一种异源表达和纯化神经系统转运蛋白gat1的方法
【专利摘要】本发明公开了一种异源表达和纯化神经系统转运蛋白GAT1的方法，该方法主要包括步骤：构建GFP-GAT1融合蛋白杆状病毒表达载体；GFP-GAT1融合蛋白在昆虫细胞Sf9细胞中表达；确认GAT1基因在昆虫细胞中的表达；分离和纯化GFP-GAT1融合蛋白；鉴定分离纯化的GFP-GAT1融合蛋白。本发明的方法可应用于在昆虫细胞中表达高等动植物的膜蛋白，并且获得的蛋白质具有翻译后的修饰作用和生物活性。表达的膜蛋白对于研究其晶体结构和高通量药物筛选有应用价值。
【专利说明】
一种异源表达和纯化神经系统转运蛋白GAT1的方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种异源表达和纯化神经系统转运蛋白GATl (GABA Transporter 1，简称 GAT1)的方法。
【背景技术】
[0002]转运蛋白GAT 1(GABA Transporter I)是神经系统的一类重要转运蛋白，GABA是神经系统中的一种抑制性的神经递质。整个GABA相关的系统与众多人类疾病相关，例如阿尔兹海默症[I]、癫痫[2]、抑郁[3]和不同类型的疼痛[4]。GAT转运蛋白可回收神经突触间隙的GABA，调节GABA在突触间隙的潴留时间和浓度，从而可作为一个重要药物靶点，具有重要的研究价值，其中尤其以该家族蛋白中的GATl蛋白[5] [6]最为重要。GATl蛋白作为膜蛋白，有12个跨膜区域，在膜外区域还有3个糖基化位点，这使得对该蛋白的结构研究非常地困难。为了进一步对该蛋白作为药物靶点进于研究，对该蛋白的分离纯化工作尤其重要。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于，提供一种利用杆状病毒表达系统进行异源表达和纯化转运蛋白GATl的方法，
[0004]根据本发明，具体包括:构建GFP-GATl融合蛋白杆状病毒表达载体；GFP_GAT1融合蛋白在昆虫细胞Sf9细胞中表达；确认GATl基因在昆虫细胞中得到表达；分离和纯化GFP-GATl融合蛋白(免疫亲和层析步骤和分子筛层析步骤)；检测分离纯化的GFP-GATl融合蛋白；鉴定分离纯化的GFP-GATl融合蚩白。
[0005]本发明获得的方法步骤简单，纯化效果好，可应用于在昆虫细胞中表达高等动植物的膜蛋白，并且获得的蛋白质具有翻译后的修饰作用和生物活性。表达的膜蛋白对于研究其晶体结构和高通量药物筛选有应用价值。
【附图说明】
[0006]下面结合附图对本发明作进一步说明:
[0007]图1:构建GFP-GATl融合蛋白表达载体并进一步构建GFP-GATl融合蛋白杆状病毒表达载体。
[0008]图2 =GFP-GATl融合蛋白在昆虫细胞Sf9细胞中表达并确认:A.FACS检测该蛋白在昆虫细胞中的表达；B.荧光显微镜检测该蛋白在昆虫细胞中的表达；C、D、E、F.免疫共沉淀后经过SDS/PAGE，通过Western印迹法、银染法和凝集素印迹法分别检测确定该基因的表达。
[0009]图3:分离和纯化GFP-GATl融合蛋白步骤(免疫亲和层析步骤和分子筛层析步骤)
[0010]图4:经免疫亲和层析步骤后检测的GFP-GATl融合蛋白:银染法和Western印迹法
[0011]图5:经分子筛层析步骤后检测的GFP-GATl融合蛋白:A.分子筛层析结果、B.银染法C.Western印迹法
[0012]图6:改变表面活性剂等缓冲液条件后，经分子筛层析步骡后通过电镜测定GFP-GATl融合蛋白形态。
【具体实施方式】
[0013]以下结合具体实例，对本发明进一步说明。应理解，以下实例今说明本发明而非用于限定本发明的范围。
[0014]构建GFP-GATl融合蛋白杆状病毒表达载体:首先构建GFP-GATl融合蛋白的表达载体，再进一步构建该蛋白的杆状病毒表达载体，可检测。(图1)
[0015]GFP-GATl融合蛋白在昆虫细胞Sf9细胞中表达并确认:先利用GFP-GATl融合蛋白杆状病毒表达载体感染昆虫细胞制备携带该蛋白基因的病毒，该病毒仅针对昆虫细胞有感染，对人体无毒害作用。而用制备好的病毒分批次感染昆虫细胞以制备蛋白。该融合蛋白经表达后有绿色荧光，可通过FACS和荧光显微镜直接检测到。进一步检测也通过免疫共沉淀方法后用Western印迹法、银染法和凝集素印迹法确定。(图2)
[0016]分离和纯化GFP-GATl融合蛋白:建立了方便可行的分离纯化的方法，主要包括免疫亲和层析步骤和分子筛层析步骤(图3)。
[0017]检测分离纯化的GFP-GATl融合蛋白；经免疫亲和层析步骤(其中使用的ant1-GFP抗体为自主制备得到，成本低，易获得)后得到的GFP-GATl融合蛋白，通过银染法和Western印迹法检测，初步纯度较好，仅有少量聚合体(图4);再经分子筛层析步骡后去除聚合蚩白，但可得到的单体蛋白量较少(图5);改变表面活性剂等缓冲液条件后，经分子筛层析步骤后通过电镜测定GFP-GATl融合蛋白形态，大部分可得到GFP-GATl融合蛋白的单体结构(图6)，且产量可达到50-60 μ g每10mL培养液。
[0018]综上所述，本发明获得的方法步骡简单，纯化效果好，可应用于在昆虫细胞中表达其它高等动植物的膜蛋白，并且获得的蛋白质具有翻译后的修饰作用和生物活性。表达的膜蛋白对于研究其晶体结构和高通量药物筛选有应用价值。
[0019]参考文献:
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【主权项】
1.一种异源表达和纯化神经系统转运蛋白GATl的方法，其特征在于该方法包括以下步骤: (1)构建诱导型GFP-GATl融合蛋白表达载体； (2)将GFP-GATl融合蛋白表达载体继续构建Bacmid; (3)GFP-GATl融合蛋白在昆虫细胞Sf9中表达； (4)确证GATl基因在昆虫细胞中得到表达； (5)分离和纯化GFP-GATl融合蛋白； (6)检测分离纯化的GST-CCR5融合蛋白； (7)鉴定分离纯化的GFP-GATl融合蛋白。
【文档编号】C07K1/22GK105886533SQ201410787691
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年12月19日
【发明人】胡静
【申请人】江南大学