一种紫背天葵皂甙的分离纯化方法及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种紫背天葵皂甙的分离纯化方法及其应用。其中分离纯化方法包括原材料的预处理、粉碎、脱脂，超声波粗提制备紫背天葵粗皂甙，最后经过大孔树脂梯度洗脱得到纯度较高的3种紫背天葵皂甙组分。本发明进行了脱脂操作，使得后期的皂甙提取快速且充分；选用简单快速的超声波在最优的超声波条件下进行浸提，能够达到80%以上的提取率；提取完成后利用高浓度的乙醇进行沉淀处理，能够有效去除蛋白等的杂质干扰。另外，通过动物实验证明了紫背天葵皂甙具有极强的抗氧化性能，能够显著增强机体免疫力，能够作为增强免疫力药物或保健品进行开发利用。
【专利说明】-种紫背天葵皂巧的分离纯化方法及其应用
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于天然化合物分离纯化领域，具体设及一种紫背天葵皂武的分离纯化方 法，本发明还设及分离纯化得到的紫背天葵皂武的应用。
【背景技术】
[0003] 皂武是广泛存在于植物界和某些海洋生物中的一种特殊巧类，大多可溶于水，振 摇后易起持久性的肥皂样泡沫，因而得名。皂武对人体的新陈代谢起着重要的生理作用。它 可W抑制血清中脂类氧化，抑制过氧化脂质的生成，降低血清中胆固醇的含量，抑制过氧化 脂质对肝脏的损伤，防止动脉硬化，因而它具有免疫调节的作用。它可W提高NK细胞、LAK 细胞的数量，增强机体免疫力。皂武对核酸和蛋白质合成有促进作用，可增加肝、肌肉组织 中蛋白质与DNA的含量，提高机体的耐力，因而具有抗疲劳作用。皂武还可W抑制肿瘤细 胞的生长并具有消肿抗炎症的作用。许多皂武具有抗菌和抗病毒活性。皂武抗菌作用的机 理之一是由于皂武能与细菌细胞膜中的胆固醇形成复合物，因此认为运种抗菌活性和溶血 性质有关。皂武抗病毒的作用机理则是通过增强机体免疫功能或直接杀死病毒而起作用 的。
[0004]紫背天葵(Begoniafimbritipula化nee)是广东省鼎湖山国家级自然保护区的特 色植物，见于海拔200~1120 m溪谷两侧近水处的向阳石壁处，属中国特有物种。紫背天葵 叶基生，常见1 一3片，表皮毛明显。叶片既可人药，又是一种很好的消食保健品，俗称红天 葵。紫背天葵具清热解毒、止渴生津、活血消肿、润燥止咳之功效;大多推测运些功效与紫背 天葵中的皂武有密切关系。但是目前还没有对紫背天葵皂武进行具体研究，如何分离纯化 紫背天葵皂武，对紫背天葵皂武的构效关系尚未清楚，因而对其的实际活性研究也未见报 道。鉴于紫背天葵独特的药物活性，分离纯化紫背天葵皂武并进行进一步的研究是很有必 要的，并且能为紫背天葵皂武的临床应用研究提供理论依据。
【发明内容】
[0005] 为解决上述问题，本发明的目的之一是提供一种紫背天葵皂武的分离纯化方法， W填补现有技术中关于紫背天葵皂武提取的空白；本发明的目的之二是提供紫背天葵皂武 的应用，进一步掲示其药用价值。
[0006] 为达到上述目的，本发明所采用的第一技术方案是，一种紫背天葵皂武的分离纯 化方法，其具体步骤为： (1) 预处理:选取紫背天葵鲜嫩叶，去除杂物、清洗干净后待用； (2) 粉碎:将处理好的紫背天葵叶干燥并粉碎成粉末； (3) 脱脂:将步骤(2)制得的紫背天葵叶粉末中加入石油酸，超声波冷浸，然后过滤除去 滤液，滤渣挥发干溶剂后得到紫背天葵叶脱脂品，备用； (4)粗皂武提取:将步骤(3)脱脂后的紫背天葵叶粉末加入乙醇液超声波提取，连续提 取两次； 巧)提取液浓缩:将步骤(4)中得到的提取液进行真空旋转蒸发得到浓缩液； (6) 