在转基因植株中表达HaAK基因dsRNA的RNAi载体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于农业生物技术领域；更具体地，本发明具体涉及一种在转基因植株中表达棉铃虫Ha4K的双链RNA (dsRNA)的RNAi载体及其在沉默棉铃虫靶标基因中的应用。
【背景技术】
[0002]在我国，目前对棉铃虫进行喷施杀虫剂仍然是主要防治手段。高毒高残留农药的滥施，不仅导致农作物产品质量下降，棉铃虫抗药性的增加，而且已危及人们的生命安全和健康。因此，生产上迫切需要发展安全、有效、新型的策略来控制害虫种群的危害。
[0003]RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指进化过程中，由双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)诱导同源 mRNA 高效特异性降解的现象(Fire et al.，1998) ο 在线虫中通过喂养表达 dsRNA 的细菌(Kamath et al., 2001 ；Timmons et al.，2001)，或从溶液中吸食dsRNA (Tabara et al.，1998)，或者通过显微注射(Fire et al.，1998)，均能触发干扰基因表达沉默，且RNAi的表型至少可以遗传2代(Grishok et al.，2000)。dsRNA作为细胞内源性基因表达调节物通过降解mRNA发挥作用，已发展成为控制有害病原物的重要工具。
[0004]近年来，利用转基因植物介导的抑制昆虫基因表达的RNAi技术迅速成为国内外研宄热点。Mao等(2007)分离了棉铃虫参与棉毒素(棉酚)解毒的P450基因。用表达相应dsRNA的转基因植物喂食后，棉铃虫P450基因的表达显著降低，对棉酚的耐受性大大减弱。再用含有棉酚的饲料或棉花叶片喂食，这些棉铃虫生长缓慢，甚至死亡。Baum等(2007)使用cDNA基因文库方法从玉米根虫中筛选出290个在昆虫生命活动中发挥必要生物功能的基因作为dsRNA的候选靶标，研宄结果表明最有效的是V型ATP酶(V_type ATPase)，其能够在极低的浓度(1.82ng/cm2)摄食24小时内快速引起根虫的特异RNAi沉默反应。通过对玉米进行遗传转化，获得转基因玉米，使其表达出以玉米根虫关键酶为靶标的dsRNA，结果表明，转基因玉米的根部遭受的破坏要比对照减少50% (Baum et al.，2007)。在植物中表达害虫关键功能基因的双链RNA，通过昆虫取食植物，将dsRNA传递到昆虫体内，能够特异地抑制昆虫防御基因的表达，使RNA干扰抗虫植物在农业生产中的应用成为可能。
[0005]在昆虫中，那些编码重要蛋白的功能基因是RNAi很好的靶标。在植物中表达针对这些基因的双链RNA (dsRNA)，通过昆虫取食植物时，将双链RNA传递到昆虫体内，能够特异地抑制相应昆虫关键功能基因的表达，从而导致昆虫的生长和发育缺陷，甚至杀死昆虫。
[0006]本发明克隆棉铃虫能量代谢的关键酶基因一一精氨酸激酶基因HaAK，以其为靶标基因，利用Gateway技术，以植物RNAi表达载体pANDAHK35为基础，构建出针对于靶标基因HaAK的植物遗传转化的RNAi载体，在农杆菌的介导下，培育出表达HaAK的dsRNA的转基因拟南芥，棉铃虫取食转基因拟南芥之后，对一龄幼虫致死率高达55%，对三龄幼虫的生长发育有明显的抑制作用，且取食转基因拟南芥后棉铃虫体内HaAK基因mRNA转录水平明显的低于对照。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于针对棉铃虫对农业作物严重的危害情况，提供选取棉铃虫能量代谢关键基因-精氨酸激酶基因HaAK为RNAi的靶标基因来防治棉铃虫。
[0008]本发明的第一方面是提供一种在转基因植株中表达棉铃虫HaAK的dsRNA的RNAi载体。
[0009]本发明的另一方面是提供基于针对HaAK靶标基因，利用植物介导的RNAi对棉铃虫幼虫生长发育的影响。
[0010]本发明的技术方案在于采用一种在转基因植株中表达棉铃虫HaAK的dsRNA的RNAi载体，该载体是由HaAK片段以正反两个方向插入植物表达载体pANDA35HK中构建而成，其中两个HaAK基因片段之间包含一fgus linker fragment。
[0011]所述的植物表达载体为pANDA35HK质粒；所述质粒载体包含植物筛选标记基因NPT-1I与HPT，所述的HaAK是棉铃虫的精氨酸激酶基因，其中，HaAK基因片段的正反向片段均为从棉铃虫中克隆获得的HaAK的全长cDNA序列。
[0012]本发明的技术方案还在于采用一种含有棉铃虫HaAK基因RNAi载体的宿主细胞，所述的宿主细胞包括大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或者植物细胞。
