水稻植株形态建成调控基因pth1及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆一个同时影响水稻株高、分蘖、抽穗期及穗发育，进而影响水稻植株整个形态特征的基因PTH1(Panicle?size,Plant?height,Tiller?number,Days?to?heading)，以及利用转基因互补实验鉴定该基因的功能；同时还涉及利用该基因产物对水稻植株形态进行调控，用以获得农作物的理想株型，提高水稻的产量。
【专利说明】水稻植株形态建成调控基因PTH1及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆一个同时影响水稻株高、分蘖、抽穗期及穗发育，进而影响水稻植株整个形态特征的基因PTHl (Panicle size, Plant height, Tiller number, Days to heading)，以及利用转基因互补实验鉴定该基因的功能；同时还涉及利用该基因产物对水稻植株形态进行调控，用以获得农作物的理想株型，提高水稻的产量
【背景技术】
[0002]水稻是我国重要的粮食作物之一，也是单子叶植物的理想模式植物。从植株形态组成来看，株高、分蘖等对于水稻理想株型的建成具有重要影响。适宜的株高能使水稻单株获得最大产量的同时保持植株的挺拔，Sdl基因作为20世纪60年代的水稻绿色革命基因，在水稻产量的突破和提高中起到了决定性的作用；分蘖数尤其是有效分蘖数在决定水稻产量形成中具有决定性作用。理论上，水稻品种在一定生育期内，形成有效分蘖越多，产量越高；但已有研究表明，适量的有效分蘖更有利于水稻高产，使得水稻生长的中后期能有更多的“源”能“流”入以稻穗为目的地的“库”中，而不是用于形成过多的分蘖。目前已克隆的IPAl理想株型基因就调节植株具有稍高于一般品种的株高、较少的分蘖和大穗，具有明显的增产效应；同时，还有Ghd7、Ghd8/DTH8等同时控制水稻株高、抽穗期和穗粒数的基因也被克隆。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的 技术问题是提供一种能影响水稻植株形态建成的蛋白质及其基因，以及由此获得的转基因植物细胞，和利用该基因对水稻株型进行改造的方法。
[0004]为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻植株形态建成调控基因PTHl编码的蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO:2所不的氣基酸序列。
[0005]作为本发明的水稻植株形态建成调控基因PTHl编码的蛋白质的改进:上述氨基酸序列还包括在SEQ ID No:2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。
[0006]本发明还提供一种编码上述蛋白质的基因，该基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。
[0007]作为本发明基因的改进:上述核苷酸序列还包括在SEQ ID No:1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因或衍生物。
[0008]本发明还同时提供了含有上述基因的质粒以及含有上述基因的植物表达载体。
[0009]本发明还同时提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述基因序列。该宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。
[0010]本发明还同时提供了改良水稻植株形态的方法:包括用具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。[0011]进一步具体说明:本发明的目的是提供一种从水稻突变体Pthl中克隆的新基因PTHl，如图7和SEQ ID No:1所示的DNA序列，也包括与SEQ ID No:1所示的DNA序列至少有70%同源性的基因序列。本发明中的SEQ ID No:2和图8所示的蛋白质属于一类表达蛋白，其中进行一个或几个氨基酸的替换、插入或缺失所获得的功能类似物。另外，也包括在SEQ ID No:1中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。[0012]本发明的另一个目的是提供一种用PTHl基因进行高效的植物转化的方法，具体地说，本发明提供了具有SEQ ID No:1和图7所示的序列的基因或基因部分片段的载体，其中，如图4所示的pCAMBIA1300-PTHl，该载体可以表达有上述核苷酸序列编码的多肽或其同源类似物。[0013]本发明还提供了一种利用植物表达载体转化植物细胞影响水稻植株形态的方法。具体地是利用植物表达载体转化植物细胞以影响农作物株高、分蘖、抽穗期及穗部形态的方法。