沉淀处理:将步骤巧)得到的浓缩液加入乙醇，进一步沉淀去除杂质； (7) 离屯、:离屯、去除沉淀，保留上清液备用； (8) 萃取:将步骤(7)离屯、之后的上清液中加入乙酸，充分揽拌，静置萃取； (9) 蒸干:将步骤(8)得到的萃取液混合，并进行真空旋转蒸发得到浓缩液，得到蒸发浓 缩液后进行冷冻干燥得到了紫背天葵粗皂武； (10) 纯化:将步骤(9)制得的紫背天葵粗皂武加少量乙醇溶解，利用大孔树脂进行进一 步的分离； (11) 分析:通过香草醒-硫酸法测定收集各管中的皂武含量，绘制曲线，根据曲线不同 峰值，混合峰值附近的收集管中的洗脱液，蒸发浓缩并冻干不同峰值的组分。
[0007] 进一步的，步骤(2)中所述的干燥粉碎的具体操作为:指在60-75°C真空干燥箱中 干燥12-16.5h，粉砕后过孔径为0.21-0.36mm的筛。
[0008] 进一步的，步骤(3)中在进行超声波操作时，超声波冷浸2-4h后，再静置0.5-化，冷 浸过程中不断揽拌，揽拌速率为100-15化/min。
[0009] 进一步的，步骤(3)中所述紫背天葵叶粉末与石油酸的质量比为1:8-11。
[0010] 进一步的，步骤(4)中所述紫背天葵叶脱脂粉末与提取液乙醇的质量比为1:25- 36;加入质量分数为46-55%的乙醇液超声波提取，提取溫度为45-50°C，连续提取两次，第一 次提取时间为35-40min，第二次提取时间为30-34min。
[0011] 进一步的，步骤巧）中蒸发条件具体为:真空度为0.02-0.07MPa，冷凝水的溫度为- 8- -10°C，回收溫度为48-55Γ。
[0012] 进一步的，步骤(6)按照体积比1:4-6加入95%的乙醇，充分揽拌后，于4°C静置2- 4h〇
[0013] 进一步的，步骤口)离屯、条件设定为:转速为4000;rmp/min，离屯、15-20min。
[0014] 进一步的，步骤(8)中加入与上清液等体积的乙酸进行萃取，充分揽拌，静置萃取 0.5-化，重复萃取3次。
[0015] 进一步的，步骤(9)中蒸发条件为:真空度为0.02-0.07MPa，冷凝水的溫度为-8-- 6°C，回收溫度为40-45°C。
[0016] 进一步的，在步骤（10)层析操作之前，通过AB-8大孔树脂进行脱色实验，使用6-8% 的乙醇液洗脱2-3个柱体积，最终W75-80%的乙醇回收，进行脱色处理。
[0017] 进一步的，步骤（10)大孔树脂经68-75%的乙醇液、蒸馈水浸泡，清洗后装柱，并W 蒸馈水充分清洗层析柱，上样后分别W水和不同浓度的乙醇溶液进行梯度洗脱，设定流速 为1.3ml/min，13ml每管收集洗脱液。
[001引进一步的，步骤（10)中的大孔树脂优选为AB-8、Diaion HP - 10、Diaion HP - 20、HPD-450和Amberlite XAD-4。
[0019] 进一步的，步骤（10)中的大孔树脂优选为Amberlite XAD-4。
[0020]上述制得的紫背天葵粗皂武经实验验证其有较强的抗氧化特性，能够用于增强免 疫力的药物或保健品研究中。
