本发明公开了一种亲水性多肽纯化的方法，属于蛋白质与多肽纯化领域。
背景技术：
所谓多肽，它是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一种化合物。它由氨基酸构成，但与蛋白质又有所不同，属于它们之间的中间物质。氨基酸能够彼此以肽键相互连接的化合物称作肽。一种肽含有的氨基酸少于10个就被称为寡肽，超过的就称为多肽，氨基酸为50多个以上的多肽称为蛋白质。多肽生物活性高，它能调节各种生理活动和生化反应。到现在，人们已发现和分离出100多种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，在世界范围内已经出现了一个空前的繁荣景象。
近几十年来，对于多肽的研究取得了突飞猛进的发展，现在的科学家已经对多肽有了清醒的认识。多肽对人体具有非常重要的不可替代的调节作用，这种作用几乎涉及到人体的所有生理活动。
在进行普通药物动力学研究中，hplc是技术成熟，应用广泛的分析手段。在蛋白多肽药物的实验研究或产业化中，hplc都是主要的分离纯化工具。但鉴于蛋白多肽药物结构的特殊性，特别一些小分子多肽。由于序列短而且很多亲水性氨基酸，所以在常规hplc上几乎没有保留，对后期的分离纯化造成一定的难度。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种亲水性多肽纯化的方法，主要解决现在hplc用于小分子多肽分离时存在在常规hplc上几乎没有保留，对后期的分离纯化造成一定的难度的技术问题。本发明的思路是：采用凝胶色谱和氨基柱反相色谱两步分离纯化，从而实现最终产品的分离得到高纯度的肽。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种亲水性多肽纯化的方法，包括以下步骤：
第一次凝胶色谱纯化步骤：
（1）将多肽样品加纯入水中超声搅拌溶解直至澄清，用微孔滤膜过滤；
（2）将多肽样品加入到预装好的凝胶柱中，上样量为1-5倍柱床体积；
（3）加入无盐水作为洗脱液，设置合适的流速洗脱分离样品；
（4）样品纯度大于90%的收集在一起放置；
第二次氨基柱纯化步骤：
（1）将上述收集的样品上样至反相色谱系统，洗脱流动相a相为磷酸缓冲液（取磷酸二氢钾13.61g，加入500ml溶解后加入氨水5.0ml，加水稀释至1000ml，混匀，用磷酸调ph至4.2±0.02），流动相b相为乙腈；
（2）设置洗脱梯度、流速及检测波长；
（3）收集目标馏分；
（4）将收集馏分冻干称重。
所述微孔滤膜为0.45μm水系微孔滤膜。所述的凝胶为交联葡聚糖，比如sephadexg的g-10、g-15等。所用氨基柱为luna氨基柱。所述多肽序列中亲水氨基酸占比超过50%。所述多肽分子量不大于600da。
本发明的有益效果是：通过采用凝胶色谱和氨基柱反相色谱两步分离纯化，有效的解决了亲水性多肽在反相几乎不保留无法分离。同时有效的提高了工作效率，减少有机溶剂用量，节省成本。除了采用凝胶色谱和氨基柱反相色谱两步分离纯化这个思路，在采用具体参数设定时，是否有哪些参数设定是本领域技术人员不容易想到的，并带来特定的技术效果。有益效果的描述多多益善，并最好用数据说话。
具体实施方式
实施例1
样品名：(β-asp)-asp结构式：
第一次凝胶色谱纯化：
（1）将样品(β-asp)-asp加纯入水中超声搅拌溶解直至澄清，用0.45μm水系微孔滤膜过滤；
（2）将样品加入到预装好的凝胶柱g-10中，上样量为2倍柱床体积；
（3）加入无盐水作为洗脱液，设置流速为4ml/min洗脱分离样品；
（4）样品纯度大于90%的收集在一起放置。
第二次氨基柱纯化：
（1）将上述收集的样品上样至反相色谱系统，洗脱流动相a相为磷酸缓冲液（取磷酸二氢钾13.61g，加入500ml溶解后加入氨水5.0ml，加水稀释至1000ml，混匀，用磷酸调ph至4.2±0.02），流动相b相为乙腈；
