专利名称：水稻休眠芽繁育再生植株的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用水稻休眠芽获得再生植株的方法，属于农业生物技术领域，更具体地说属于作物育种技术领域。
背景技术：
水稻(Oryza sativa.L)是仅次于玉米和小麦的世界第三大粮食作物，世界上有一半以上的人口是以稻米为主食。我国是世界水稻生产和消费大国，水稻栽培面积占粮食作物种植面积的1/3，产量占粮食总产量的近1/2，人均年消费稻米150kg以上，因此水稻生产事关国家粮食安全大局。随着现代水稻生产技术的不断完善，在稻米产量和质量的提高上都取得了举世瞩目的成果，极大的缓解了粮食危机的压力。但自20世纪末以来，全球人口一直处于高速增长的态势，致使现在开始出现消费量大于生产量，库存数量萎缩、价格大幅攀升。因此面对如此严峻的人口问题，粮食生产任重而道远。要保障粮食产量稳步增长，就需要通过各种途径不断发掘新的种质资源，开拓新的生产技术，寻求经济而高效的生产模式。因此实现这一目标，就需在水稻的生产链上取得新的突破。野生稻资源的开发利用、再生稻的大面积推广、单基因控制的水稻雌性不育突变材料的发现和深入研究，并以此探寻的新杂交育种模式等一系列研究都为我们提供了良好的发展思路。水稻的繁殖也像其它植物一样依赖于有性繁殖和无性繁殖。有性繁殖作为其最主要的繁殖方式，对水稻的生产及育种都起着决定性作用。水稻雄性不育(malesterility, MS)和水稻雌性不育(femalesterility, FS)的利用及发展,杂交水稻是保障粮食安全的重要举措。目前，在杂交水稻育种中，发展和利用的技术体系主要有三系法和两系法，虽然这些体系都已较为成熟，但尚存一些欠缺，主要体现在以下几点:①父母本分行或分区种植，开花时须人工赶粉辅助授粉，收获时父母本人工分收，费时费工制种产量低，不能很好解决种子混杂问题不适宜规模化、机械化操作等。基于此，可见杂交育种过程也需要耗费巨大的物力、人力以及漫长的育种周期，那么可否寻求一种以F1为材料，通过无性繁殖技术的手段，快速获得大批量的杂交株的制种模式？随着水稻雌性不育在育种中的应用，利用雄性不育(MS)和雌性不育(FS)，构建“MS+FS”的制种模式，即制种时的花粉供体为雌性不育系，也有望在不久后继三系和两系杂交的又一育种模式进行大规模的推广和应用。但问题在于其父本是雌性不育系，不能正常结实以获得大批量的雌性不育株。因此，这种模式能否得到成功应用，取决于能否获得大量的雌不育株。还有一些特殊稀贵材料(如单体和三体以及多倍体、自交不亲和等材料)，由于自身的特点不能通过有性生殖的方式进行繁殖或很难繁殖。无性繁殖技术以及基因工程等是目前如何获得这些特殊材料最常用的方法途径。
植物的无性繁殖主要有扦插、嫁接、压条以及组织培养等，以组织培养在水稻中的应用最为广泛。但水稻组织培养也具有较大的局限性:幼胚、幼穗、花粉其取材受季节和环境的限制，取材时间严格，过早或过晚都会导致愈伤诱导失败；组织培养过程中容易出现死亡、白化等情况，难以获得大量的组培苗，且组培苗相对较弱，移栽到大田成活率得不到保障，同时对于大规模的生产成本高。野生稻作为近来稻作资源挖掘的重要材料，越来越受到研究者的重视。普通野生稻是栽培稻的近缘祖先，其经过长年的进化，成为现代的栽培稻。栽培稻一般为一年生，而普通野生稻为多年生草本植物，具有较强的再生性。利用这一特性发展起来的再生稻现已有了一定规模的应用，取得了相当可观的成果。目前，我国再生稻种植面积约1100万亩，是世界上开发利用再生稻面积最大的国家。但再生稻株高、分蘖、穗长、谷粒数等性状相比起头季稻都相对锐减，致平均单产水平不高，产量不稳定。