[0021] 本发明的有益效果是:本发明首次对紫背天葵叶的皂武进行提取，并进行了有效 的分离纯化，为后期研究提供了实验基础和理论依据。为充分提取皂武，在原料前期处理 时，进行了脱脂操作，使得后期的皂武提取快速且充分;选用简单快速的超声波在最优的超 声波条件下进行浸提，能够达到80%W上的提取率;提取完成后利用高浓度的乙醇进行沉淀 处理，能够有效去除蛋白等的杂质干扰;利用梯度洗脱能够有效分离紫背天葵叶粗皂武，得 到了巧巾主要的组分，经分析明确了 Ξ种组分的纯度均达到92%W上。另外，对提取得到的紫 背天葵叶粗皂武进行生物学实验，发现其有较强的抗氧化性能，在增强免疫力方面具有突 出的价值。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0023] 实施例1 一种紫背天葵皂武的分离纯化方法，其具体步骤为： (1) 预处理:选取紫背天葵鲜嫩叶，去除杂物、清洗干净后待用； (2) 粉碎:将处理好的紫背天葵叶干燥并粉碎成粉末;75°C真空干燥箱中干燥16.5h， 粉碎后过孔径为0.21mm的筛； (3) 脱脂:将步骤(2)制得的紫背天葵叶粉末中加入石油酸，超声波冷浸2.化后，冷浸过 程中不断揽拌，揽拌速率为l(K)r/min，再静置0.5-化，然后过滤除去滤液，滤渣挥发干溶剂 后得到紫背天葵叶脱脂品，备用;所述紫背天葵叶粉末与石油酸的质量比为1:10; (4) 粗皂武提取:将步骤(3)脱脂后的紫背天葵叶粉末加入质量分数为55%的乙醇液超 声波提取，提取溫度为50°C，连续提取两次，第一次提取时间为38min，第二次提取时间为 32min;所述紫背天葵叶脱脂粉末与提取液乙醇的质量比为1:30; 巧)提取液浓缩:将步骤(4)中得到的提取液进行真空旋转蒸发得到浓缩液，蒸发条件 为:真空度为〇.〇7MPa，冷凝水的溫度为-8°C，回收溫度为55°C ; (6) 沉淀处理:将步骤巧)得到的浓缩液按照体积比1:巧日入95%的乙醇，充分揽拌后，于 4°C静置2-地，进一步沉淀去除杂质； (7) 离屯、:转速为4000;rmp/min，离屯、15-20min，去除沉淀，保留上清液备用； (8) 萃取:将步骤(7)离屯、之后的上清液中加入等体积的乙酸，充分揽拌，静置萃取0.5- 化，重复萃取3次； (9) 蒸干:将步骤(8)得到的萃取液混合，并进行真空旋转蒸发得到浓缩液，蒸发条件 为:真空度为〇.〇7MPa，冷凝水的溫度为-8°C，回收溫度为45°C，得到蒸发浓缩液后进行冷冻 干燥得到了紫背天葵粗皂武； (10) 纯化:将步骤(9)制得的紫背天葵粗皂武加少量乙醇溶解，利用Diaion HP - 20大 孔树脂进行进一步的分离;大孔树脂经70%的乙醇液、蒸馈水浸泡，清洗后装柱，并W蒸馈水 充分清洗层析柱，上样后分别W水和不同浓度的乙醇溶液进行梯度洗脱，设定流速为 1.3ml/min，13ml每管收集洗脱液;梯度洗脱的两相条件:0-15min 90%水10%乙醇一40%水 60%乙醇；16-40min 40%水 60%乙醇一20%的水 80%的乙醇；41min-70min 20%的水 80%的乙 醇一5%水95%乙醇； (11) 分析:通过香草醒-硫酸法测定收集各管中的皂武含量，绘制曲线，得到了 3个峰 值，混合峰值附近的收集管中的洗脱液，蒸发浓缩并冻干不同峰值的组分，分别为S1、S2和 S3组分，最后再将得到的各组分进行皂武含量测定。
[0024] 实施例2 一种紫背天葵皂武的分离纯化方法，其具体步骤为： (1) 预处理:选取紫背天葵鲜嫩叶，去除杂物、清洗干净后待用； (2) 粉碎:将处理好的紫背天葵叶干燥并粉碎成粉末;60°C真空干燥箱中干燥12h，粉 碎后过孔径为0.36mm的筛； (3) 脱脂:将步骤(2)制得的紫背天葵叶粉末中加入石油酸，超声波冷浸化后，冷浸过程 中不断揽拌，揽拌速率为15化/min,再静置0.5-化，然后过滤除去滤液，滤渣挥发干溶剂后 得到紫背天葵叶脱脂品，备用;所述紫背天葵叶粉末与石油酸的质量比为1:8; (4) 粗皂武提取:将步骤(3)脱脂后的紫背天葵叶粉末加入质量分数为50%的乙醇液超 声波提取，提取溫度为45°C，连续提取两次，第一次提取时间为35min，第二次提取时间为 34min;所述紫背天葵叶脱脂粉末与提取液乙醇的质量比为1:25; 巧)提取液浓缩:将步骤(4)中得到的提取液进行真空旋转蒸发得到浓缩液，蒸发条件 为:真空度为0. 