[0014]实现本发明的具体技术步骤如下:[0015]一、突变体pthl的分离和遗传分析:[0016]本发明的同时影响水稻株高、分蘖、抽穗期及穗部形态的突变体pthl来自粳稻品种日本晴(Nipponbare)组培诱变。通过与野生型的正反交实验,证明该突变体受隐性单基因控制，如图1所示。[0017]二、图位克隆 PTHl:[0018]DPTHl的初步定位:[0019]为了分离PTHl基因，本发明首先组建了一个定位群体，由pthl与籼稻品种台中本地I号杂交配组获得F2定位群体，再通过图位克隆的方法，利用STS、SSR等分子标记对PTHl位点进行初步定位，将其初步定位在第I染色体上，并介于WY7和WE20两STS标记之间，见图2。[0020]2) PTHl的精细定位:[0021] 通过对WY7和WE20两个标记之间的BAC序列分析，发展新的SSR、STS标记将PTHl精确定位于BAC 0SJNBa0052012上、WY4和WY5标记之间24.5kb范围之内(图3)，通过分析此区段开放阅读框(ORF)推测候选基因。[0022]3) PTHl基因的鉴定和功能分析:[0023]通过转基因技术，结果表明本发明获得了使突变体恢复正常表型的转基因水稻(图5、6)，证明了本发明正确克隆了 PTHl基因(图7)，氨基酸序列分析表明PTHl编码一个功能未知的表达蛋白(图8)。[0024]水稻植株形态是当前超高产水稻育种关注的重点，通过朔造水稻理想株型来提高生物合成量而实现水稻产量的提高，水稻理想株型的构成因子包括:株高稍高于一般品种、较少的分蘖、较粗的茎杆即较强的抗倒伏能力和较多的第一和第二次枝梗等。而PTHl基因能同时影响水稻株高、分蘖、抽穗期及穗发育，该基因的克隆和应用，对水稻株型的改良具有重要意义。[0025]综上所述，本发明利用水稻植株形态突变体，通过图位克隆技术首次在水稻中克隆到了 PTHl基因，通过对PTHl基因的功能解读，进一步阐明了植物特别是禾本科植物形态建成的遗传机制及其作用机理，为水稻株型育种，创建水稻新种质打下基础。本发明的基因影响水稻株高、分蘖、抽穗期及穗发育，进而影响水稻植株整个形态特征。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0027]图1是突变体pthl与野生型材料的表型图；
[0028]图2是PTHl基因在水稻第I染色体上的初步定位图；
[0029]图3是PTHl基因的精细定位图；
[0030]图4 是 pCAMBIA1300-PTHl 载体图谱；
[0031]图5是功能互补实验T1转基因水稻植株的表型图；
[0032]图6是pthl与转基因互补T1代水稻植株的穗部表型对比图；
[0033]图7是PTHl基因的DNA核苷酸序列；
[0034]图8是PTHl基因编码的氨基酸序列。
【具体实施方式】
[0035]实施例1:
[0036]1、水稻材料:
[0037]水稻(Oryzasativa L.)突变体 pthl (Panicle size, Plant height, Tillernumber, Days to heading)的原始野生型为粳稻品种日本晴(Nipponbare)。
[0038]水稻(Oryza sativa L.)突变体pthl的获得过程具体如下:
[0039]我们利用日本晴幼胚诱导的愈伤组织，经过诱导培养基培养3周后，挑选生长旺盛的愈伤用作转化的受体。用含有双元质粒载体的EHA105菌株侵染日本晴愈伤，在黑暗、25°C条件下共培养3天后,在含有40mg/LHygromycin的筛选培养基上培养。筛选抗性愈伤在含有50mg/L预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上，在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。在大田转基因圃中，我们发现一例株高变矮、分蘖增多、抽穗期延迟及穗部发育异常的材料，经过验证该表型并不是由外源基因的导入造成。该材料经多代自交种植，性状能稳定遗传。因此，将这种同时表现出“株高变矮、分蘖增多、抽穗期延迟及穗部发育异常“的材料命名为Pthl (Panicle size, Plantheight, Tiller number, Days to heading)。
[0040]将突变体pthl与野生型进行正反交，即以突变体pthl为母本，日本晴为父本进行杂交；同时以日本晴为母本，Pthl为父本进行杂交。正反杂交F1代植株均表现出正常的类似日本晴的表型，说明该性状受隐性基因控制。正反杂交的F1代植株自交获得的&群体中，表现出日本晴表型的单株与表现出Pthl表型的单株遗传分离比符合3:1，说明该性状受单基因控制。由以上分析可知，该突变体表型受隐性单基因控制。
[0041]2、分析和定位群体:
[0042]纯合的pthl突变体和籼稻品种台中本地I号进行杂交，F1代自交，得到8247株F2群体；并从8247株F2群体中选出1888株具有pthl突变表型的个体(即表现为矮杆，多蘖，抽穗期迟，穗部发育异常；属于隐性个体)作为定位群体。在灌浆期每株取I克左右的嫩叶，用来提取总DNA。[0043]3、SSR和STS标记定位PTHl基因
