一种高效获得海滨雀稗转基因植株的农杆菌介导转化体系及其应用
【专利摘要】本发明一种高效获得海滨雀稗转基因植株的农杆菌介导转化体系及其应用，包括以下步骤：通过高效再生体系获得胚性愈伤受体材料；供体农杆菌菌株的培养；抑菌素头孢霉素浓度的确定；农杆菌转化条件的优化；抗性愈伤的筛选培养和植株再生和转基因植株的分子检测。通过优化农杆菌转化时的菌液浓度、侵染时间、侵染条件、共培养条件等影响因素，建立了海滨雀稗农杆菌介导转化体系。克服了现有农杆菌介导技术难以应用于暖季型草坪草遗传转化的缺陷，建立起了以胚性愈伤为受体材料的高效海滨雀稗农杆菌转化体系。
【专利说明】
一种高效获得海滨雀稗转基因植株的农杆菌介导转化体系及其应用
技术领域
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[0001]本发明属于植物基因工程领域或作物生物工程育种领域。涉及海滨雀稗的组织培养技术、农杆菌介导转化技术及转化植株的分子检测技术，建立高效的获得海滨雀稗转基因植株。
【背景技术】
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[0002]随着经济的发展，草坪作为城市园林绿化重要组成部分，已成为衡量现代化城市环境质量和文明程度的重要标志之一，对草坪草的品质要求也越来越高，而草坪草早期育种主要依赖于杂交育种，诱变育种和定向选择等传统育种方法，这些方法在草坪草育种中作出了重要的贡献，但是其所需的周期长，可利用的遗传材料有限，难以满足现代草坪草育种的要求。随着现代生物技术的发展，转基因技术克服了传统育种的盲目性，大大缩短了育种的周期，在草坪草品种改良中具有巨大的潜在应用价值。
[0003]海滨雀稗(Paspalum vaginatum)是禾本科雀稗属的多年生暖季型草本植物。源于非洲和美洲，喜温暖气候，具匍匐茎和根茎，叶片颜色深绿。耐频繁低修剪，耐盐浓度可达54dS m—1，还具有一定的抗旱性、耐阴性及耐涝性，而且能适应宽范围的PH值(4.0-10.2)，可生长在海滨、沼泽等多种生境，而且具有较强的抗虫性、需肥量低。其草坪质量和坪用特性优于大多数的狗牙根或与其相当，在多重胁迫条件下这种表现尤为明显。另外，海滨雀稗对重金属及其他有毒物质具有较强的代谢和吸收能力，可用于环境的生物修复，在园林绿化、运动场建造及盐渍地改良中应用广泛。多年引种试验结果表明，海滨雀稗在我国华南地区冬季不休眠，少枯黄。在华中地区冬季温度过低时容易受冻害。在长江以南的江浙沪地区可以安全越冬，但在长江以北的广大苏北地区，容易遭受冻害而越冬困难。培育抗寒型海滨雀稗新种质，可以使这一优良的耐盐型暖季型草种的应用范围向北扩展，对华东沿海地区城市绿化和滩涂生态环境建设具有实践意义。
[0004]由于植物抗逆性本身的复杂性和其数量性状位点连锁关系的复杂性使得利用传统育种方法获得优良的抗性品种十分困难，利用转基因技术获得优良抗逆的草坪草品种将是解决这些问题快速、有效的方法之一。
[0005]自1983年利用农杆菌转化系统获得了第一株转基因植株以来，这一技术迅速被广泛应用到植物分子育种中，成为了大多数植物遗传转化最常用的方法之一，与其他转化方法相比，具有以下优点:a转化效率高，可携带大片段DNA;b外源基因常整合为单拷贝，很少会发生甲基化和基因沉默;c稳定遗传，且多数符合孟德尔遗传规律，转基因植株可用于后期育种的中间材料;d整合的外源基因边界序列明确，通常是T-DNA左右界序列；e对实验条件要求不高，价格低廉。
[0006]但是，由于禾本科植物不是根癌农杆菌的天然宿主，导致利用农杆菌进行不同植物遗传转化时，其具体的实施条件和方法也不尽相同。至今，以海滨雀稗胚性愈伤组织为受体的农杆菌介导法转化体系尚未成熟。
【发明内容】
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[0007]本发明一种高效获得海滨雀稗转基因植株的农杆菌介导转化体系及其应用，目的在于克服利用农杆菌介导暖季型草坪草遗传转化困难的问题，通过调整菌液侵染浓度、侵染时间、侵染条件、共培养条件等要素，提供一种适合于农杆菌介导的海滨雀稗遗传转化体系O
【附图说明】
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[0008]附图1海滨雀稗胚性愈伤组织；
[0009]附图2海滨雀稗抗性愈伤组织在继代筛选培养基上筛选；
[0010]附图3海滨雀稗转化后抗性愈伤组织在分化筛选培养基上分化；