〇2MPa，冷凝水的溫度为-10°C，回收溫度为48°C ; (6) 沉淀处理:将步骤巧)得到的浓缩液按照体积比1:4加入95%的乙醇，充分揽拌后，于 4°C静置2-地，进一步沉淀去除杂质； (7) 离屯、:转速为4000;rmp/min，离屯、15-20min，去除沉淀，保留上清液备用； (8) 萃取:将步骤(7)离屯、之后的上清液中加入等体积的乙酸，充分揽拌，静置萃取0.5- 化，重复萃取3次； (9) 蒸干:将步骤(8)得到的萃取液混合，并进行真空旋转蒸发得到浓缩液，蒸发条件 为:真空度为〇.〇2MPa，冷凝水的溫度为-6°C，回收溫度为40°C，得到蒸发浓缩液后进行冷冻 干燥得到了紫背天葵粗皂武； (10) 纯化:将步骤(9)制得的紫背天葵粗皂武加少量乙醇溶解，利用Amberlite XAD-4 大孔树脂进行进一步的分离;大孔树脂经75%的乙醇液、蒸馈水浸泡，清洗后装柱，并W蒸馈 水充分清洗层析柱，上样后分别W水和不同浓度的乙醇溶液进行梯度洗脱，设定流速为 1.3ml/min，13ml每管收集洗脱液;梯度洗脱的两相条件:0-15min 90%水10%乙醇一40%水 60%乙醇；16-40min 40%水 60%乙醇一20%的水 80%的乙醇；41min-70min 20%的水 80%的乙 醇一5%水95%乙醇； (11) 分析:通过香草醒-硫酸法测定收集各管中的皂武含量，绘制曲线，得到了 3个峰 值，混合峰值附近的收集管中的洗脱液，蒸发浓缩并冻干不同峰值的组分，分别为S1、S2和 S3组分，最后再将得到的各组分进行皂武含量测定。
[0025] 实施例3 一种紫背天葵皂武的分离纯化方法，其具体步骤为： (1) 预处理:选取紫背天葵鲜嫩叶，去除杂物、清洗干净后待用； (2) 粉碎:将处理好的紫背天葵叶干燥并粉碎成粉末;70°C真空干燥箱中干燥1地，粉 碎后过孔径为0.30mm的筛； (3) 脱脂:将步骤(2)制得的紫背天葵叶粉末中加入石油酸，超声波冷浸4h后，冷浸过程 中不断揽拌，揽拌速率为12化/min,再静置0.5-化，然后过滤除去滤液，滤渣挥发干溶剂后 得到紫背天葵叶脱脂品，备用;所述紫背天葵叶粉末与石油酸的质量比为1:11; (4)粗皂武提取:将步骤(3)脱脂后的紫背天葵叶粉末加入质量分数为46%的乙醇液超 声波提取，提取溫度为48°C，连续提取两次，第一次提取时间为40min，第二次提取时间为 30min;所述紫背天葵叶脱脂粉末与提取液乙醇的质量比为1:36; 巧)提取液浓缩:将步骤(4)中得到的提取液进行真空旋转蒸发得到浓缩液，蒸发条件 为:真空度为0. 〇5MPa，冷凝水的溫度为-9°C，回收溫度为52°C ; (6) 沉淀处理:将步骤巧)得到的浓缩液按照体积比1:6加入95%的乙醇，充分揽拌后，于 4°C静置2-地，进一步沉淀去除杂质； (7) 离屯、:转速为4000;rmp/min，离屯、15-20min，去除沉淀，保留上清液备用； (8) 萃取:将步骤(7)离屯、之后的上清液中加入等体积的乙酸，充分揽拌，静置萃取0.5- 化，重复萃取3次； (9) 蒸干:将步骤(8)得到的萃取液混合，并进行真空旋转蒸发得到浓缩液，蒸发条件 为:真空度为0. 