南方根结线虫mif基因在降低线虫对植株致病性中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及南方根结线虫MIF基因在降低线虫对 植株致病性中的应用。
【背景技术】
[0002] 根结线虫是专性内寄生植物病原线虫，可寄生超过3000种植物，对农业生产造成 严重危害，每年产生巨大经济损失，被称为世界上最具破坏性的植物病原物。在我国以南方 根结线虫（M.incognita)分布最广，近几年来，我国农业种植结构不断调整，设施蔬菜栽培 面积迅速发展，为南方根结线虫的发生、发展提供了适宜的环境，土壤中的南方根结线虫量 快速增加，严重威胁我国农业生产安全。轮作、生物熏蒸、生物防治及化学农药是防治线虫 的主要方法，但是存在防治效果差、污染环境等问题。巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migrationinhibitoryfactor，MIF)，是1966年发现的第一个可溶性淋巴因子，它可吸引 巨噬细胞在迟发型变态反应中浸润、聚集，还可促进巨噬细胞增生以及刺激巨噬细胞分泌 多种细胞因子。MIF作为一种潜在的促炎症细胞因子，是天然免疫和获得性免疫中的关键 调节元件，通过多种途径促进免疫应答和炎性反应。哺乳动物（如人、小鼠、大鼠、牛等）的 MIF蛋白氨基酸序列有90%的同源性，而且在鸡、鱼、蜱、寄生虫、蓝细菌等物种间有同源性 和保守性。
[0003] RNA干扰（RNAi)是研宄植物线虫的一种重要的反向遗传学手段。通过人工合成靶 基因的dsRNA或siRNA，并溶解在线虫浸泡缓冲液中，在章鱼胺、间苯二酚等神经调节剂作 用下，寄生前二龄幼虫摄取溶液中的dsRNA或siRNA，从而引发内源基因的RNA干扰，称为体 外RNAi技术（invitroRNAi);通过构建线虫靶基因的RNAi载体，并遗传转化寄主植物， 使线虫在寄生取食时，从寄主植物细胞中吸取dsRNA或siRNA，从而引发内源基因的RNA干 扰，称为体内RNAi技术（invivoRNAi)。RNAi不仅有助于分析植物线虫的基因功能，而且 可以评价目标基因作为抗线虫靶标的应用潜力。
[0004] 尽管已经克隆了南方根结线虫大量与寄生致病相关的基因，但目前只有少数基因 的作用机制被详细研宄。大量研宄表明，植物寄生线虫分泌的效应蛋白在与寄主互作致病 过程中发挥重要作用。多数推测的寄生致病相关基因在线虫食道腺、体壁、口器等部位表 达，编码产生分泌蛋白，再经由口针穿刺、注射或直接由体壁分泌进入植物细胞内，发挥寄 生致病相关的复杂功能，大多数的研宄集中在食道腺分泌的效应蛋白，但由线虫体壁分泌 并参与免疫调节的相关寄生致病效应蛋白的研宄结果不多。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供南方根结线虫MIF基因在 降低线虫对植株致病性中的应用。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
[0007]本发明提供了南方根结线虫MIF基因在降低线虫对植株致病性中的应用，所述 MIF基因为如SEQIDNo. 1所示的AMIF基因、如SEQIDNo. 2所示的BMIF基因或如SEQIDNo.3所示的CMIF基因。
[0008] 所述BMIF基因编码的氨基酸序列如SEQIDNo. 4所示。
[0009] 进一步地，所述应用为通过抑制线虫MIF基因的表达，降低线虫对植物植株的为 害。
[0010] 本发明还提供了南方根结线虫MIF基因在培育抗南方根结线虫转基因植株中的 应用，所述MIF基因为如SEQIDNo.1所示的AMIF基因、如SEQIDNo.2所示的BMIF基因 或如SEQIDNo.3所示的CMIF基因。
[0011] 进一步地，所述应用为将BMIF基因编码区的l-329bp或与其相似性大于90 %的核 苷酸序列作为RNAi干扰片段，构建RNAi干扰载体，通过农杆菌介导法获得抗南方根结线虫 的转基因植物。所述构建的RNAi干扰载体，可沉默根结线虫的AMIF、BMIF和CMIF基因。
[0012] 更进一步地，所述应用为将BMIF基因编码区的l-329bp作为RNAi干扰片段，按 正反方向构建于PSAT5干扰载体Intron两侧，再将含有BMIF正反向干扰片段和Intron 区的大片段用Xbal/Kpnl双酶切从pSAT5载体上切下，连接于psuper植物表达载体，构建 psuper-BMIF-Ri植物转基因RNAi干扰载体，通过农杆菌介导法获得抗南方根结线虫的转 基因植物，其防治根结线虫的效果在70%左右。
[0013] 本发明还提供了南方根结线虫BMIF基因，所述BMIF基因的核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
[0014] 本发明还提供了用于克隆所述BMIF基因的引物，所述引物包括：
[0015]上游引物BMIF-superF :5'-ATGCCAATTTTACAAGTT-3'；
[0016]下游引物BMIF-superR :5'-TTATCCTTTTAATTTCCCATC-3'。
[0017] 本发明还提供了克隆所述BMIF基因的方法，具体为：
[0018] 取接种南方根结线虫45-60天的番茄根系，洗净后挑取卵块在无菌水中连续孵化 3天，离心收集每天孵化的新鲜的二龄幼虫；将洗净的根经过酶消解，分离、收集不同虫态 的线虫；液氮冷冻，组织研磨器破碎样品，用磁珠法提取mRNA，反转录得到南方根结线虫二 龄幼虫cDNA，以该cDNA为模板，利用权利要求7所述引物进行PCR扩增。
[0019]进一步地，所述PCR扩增体系为：ddH20 28 y L，5XPhusion HF buffer 10 y L， 2.5mM dNTPs 4yL,BMIF-superF 2. 5yL,BMIF-superR2. 5yL, cDNA 1. 0yL,Phusion DNA polymerase (NEB) 0? 5 y L，DMS01. 5 y L,总体系50 y L〇
[0020] 进一步地，所述PCR扩增条件为：98°C预变性30s;98°C变性10s，58°C退火30s， 72. 0°C延伸lmin，共30个循环；72. 0°C保温lOmin后终止反应。
[0021] 本发明的有益效果在于：
[0022] 本发明首次发现南方根结线虫BMIF基因，有两个拷贝串联排列，并且在线虫体壁 表达。并进一步通过实验证实了其为线虫体壁分泌并具有参与免疫调节功能的寄生致病相 关效应蛋白。沉默该基因防治根结线虫的效果达70%左右，为培育抗南方根结线虫转基因 植株的研宄提供了靶标。为寻找防治根结线虫的新靶标并制定防治新策略提供了理论依 据。
【附图说明】
[0023] 图1为三种不同MIF基因编码区序列比对。
[0024] 图2为BMIF基因在各虫态的相对表达量分析。
[0025] 图3为BMIF基因正反义探针引物PCR扩增；
[0026] 其中：1:未标记正义探针；2 :DIG标记正义探针；3:未标记反义探针；4 :DIG标记 反义探针。
[0027] 图4为BMIF基因的线虫组织原位杂交。
[0028] 图5为构建BMIF体内RNAi干扰载体及双酶切验证Xbal和Kpnl。
[0029] 图6为Re