，沉淀I?2 h后离心，然后再次加入NaOH调节至pH 11使固体颗粒溶解，离心取上清液酸化使之沉淀，如此反复沉淀。
【文档编号】C09B67/54GK106009768SQ201610411427
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月14日
【发明人】董华强, 麦钊键
【申请人】佛山科学技术学院