〇5MPa，冷凝水的溫度为-7°C，回收溫度为42°C，得到蒸发浓缩液后进行冷冻 干燥得到了紫背天葵粗皂武； (10) 纯化:将步骤(9)制得的紫背天葵粗皂武加少量乙醇溶解，利用HPD-450大孔树脂 进行进一步的分离;大孔树脂经的乙醇液、蒸馈水浸泡，清洗后装柱，并W蒸馈水充分清 洗层析柱，上样后分别W水和不同浓度的乙醇溶液进行梯度洗脱，设定流速为1.3ml/min， 13ml每管收集洗脱液;梯度洗脱的两相条件：0-15min 90%水10%乙醇一40%水60%乙醇； 16-40min 40%水60%乙醇一20%的水80%的乙醇；41min-70min 20%的水80%的乙醇一5%水 95%乙醇； (11) 分析:通过香草醒-硫酸法测定收集各管中的皂武含量，绘制曲线，得到了 3个峰 值，混合峰值附近的收集管中的洗脱液，蒸发浓缩并冻干不同峰值的组分，分别为S1、S2和 S3组分，最后再将得到的各组分进行皂武含量测定。
[00%] 对比例1: 一种紫背天葵皂武的提取方法，其具体步骤为： (1) 预处理:选取紫背天葵鲜嫩叶，去除杂物、清洗干净后待用； (2) 粉碎:将处理好的紫背天葵叶干燥并粉碎成粉末;75°C真空干燥箱中干燥16.5h， 粉碎后过孔径为0.21mm的筛； (3) 脱脂:将步骤(2)制得的紫背天葵叶粉末中加入石油酸，超声波冷浸2.化后，冷浸过 程中不断揽拌，揽拌速率为l(K)r/min，再静置0.5-化，然后过滤除去滤液，滤渣挥发干溶剂 后得到紫背天葵叶脱脂品，备用;所述紫背天葵叶粉末与石油酸的质量比为1:11; (4) 粗皂武提取:将步骤(3)脱脂后的紫背天葵叶粉末加入质量分数为55%的乙醇液揽 拌提取，提取溫度为50°C，连续提取两次，第一次提取时间为38min，第二次提取时间为 32min;所述紫背天葵叶脱脂粉末与提取液乙醇的质量比为1:35; 巧)提取液浓缩:将步骤(4)中得到的提取液进行真空旋转蒸发得到浓缩液，蒸发条件 为:真空度为〇.〇7MPa，冷凝水的溫度为-8°C，回收溫度为55°C ; (6) 沉淀处理:将步骤巧)得到的浓缩液按照体积比1:巧日入95%的乙醇，充分揽拌后，于 4°C静置2-地，进一步沉淀去除杂质； (7) 离屯、:转速为4000;rmp/min，离屯、15-20min，去除沉淀，保留上清液备用； (8) 萃取:将步骤(7)离屯、之后的上清液中加入等体积的乙酸，充分揽拌，静置萃取0.5- 化，重复萃取3次； (9) 蒸干:将步骤(8)得到的萃取液混合，并进行真空旋转蒸发得到浓缩液，蒸发条件 为:真空度为〇.〇7MPa，冷凝水的溫度为-8°C，回收溫度为45°C，得到蒸发浓缩液后进行冷冻 干燥得到了紫背天葵粗皂武;并通过香草醒-硫酸法测定其皂武含量。
[0027] 对比例2: 一种紫背天葵皂武的分离纯化方法，其具体步骤为： (1) 预处理:选取紫背天葵鲜嫩叶，去除杂物、清洗干净后待用； (2) 粉碎:将处理好的紫背天葵叶干燥并粉碎成粉末;72°C真空干燥箱中干燥16 h，粉 碎后过孔径为0.25mm的筛； (3) 脱脂:将步骤(2)制得的紫背天葵叶粉末中加入石油酸，超声波冷浸化后，冷浸过程 中不断揽拌，揽拌速率为13化/min,再静置0.化，然后过滤除去滤液，滤渣挥发干溶剂后得 到紫背天葵叶脱脂品，备用;所述紫背天葵叶粉末与石油酸的质量比为1:9; (4) 粗皂武提取:将步骤(3)脱脂后的紫背天葵叶粉末加入质量分数为55%的乙醇液超 声波提取，提取溫度为50°C，连续提取两次，第一次提取时间为36min，第二次提取时间为 33min;所述紫背天葵叶脱脂粉末与提取液乙醇的质量比为1:35; 巧)提取液浓缩:将步骤(4)中得到的提取液进行真空旋转蒸发得到浓缩液，蒸发条件 为:真空度为0. 