[0011]附图4海滨雀稗转PpCBF转基因抗性愈伤组在分化培养基上再生的抗性苗；
[0012]附图5海滨雀稗PpCBF转基因植株；
[0013]附图6海滨雀稗转PpCBF转基因抗性植株PCR鉴定(I:质粒PCR产物;2-7:抗性植株；8:阴性对照植株;M: Marker)；
[0014]附图7海滨雀稗转PvGF14过表达转基因抗性愈伤组在分化筛选培养基上再生的抗性苗；
[0015]附图8海滨雀稗转PvGFH-RNAi表达抗性愈伤组在分化筛选培养基上再生的抗性苗；
[0016]附图9海滨雀稗PvGFl4过表达转基因植株；
[0017]附图10海滨雀稗PvGFH-RNAi表达转基因植株；
[0018]附图11海滨雀稗转PvGF14过表达转基因抗性植株PCR鉴定(M:Marker;I:阴性对照植株;2:质粒PCR产物;3-9:抗性植株)；
[0019]附图12海滨雀稗转PvGFH-RNAi表达转基因抗性植株PCR鉴定(M:Marker; I:阴性对照植株;2:质粒PCR产物;3-5:抗性植株)。
【具体实施方式】
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[0020]I)受体材料准备:以海滨雀稗成熟种子为外植体诱导愈伤组织，发芽培养基为MS+2 A-D 2.0mg L_1+AHC 0.5g L—1;愈伤组织诱导培养基为 MS+2，4_D 3.0mg L_1+CuS0410.0mgL—1;胚性愈伤组织诱导培养基为MS+2，4-D 3.0mg !^+CuSO415.0mg L^+AHC 1.0g L—S继代培养基为MS+2，4-D 3.0mg L^+KT 0.lmg L—S30°C暗培养，每30天继代一次，选取2-3个月的胚性愈伤组织为受体材料，待侵染。
[0021]2)农杆菌供体菌株培养:将含外源基因的农杆菌EHA105菌株进行划板(含10ygL—1卡那霉素+50yg L—1利福平)，28°C暗培养3天，从平板上挑取单菌落，接种到附加抗生素的LB液体培养基中。28°C，200-220rmp，恒温培养至OD6QQ为0.6?0.8，4000rpm、1min、4°C离心集菌后，用含200μπιΟ1 L—1乙酰丁香酮(AS)MS重悬液重悬，待用。
[0022]3)侵染:将上述菌液倒入盛有胚性愈伤组织的200ml无菌培养瓶中，轻轻晃动使菌液与愈伤组织充分接触，置干燥器内抽真空浸泡20min，无菌筛过滤，将侵染后的愈伤置于铺有若干无菌滤纸的培养皿中，上层覆盖小块滤纸，并用镊子轻施压力，充分吸干愈伤表面上多余的菌液，再将愈伤组织转入铺有一层无菌滤纸的含有200μπιΟ1 IZ1AS和0.2Μ山梨醇的继代培养基上，避免粘有菌液的愈伤与培养基的接触面积，减少农杆菌过度繁殖，30°C黑暗共培养4天，用350mg L—1头孢霉素(cef)的无菌水洗涤愈伤三次，过滤后再次用若干无菌滤纸充分吸干。
[0023]4)选择培养:将上一步共培养的愈伤组织转移至含有300mg L—1Cef和10mg L—1潮霉素的愈伤诱导培养基上，30°C暗培养60天，其间继代一次。将存活的愈伤转入到含有250mg !/1Cef^PSOmg L—1 潮霉素的分化培养基(MS+6-BA 8.0mg L_1+KT 0.05mg L-1+CuSO41-Omg L^+NAA 0.5mg L一0上，分化条件为16h光照，8h黑暗，光照度622ymol m-2s-S温度为30°C。待分化出芽后，将长出的小芽转入到不含潮霉素的分化培养基中，待小苗长到苗壮生根。
[0024]5)抗性植株的移栽:将再生植株室温下炼苗3?4d后，将根部冲洗干净，移栽入花盆中，花盆中基质为草炭:砂:壤土 = 1:1:1。
[0025]实施例:
[0026]实施例1:农杆菌介导法将PpCBF基因转入海滨雀稗中获得耐寒转基因植株
[0027]I)受体材料的获得:以海滨雀稗‘ Seaspray，成熟胚为外植体诱导愈伤组织，发芽培养基为MS+2，4-D2.0mg L^+AHC 0.5g L—S愈伤组织诱导培养基为MS+2，4_D 3.0mg L—1+CuSOU0.0mg L—S胚性愈伤组织诱导培养基为MS+2，4-D 3.0mg L_1+CuS0415.0mg L_1+AHC1.0g L—S继代培养基为MS+2，4-D 3.0mg L^+KT 0.lmg L—1JOcC暗培养，每30天继代一次，选取2-3个月的胚性愈伤组织待侵染。