[0044]采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。取大约0.2g水稻叶片，经液氮冷冻，在直径5cm的小研钵中磨成粉状，转移到1.5ml离心管里提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于200 μ I超纯水中。每一个PCR反应用2 μ I DNA样品。
[0045]PTHl基因的初步定位=Wpthl与台中本地I号杂交组合的F2群体1888个隐性个体中随机选取147个隐性个体，组成的小群体进行SSR分析，根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各条染色体上的SSR引物，根据已知的反应条件进行PCR扩增，具体如下:
[0046]与目标基因连锁的SSR引物为:
[0047]RM3482F:GCCGCTAATGTTGTTGTCAAGC,
[0048]RM3482R:CGAAGCCAACGTAGTCCAATCC ；
[0049]PCR 反应体系为:20ng/ul 水稻基因组 DNAlul, 10XPCR Buffer2.0ul, 25mMMgCl22.0ul, 2mM dNTP2.0ul, IOuM 引物 2.0ul (即上述引物各 Iul )，5U/ul Taq DNA 聚合酶
0.3ul, ddH2010.7ul，总体系 20ul。
[0050]PCR扩增条件具体为:94°C预变性4分钟；94°C变性40秒，55°C退火40秒，72°C延伸40秒，35个循环；72°C补齐10分钟；
[0051]经5%琼脂糖凝胶电泳分离和溴化`乙啶(EB)染色，检测PCR产物的多态性，将PTHl初步定位在第I号染色体长臂上STS标记WY7和WE20之间。
[0052]PTHl基因的精细定位:利用pthl与台中本地I号组合的F2群体中共计1741株隐性个体，在初定位的基础上继续设计STS标记，最终将PTHl精确定位于BAC 0SJNBa0052012上、WY4和WY5标记之间24.5kb范围之内。
[0053]STS标记引物序列为:
[0054]WY4F: 5，-TCAACAACTGCTATAAGCGAAAG-3，
[0055]WY4R:5’-GCTAGCTCCAAGGTCTCATCT-3’ ；
[0056]WY5F: 5，-ACTACACTAGGGCTAGGGATC-3，
[0057]WY5R: 5 ’ -TTTAGACCAGCGAATGGCAAG-3 ’.[0058]具体如下:
[0059]PCR 反应体系为:20ng/ul 水稻基因组 DNAlul, IOXPCR Buffer2.0ul, 25mMMgCl22.0ul, 2mM dNTP2.0ul, IOuM 引物 2.0ul, 5U/ul Taq DNA 聚合酶 0.3ul，ddH2010.7ul，总体系20ul。
[0060]PCR扩增条件具体为:94°C预变性4分钟；94°C变性50秒，55°C退火50秒，72°C延伸50秒，38个循环；72°C补齐10分钟。
[0061]产物检测:在含有0.5%Ug/Ul EB的5.0%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并拍照记录结果。
[0062]4、基因预测和比较分析:
[0063]根据精细定位的结果，在24.5kb范围内根据Rice Automated Annotation System(http://RiceGAAS.dna.affrc.g0.jp)的预测,发现在此区间内共有2个候选基因,根据两标记剩余的重组个体数及共分离标记，我们设计了 2个基因的测序引物，采用PCR方法分别从pthl和野生型品种基因组中扩增出这两个候选基因进行测序分析。具体如下:
[0064]目标基因测序引物的序列:
[0065]SlF:TCTGCTGTTGCGACCTGGA
[0066]SIR:AGAGCAGCAACTGTGGGAAGG
[0067]S2F:CGAAGACTGCCCATTGCTC
[0068]S2R:ACGGCTTCAGTTCTGGATTG
[0069]S3F:GGTGGATAACTCCCAATGCT
[0070]S3R:GGAGAAATAAACTTGTGCGAGATA
[0071]S4F:AGTAAGGTAAAGCCTGGCAAAT
[0072]S4R:TAGCGGTTCAATACGGTAAGTT
[0073]S5F:ATCCTTTCAACAGAGAACAAC
[0074]S5R:CTTGAGAAACAGGTGAGATAAT
[0075]S6F:CAAAAGAAAAACTGTAGTGAGAAC
[0076]S6R:GCCCTATGCCAAACTATGT
[0077]S7F:GCGATTAAGATTTCGGACG
[0078]S7R:TGGTCAATCGGAAGTCAA