〇6MPa，冷凝水的溫度为-8°C，回收溫度为55°C ; (6) 沉淀处理:将步骤巧)得到的浓缩液按照体积比1:巧日入95%的乙醇，充分揽拌后，于 4°C静置2-地，进一步沉淀去除杂质； (7) 离屯、:转速为4000;rmp/min，离屯、15-20min，去除沉淀，保留上清液备用； (8) 萃取:将步骤(7)离屯、之后的上清液中加入等体积的乙酸，充分揽拌，静置萃取0.5- 化，重复萃取3次； (9) 蒸干:将步骤(8)得到的萃取液混合，并进行真空旋转蒸发得到浓缩液，蒸发条件 为:真空度为〇.〇6MPa，冷凝水的溫度为-8°C，回收溫度为45°C，得到蒸发浓缩液后进行冷冻 干燥得到了紫背天葵粗皂武； (10) 纯化:将步骤(9)制得的紫背天葵粗皂武加少量乙醇溶解，利用大孔树脂进行进一 步的分离；大孔树脂经70%的乙醇液、蒸馈水浸泡，清洗后装柱，并W蒸馈水充分清洗层析 柱，上样后W不同浓度的乙醇溶液进行梯度洗脱，20%乙醇洗脱2个柱体积，40%乙醇洗脱3个 柱体积，60%乙醇洗脱2个柱体积； (11) 分析:通过香草醒-硫酸法测定步骤（10)中收集3组中的皂武含量，S1、S2和S3^ 组。
[0028] 经过对实施例1-3和对比例1-2的皂武含量分析，结果见表1，可W看出，本发明所 提供的方法，超声波提取的粗皂武含量较高，能够满足粗皂武在大多数实验中使用;根据所 设定的梯度洗脱，分离出的Ξ组分皂武含量达到92%W上，纯度较高，相较于一般所用的洗 脱方式，具有一定的优越性。
[0029] 表1各实验组的皂武含量结果
下面通过动物实验对紫背天葵粗皂武进行生物性能评价。
[0030] 1.实验动物 C57/BL6小鼠，雄性，体重16-20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证 号：SCXK(京）2011-0008。
[0031] 2.试验方法 将巧7/化6小鼠按体重随机分为4组:实施例1组、实施例2组、实施例3组、正常对照组， 模型组，每组10只。实施例1组、实施例2组、实施例3组W及模型组均为过氧化氨损伤组，小 鼠适应Ξ天后，实施例1组、实施例2组、实施例3组均按照180mg/kg的皂武含量进行灌服，模 型组则灌服等量的蒸馈水。实验期为一周。自由进食和进水，末日隔夜停食不停水，次日晨 断尾、眼眶取血后，颈椎脱白致死，并取所需器官进行各项指标测定。
[0032] 3.试验结果 通过试剂盒对小鼠血液中的SOD、MDA、CAT和GSH-PX进行活性测定，结果见表2。可W看 出，实施例1组到3组与正常对照组之间均没有显著性差异，而模型组与实施例3组和正常对 照组之间均有显著性差异，甚至是极显著性差异，W此说明了紫背天葵皂武能够有效修复 过氧化氨对小鼠机体的损害，即紫背天葵皂武具有较强的抗氧化性。另外，通过对各组小鼠 脾脏、胸腺的重量指数分析，实施例1组到3组与正常对照组之间均没有显著性差异，而模型 组与实施例3组和正常对照组之间均有显著性差异，说明了紫背天葵皂武对小鼠的免疫器 官具有良好的保护作用，进一步说明了紫背天葵皂武能够增强免疫力，可W作为增强免疫 力的药物开发利用。
[QQ33] 表2紫背天葵皂武对小鼠血液中的S0D、MDA、CAT和GSH-PX活性影响_
注：*冲<0.01;冲<0.05。
【主权项】