[0028]2)农杆菌工程菌株培养:将含PpCBF基因表达载体的农杆菌EHA105菌株进行划板(含10yg L—1卡那霉素+50yg L—1利福平)，28°C暗培养3天，从平板上挑取单菌落，接种到附加抗生素的LB液体培养基中。28 °C，200-220rmp，恒温培养至OD6qq为0.6?0.8，4000rpm、10min、4°C离心集菌后，用含200ymol L—1乙酰丁香酮(AS)MS重悬液重悬，待用。
[0029]3)侵染:将上述菌液倒入盛有胚性愈伤组织的200ml无菌培养瓶中，轻轻晃动使菌液与愈伤组织充分接触，置干燥器内抽真空浸泡20min，无菌筛过滤，将侵染后的愈伤置于铺有若干无菌滤纸的培养皿中，上层覆盖小块滤纸，并用镊子轻施压力，充分吸干愈伤表面上多余的菌液，再将愈伤组织转入铺有一层无菌滤纸的含有200μπιΟ1 IZ1AS和0.2Μ山梨醇的继代培养基上，30 °C黑暗共培养4天，用350mg L—1头孢霉素(cef)的无菌水洗涤愈伤三次，过滤后再次用若干无菌滤纸充分吸干。
[0030]4)选择培养:将上一步共培养的愈伤组织转移至含有300mg L—1Cef和10mg L—1潮霉素的愈伤诱导培养基上，30°C暗培养60天，其间继代一次。将存活的愈伤转入到含有250mg !/1Cef^PSOmg L—1 潮霉素的分化培养基(MS+6-BA 8.0mg L_1+KT 0.05mg L-1+CuSO41-Omg L^+NAA 0.5mg L一0上，分化条件为16h光照，8h黑暗，光照度622ymol m-2s-S温度为30°C。待分化出芽后，将长出的小芽转入到不含潮霉素的分化培养基中，待小苗长到苗壮生根。
[0031]5)抗性植株的移栽:将再生植株室温下炼苗3?4d后，将根部冲洗干净，移栽入花盆中，花盆中基质为草炭:砂:壤土 = 1:1:1。
[0032]6)转化植株的分子检测:选取抗生植株幼嫩叶片50_100mg，加入液氮充分碾磨，利用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取抗性植株基因组DNA，进行PCR检测，检测的目的片段的引物序列为:
[0033]引物F:5，-ATTTTC TGT CAG TGG AGA GGG TGA-3，，
[0034]引物R:5，-TGTTGT GGC GGG TCT TGA AGT-3，
[0035]共检测抗性植株52株，其中阳性植株23株，转化效率44.23%。
[0036]实例2:农杆菌介导法将PvGF14基因过表达载体和RNAi表达载体转入海滨雀稗中获得转基因植株
[0037]本团队前期通过酵母筛选体系从海滨雀稗表达文库中获得一个具有耐盐功能的14-3-3家族蛋白成员PvGF14，利用本技术体系，完成了PvGF14基因过量表达和RNAi抑制表达载体的海滨雀稗遗传转化，并获得转基因株系，为进一步深入解析海滨雀稗PvGFH耐盐的下游调控机制和耐盐功能解析打下了坚实的基础。具体实施过程如下:
[0038]I)受体材料准备:以海滨雀稗‘ Seaspray，成熟种子为外植体诱导愈伤组织，发芽培养基为MS+2，4-D2.0mg L^+AHC 0.5g L—S愈伤组织诱导培养基为MS+2，4_D 3.0mg L—1+CuSOU0.0mg L—S胚性愈伤组织诱导培养基为MS+2，4-D 3.0mg L_1+CuS0415.0mg L_1+AHC1.0g L—S继代培养基为MS+2，4-D 3.0mg L^+KT 0.lmg L—1JOcC暗培养，每30天继代一次，选取2-3个月的胚性愈伤组织为受体材料，待侵染。
[0039]2)农杆菌供体菌株培养:分别将含PvGF基因过表达载体和RNAi表达载体的农杆菌EHA105菌株进行划板(含10yg L—1卡那霉素+50yg L—1利福平)，28°C暗培养3天，从平板上挑取单菌落，接种到附加抗生素的LB液体培养基中。28°C，200-220rmp，恒温培养至OD6Q0为
0.6?0.8，4000rpm、10min、4°C离心集菌后，用含200ymol L—1乙酰丁香酮(AS)MS重悬液重悬，待用。
[0040]3)侵染:分别将上述2种菌液倒入盛有胚性愈伤组织的200ml无菌培养瓶中，轻轻晃动使菌液与愈伤组织充分接触，置于干燥器内抽真空浸泡20min，无菌筛过滤，将侵染后的愈伤置于铺有若干无菌滤纸的培养皿中，上层覆盖小块滤纸，并用镊子轻施压力，充分吸干愈伤表面上多余的菌液，再将愈伤组织转入铺有一层无菌滤纸的含有200μπκ)1 IZ1AS和
0.2Μ山梨醇的继代培养基上，30°C黑暗共培养4天，用350mg L—1头孢霉素(cef)的无菌水洗涤愈伤三次，过滤后再次用若干无菌滤纸充分吸干。