[0079]S8F:TTGAGCGGACAGTAGGA
[0080]S8R:CTTCCCACTTCTCAACCT。
[0081]PCR 扩增体系:20ng/ul 水稻基因组 DNAlul, 10XPCR Buffer2.0ul, 25mMMgCl22.0ul, 2mM dNTP2.0ul, IOuM 引物 2.0ul, 5U/ul Taq DNA 聚合酶 0.3ul，ddH2010.7ul，总体系20ul。
[0082]PCR扩增条件:94°C预变性4分钟；94°C变性I分钟，55°C退火I分钟，72°C延伸I分钟，40个循环；72°C补齐10分钟。
[0083]发现其中I个基因的基因组DNA片段中，突变体pthl扩增的产物与野生型品种比较有26个碱基缺失。将此结果重复验证三次，发现突变体pthl基因与野生型比较都存在26个碱基缺失。根据BAC克隆0SJNBa0052012序列的基因注释信息(RiceGAAS)，预测此基因编码一个表达蛋白。
[0084]此基因具有SEQ ID No:I所不的核昔酸序列。
[0085]备注说明；SEQ ID No:1中下划线标注(图7中灰色阴影标注)的为编码570个氨基酸(SEQ ID No:2)对应的核苷酸，即基因的外显子。
[0086]实施例2:
[0087]植物转化:
[0088]将BAC克隆0SJNBa0052012用SacI和EcoRI完全酶切，电泳分离后，割取9.6kb的DNA片段连接到pCAMBIA1300中，该克隆覆盖了整个目的基因ORF的基因组区域，还包括ATG上游2.2kb序列和TAG下游800bp序列。通过电击的方法将质粒转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105中，然后通过农杆菌介导转化水稻愈伤。我们利用突变体幼胚诱导的愈伤组织，经过诱导培养基培养3周后，挑选生长旺盛的愈伤用作转化的受体。用含有双元质粒载体的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25°C条件下共培养3天后,在含有40mg/LHygromycin的筛选培养基上培养。筛选抗性愈伤在含有50mg/L预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上，在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。对转基因Ttl和T1代植株进行鉴定和连续的观察，发现植株形态，包括株高、分蘖、抽穗期和穗部形态都恢复了正常。
[0089]实施例3:
[0090]将本发明所述的基因导入水稻突变体pthl中，最终所得的转基因水稻的“株高、分蘖、抽穗期及穗发育”与对照水稻品种日本晴相比，均恢复到正常状态。
[0091]以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。有必要指出，本发明不局限于以上实施例，对于本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护 范围。
【权利要求】
1.水稻植株形态建成调控基因PTHl编码的蛋白质，其特征在于:该蛋白质具有SEQIDNo: 2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的水稻植株形态建成调控基因PTHl编码的蛋白质，其特征在于:所述氨基酸序列还包括在SEQ ID No:2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。
3.编码如权利要求1或2所述蛋白质的基因，其特征在于:该基因具有SEQID No:l所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于:所述核苷酸序列还包括在SEQID No:l所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。
5.一种含有权利要求3或4所述基因的质粒。
6.一种含有权利要求3或4所述基因的植物表达载体。
7.一种宿主细胞，其特征在于:该宿主细胞含有权利要求3或4所述的基因序列。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于:该宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。
9.如权利要求3或4所述基因的用途，其特征在于:用于构建转基因水稻，所述转基因水稻的植株形态得以改良。
【文档编号】A01H5/00GK103613651SQ201310602467
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月21日 优先权日:2013年11月21日
【发明者】郭龙彪, 钱前, 胡时开, 吴立文, 刘坚, 高振宇, 胡江, 董国军, 曾大力 申请人:中国水稻研究所