1. 一种紫背天葵皂甙的分离纯化方法，其特征在于，具体步骤为： 预处理:选取紫背天葵鲜嫩叶，去除杂物、清洗干净后待用； 粉碎:将处理好的紫背天葵叶干燥并粉碎成粉末； 脱脂:将步骤(2)制得的紫背天葵叶粉末中加入石油醚，超声波冷浸，然后过滤除去滤 液，滤渣挥发干溶剂后得到紫背天葵叶脱脂品，备用； 粗皂甙提取:将步骤(3)脱脂后的紫背天葵叶粉末加入乙醇液超声波提取，连续提取两 次； 提取液浓缩:将步骤(4)中得到的提取液进行真空旋转蒸发得到浓缩液； 沉淀处理:将步骤(5)得到的浓缩液加入乙醇，进一步沉淀去除杂质； 离心:离心去除沉淀，保留上清液备用； 萃取:将步骤(7)离心之后的上清液中加入乙醚，充分搅拌，静置萃取； 蒸干:将步骤(8)得到的萃取液混合，并进行真空旋转蒸发得到浓缩液，得到蒸发浓缩 液后进行冷冻干燥得到了紫背天葵粗皂甙； 纯化:将步骤(9)制得的紫背天葵粗皂甙溶解，利用大孔树脂进行进一步的分离； 分析:通过香草醛-硫酸法测定收集各管中的皂甙含量，绘制曲线，根据曲线不同峰值， 混合峰值附近的收集管中的洗脱液，蒸发浓缩并冻干不同峰值的组分。2. 如权利要求1所述的紫背天葵皂甙的分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中干燥粉 碎的具体操作为:在60-75°C真空干燥箱中干燥12-16.5h，粉碎后过孔径为0.21-0.36mm 的筛。3. 如权利要求1所述的紫背天葵皂甙的分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)中在进行 超声波操作时，超声波冷浸2_4h后，再静置0.5-lh，冷浸过程中不断搅拌，搅拌速率为100-150r/min;所述紫背天葵叶粉末与石油醚的质量比为1:8-11。4. 如权利要求1所述的紫背天葵皂甙的分离纯化方法，其特征在于，步骤(4)中所述紫 背天葵叶脱脂粉末与提取液乙醇的质量比为1:25-36;加入质量分数为46-55%的乙醇液超 声波提取，提取温度为45-50°C，连续提取两次，第一次提取时间为35-40min，第二次提取时 间为 30_34min。5. 如权利要求1所述的紫背天葵皂甙的分离纯化方法，其特征在于，步骤(5)中蒸发条 件具体为:真空度为0.02-0.071〇^，冷凝水的温度为-8--10°(：，回收温度为48-55°(：。6. 如权利要求1所述的紫背天葵皂甙的分离纯化方法，其特征在于，在步骤（10)层析操 作之前，通过AB-8大孔树脂进行脱色实验，使用6-8%的乙醇液洗脱2-3个柱体积，最终以75-80%的乙醇回收，进行脱色处理。7. 如权利要求1所述的紫背天葵皂甙的分离纯化方法，其特征在于，步骤(10)大孔树脂 经68-75%的乙醇液、蒸馏水浸泡，清洗后装柱，并以蒸馏水充分清洗层析柱，上样后分别以 水和不同浓度的乙醇溶液进行梯度洗脱。8. 如权利要求1所述的紫背天葵皂甙的分离纯化方法，其特征在于，步骤(10)中的大孔 树脂为AB-8、Diaion HP-HKDiaion HP-20、HPD-450和Amberlite XAD-4。9. 如权利要求8所述的紫背天葵皂甙的分离纯化方法，其特征在于，步骤(10)中的大孔 树脂为AmberIite XAD-4 〇10. 权利要求1所述的紫背天葵皂甙的分离纯化方法所制得的紫背天葵皂甙在制备增 强免疫力药物或保健品中的应用。
【文档编号】A61K127/00GK105920065SQ201610252317
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月21日
【发明人】保泽庆, 吴伟斌, 闫莉
【申请人】肇庆医学高等专科学校