[0041 ] 4)选择培养:分别将上一步共培养的愈伤组织转移至含有300mg L—1Cef和10mgL—1潮霉素的愈伤诱导培养基上，30°C暗培养60天，其间继代一次。将存活的愈伤转入到含有250mg !/1Cef^PSOmg L—1 潮霉素的分化培养基(MS+6-BA 8.0mg L_1+KT 0.05mg L-1+CuSO41-Omg L^+NAA 0.5mg L一0上，分化条件为16h光照，8h黑暗，光照度622ymol m-2s-S温度为30°C。待分化出芽后，将长出的小芽转入到不含潮霉素的分化培养基中，待小苗长到苗壮生根。
[0042]5)抗性植株的移栽:将再生植株室温下炼苗3?4d后，将根部冲洗干净，移栽入花盆中，花盆中基质为草炭:砂:壤土 = 1:1:1。
[0043]6)转化植株的分子检测:选取抗生植株幼嫩叶片50_100mg，加入液氮充分碾磨，利用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取抗性植株基因组DNA，进行PCR检测，检测的目的片段的引物序列为:
[0044]Hyp-F:GAAAAAGCCTGAACTCACCGC
[0045]Hyp-R:TGCTCCATACAAGCCAACCAC
【主权项】
1.一种高效获得海滨雀稗转基因植株的农杆菌介导转化体系的方法，包括受体材料的准备、农杆菌供体菌株培养、侵染、选择培养和抗性植株的移栽等步骤，其特征在于: (1)活化后的农杆菌菌液浓度的OD6qq值为0.6-0.8，等体积MS重悬液中含乙酰丁香酮200μΜ L-1； (2)侵染时菌液与重悬液比为1:6，抽真空侵染时间为20min，侵染后将愈伤置于底层铺有若干灭菌滤纸的培养皿中，同时用无菌滤纸吸干愈伤上多余的菌液，并用镊子轻压，使其能够被充分吸干，而后转入铺有一层无菌滤纸的含有200μπιΟ1 IZ1AS和0.2Μ山梨醇的继代培养基上，30°C黑暗共培养4天，用350mg L—1头孢霉素的无菌水洗涤愈伤三次，过滤后再次用若干无菌滤纸充分吸干； (3)转化愈伤的筛选培养时抑菌素头孢霉素的使用浓度为300mgL—S (4)再生培养时抑菌素头孢霉素的使用浓度降为250mgL-1O2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:还包括抗性植株的分子检测步骤。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于:发芽培养基为MS+2，4-D2.0mg L^+AHC0.5g L—S愈伤组织诱导培养基为MS+2，4-D 3.0mg !^+CuSO4 10.0mg L—S胚性愈伤组织诱导培养基为MS+2，4-D 3.0mg L_1+CuS04 15.0mg L_1+AHC 1.0g L—S继代培养基为MS+2，4_D3.0mg L^+KT 0.lmg L—1;共培养的培养基为含有200ymol IZ1AS和0.2Μ山梨醇的继代培养基，筛选培养基因为含有300mg L—1Cef和10mg L—1潮霉素的愈伤诱导培养基；分化筛选培养基为含有250mg L—1Cef^KOmg L—1潮霉素的分化培养基。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于:共培养时培养基为MS+2，4-D3.0mg L^+KT0.1mg r1+200ymol IZ1AS和0.2M山梨醇，共培养条件为30 °C黑暗培养4天;选择培养时，分化培养基为MS+6-BA 8.0mg L_1+KT 0.05mg L_1+CuS04 10.0mg L_1+NAA 0.5mg L_1+250mgL一1cef和50mg L—1潮霉素，分化条件为16h光照，8h黑暗，光照度622ymol m—2s—1，温度为30°C。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于:抗性植株的移栽过程中，将再生植株室温下炼苗3?4d后，将根部冲洗干净，移栽入花盆中，花盆中基质为草炭:砂:壤土 = 1:1:1。
【文档编号】C12N15/82GK105886527SQ201610297367
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月9日
【发明人】刘君, 杨志民, 陈煜 , 庄黎丽, 于景金
【申请人】南京农业大学