（2）设置洗脱梯度b为40-60%，30min、流速为30ml/min、检测波长为215nm；
（3）收集目标馏分；
（4）将收集馏分冻干称重，计算回收率为38.21%。
实施例2
样品名：orn-asp结构式：
第一次凝胶色谱纯化：
（1）将样品orn-asp加纯入水中超声搅拌溶解直至澄清，用0.45μm水系微孔滤膜过滤；
（2）将样品加入到预装好的凝胶柱g-15中，上样量为1.5倍柱床体积；
（3）加入无盐水作为洗脱液，设置流速为4ml/min洗脱分离样品；
（4）样品纯度大于90%的收集在一起放置。
第二次氨基柱纯化：
（1）将上述收集的样品上样至反相色谱系统，洗脱流动相a相为磷酸缓冲液（取磷酸二氢钾13.61g，加入500ml溶解后加入氨水5.0ml，加水稀释至1000ml，混匀，用磷酸调ph至4.2±0.02），流动相b相为乙腈；
（2）设置洗脱梯度b为40-60%，30min、流速为30ml/min、检测波长为215nm；
（3）收集目标馏分；
（4）将收集馏分冻干称重，计算回收率为37.56%。
实施例3
样品名：β-asp-orn结构式：
第一次凝胶色谱纯化：
（1）将样品β-asp-orn加纯入水中超声搅拌溶解直至澄清，用0.45μm水系微孔滤膜过滤；
（2）将样品加入到预装好的凝胶柱g-10中，上样量为2.5倍柱床体积；
（3）加入无盐水作为洗脱液，设置流速为4ml/min洗脱分离样品；
（4）样品纯度大于90%的收集在一起放置。
第二次氨基柱纯化：
（1）将上述收集的样品上样至反相色谱系统，洗脱流动相a相为磷酸缓冲液（取磷酸二氢钾13.61g，加入500ml溶解后加入氨水5.0ml，加水稀释至1000ml，混匀，用磷酸调ph至4.2±0.02），流动相b相为乙腈；
（2）设置洗脱梯度b为40-60%，30min、流速为30ml/min、检测波长为215nm；
（3）收集目标馏分；
（4）将收集馏分冻干称重，计算回收率为39.27%。
实施例4
样品名：β-asp-δ-orn结构式：
第一次凝胶色谱纯化：
（1）将样品β-asp-δ-orn加纯入水中超声搅拌溶解直至澄清，用0.45μm水系微孔滤膜过滤；
（2）将样品加入到预装好的凝胶柱g-15中，上样量为3倍柱床体积；
（3）加入无盐水作为洗脱液，设置流速为4ml/min洗脱分离样品；
（4）样品纯度大于90%的收集在一起放置。
第二次氨基柱纯化：
（1）将上述收集的样品上样至反相色谱系统，洗脱流动相a相为磷酸缓冲液（取磷酸二氢钾13.61g，加入500ml溶解后加入氨水5.0ml，加水稀释至1000ml，混匀，用磷酸调ph至4.2±0.02），流动相b相为乙腈；
（2）设置洗脱梯度b为40-60%，30min、流速为30ml/min、检测波长为215nm；
（3）收集目标馏分；
（4）将收集馏分冻干称重，计算回收率为38.68%。
实施例5
样品名：orn-δ-orn结构式：
第一次凝胶色谱纯化：
（1）将样品orn-δ-orn加纯入水中超声搅拌溶解直至澄清，用0.45μm水系微孔滤膜过滤；
（2）将样品加入到预装好的凝胶柱g-15中，上样量为5倍柱床体积；
（3）加入无盐水作为洗脱液，设置流速为4ml/min洗脱分离样品；
（4）样品纯度大于90%的收集在一起放置。
第二次氨基柱纯化：
（1）将上述收集的样品上样至反相色谱系统，洗脱流动相a相为磷酸缓冲液（取磷酸二氢钾13.61g，加入500ml溶解后加入氨水5.0ml，加水稀释至1000ml，混匀，用磷酸调ph至4.2±0.02），流动相b相为乙腈；
（2）设置洗脱梯度b为40-60%，30min、流速为30ml/min、检测波长为215nm；
（3）收集目标馏分；
（4）将收集馏分冻干称重，计算回收率为38.37%。