[0013]本发明的技术方案还在于采用一种棉铃虫HaAK基因RNAi载体在沉默靶标基因表达中的应用，从含有棉铃虫HaAK基因RNAi载体的大肠杆菌细胞提取质粒，然后转化农杆菌细胞，通过农杆菌侵染拟南芥，并最终获得转基因植株。通过将转基因植株与野生型植株进行对比，结果显示，棉铃虫取食转基因拟南芥之后，对一龄幼虫致死率高达55 %，对三龄幼虫的生长发育有明显的抑制作用，且取食转基因拟南芥后棉铃虫体内HaAK基因mRNA转录水平明显的低于对照。
【附图说明】
[0014]图1为质粒pANDA 35HK_dsHaAK的示意图。
[0015]图2为转基因拟南芥植株的检测。图中，M表示是Marker ; I表示是对照植株；2_8表示是转基因阳性植株。
[0016]图3为转基因植株表达HaAK dsRNA的Northern blot检测。I表示是对照植株；
2-9表示是转基因阳性植株。Actin为内参基因。
[0017]图4饲喂转基因植株对一龄棉铃虫幼虫的致死率。I龄棉铃虫幼虫，以正常的拟南芥为对照，以不同转基因株系AtdsHaAK-6，AtdsHaAK-8 and AtdsHaAK-1l为实验组饲喂1-3天对棉铃虫的致死率。
[0018]图5饲喂转基因植株对三龄棉铃虫幼虫体重的影响。以正常的拟南芥为对照，以不同转基因株系AtdsHaAK-6，AtdsHaAK-8 and AtdsHaAK-1l为实验组饲喂3龄棉铃虫幼虫1-5天其体重的增加量的影响。
具体的实施方式
[0019]实施例1，HaAK基因的克隆:
[0020](I)取棉铃虫1-2头，用TRIzol法提取总RNA ；
[0021](2)合成cDNA第一条链；
[0022](3)从棉铃虫转录组中获取基因片段序列，在NCBI数据库中进行同源性比对之后，根据其序列利用Primer premier 5.0软件设计F1/R1 ；
[0023](4)Fl:5' -ATGGTGGACGCCGCAACAAT-3'；
[0024](5)R1:5, -TTACAGCGACTTCTCAATT-3'。
[0025](6)以步骤⑵合成的棉铃虫cDNA第一条链为模板，以(4)、(5)中引物进行RT-PCR 扩增。RT-PCR 反应程序为:94°C 变性 5min ;35 个循环(94 °C lmin，56°C lmin，72 °C lmin) ；72 °C 1min。反应体系(25 μ L):10XEx PCR Buffer 2.5 yL,2.5mM dNTPMixture 2.0 μ L，10 μ M 上游引物 FlI μ L，10 μ M 下游引物 RlI μ L，cDNA 模板，2 μ L，5U/ μ LEx Taq 0.5 μ L? ddH20 16 μ L。
[0026](7)PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离，用胶回收试剂盒回收纯化目的片段。
[0027](8)将步骤(7)回收纯化的目标片段与PMD18-T质粒相连接，反应体系如下:2XBuffer5.0 μ 1、pMD18_T Easy Vector 0.5 μ I, PCR 产物 3.5 μ 1、T4DNA 连接酶 1.0 μ I，上述成分混匀后16°C连接过夜，获得pMD18-HaAK质粒。连接产物转化大肠杆菌ToplO感受态，步骤如下:取一管_70°C保存的感受态细胞，冰盒上融化，加入10 μ I连接产物，轻摇混匀，冰浴30min ;42°C热激90s后迅速置冰浴2min，加入400 μ I液体LB，37°C 150rpm振荡培养45min ;取200 μ I培养液均匀涂布于涂有氨苄青霉素(100mg/L)平板上，37°C静置培养12ho挑取平板上长出的单克隆，在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB液体培养基中37°C、220rpm培养16h，经引物F1/R1进行PCR鉴定为阳性克隆后，全自动序列仪进行测序(由上海生工生物工程技术服务有限公司完成)，获得的棉铃虫精氨酸激酶基因的核苷酸序列登录 GenBank (登录号:⑶937510)。
[0028]实施例2，RNAi植物表达载体的构建
[0029](I)以克隆获得的棉铃虫HaAK基因序列为基础，设计特异性正向引物F2:5 ' -CACCATGGTGGACGCCGCAACAAT-3 '(在特异性引物Fl加上四个碱基)，以Rl:5' -TTACAGCGACTTCTCAATT-3 '为反向引物，用 Prime STAR TM HS DNA 聚合酶对质粒pMD-HaAK进行PCR扩增。扩增反应体系为(总体系25 μ L):5 XPrime STAR酶0.25 μ L，5 X Prime STAR Buffer 2.5 μ L，dNTPs 2 yL,引物 F2/R1 各 I μ L，模板 pMD 18-HaAK0.5 yL,补 ddH20 至 25 yL。扩增条件为:94 °C 5min，30 个循环(94 °C lmin, 5