目前水稻再生株仅限在田间直接利用稻桩再生，不仅没有充分利用其休眠芽再生能力，而且产量和生产效益也普遍偏低。利用水稻休眠芽的再生特性繁育再生植物，还没有一套可以快速获得再生株的生产技术体系。合理的挖掘水稻休眠芽再生能力，结合植物激素和生长调节剂诱导水稻休眠芽再生获得再生植株以及构建完善的栽培技术体系，这方面的研究还有待进一步深入。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有水稻再生株仅限在田间直接利用稻桩再生，产量不稳定，产量和生产效益普遍偏低，以及杂交水稻的生产成本高和制种过程繁琐，特殊材料的繁殖困难，水稻组培苗容易出现死亡、白化以及组培苗相对较弱移栽到大田成活率得不到保障，存在大规模生产成本高的缺陷和不足，本发明的目的是提供一种能高效、快速、低成本获得水稻再生株的水稻繁育方法。本发明所提供的水稻休眠芽繁育再生植株的方法，包括以下步骤:
(1)在头季稻收割完后7天以内，截取头季稻地上部分带有倒I 倒3节点休眠芽的稻
杆；
(2)将步骤(I)所述的稻杆洗净后散播在育苗床上并覆土，按水稻常规苗床育秧方法进行育苗和管理，或将 步骤(I)所述的稻杆洗净后用植物激素组合物浸泡40 50小时，再散播在育苗床上并覆土，按水稻常规苗床育秧方法进行育苗和管理；
(3)待再生苗3叶 4叶期移栽大田，按水稻常规大田栽培管理方法进行大田栽培管理。所述的植物激素组合物的配方为0.25mg/L 6-BA +30 mg/L 60mg/L NAA、0.lmg/L NAA + 10.0 mg/L 12.0mg/L 6-BA 或 lOmg/L Kinetin +2.0 mg/L 5.0mg/L NAA。所述的植物激素组合物的配方为0.25mg/L 6-BA + 30mg/L NAA。本发明的特征之一是利用水稻稻杆节点上的休眠芽，构建快速获得大量水稻再生植株的技术体系。休眠芽亦称腋芽、潜伏芽或再生芽，是水稻再生的基础。
本发明的第二个特征是结合植物激素诱导，提高休眠芽萌发效率以及促进再生苗的生长发育。植物激素(Plant hormone),是一些在植物体内合成,可以从产生部位输送至作用部位，微量浓度即可对植物体产生某种生理作用的活性有机物。亦可以是人工合成结构作用相似的化学物质(植物生长调节剂)。许多植物激素对水稻的再生及生长发育有影响，有促进细胞分化、分裂、生长，打破休眠芽的休眠，调节营养物质的运输，同时也利于诱导根和不定根形成等作用。与现有技术相比，本发明的有益效果是:⑴能有效保存和繁殖获得大量的特殊水稻材料(如雌性不育、雄性不育、自交不亲和、单体以及多倍体等)，解决了特殊材料不易繁殖的难题。⑵直接利用杂种F1就可获得大量F1再生植株，不需要进行反复的杂交制种，不仅有效降低了水稻杂交制种的成本和缩短育种周期，还能很好的保持其杂种优势。⑶由于不同材料的再生能力不同，结合植物激素使用可提高再生力相对较差品种的休眠芽的萌发效率以及促进节点新生根的发育，很好的加大了此方法的适用范围。(4)本发明建立的无性繁殖方法，对于特殊水稻材料(如雌性可育、雌性不育、雄性不育等)以及常规稻、杂交稻(杂种F1)采用带有倒I 倒3节点休眠芽的稻杆用激素处理和不用激素处理的再生效率都极显著优于用稻桩直接再生，其出苗率、叶面积指数、株高、谷粒数等比对照大幅度提高、差异极显著。不用激素处理的方法，其出苗效率比直接移栽稻桩的出苗效率提高68.7% 91.2%，谷粒数比直接移栽稻桩的谷粒数提高105.5% 158.2% ；用激素处理的方法，其出苗率比直接移栽稻桩材料的对照的出苗率提高了 112.3 % 132.9%，颖花数比直接移栽稻桩材料的对照提高了 107.1% 138.3%，均产生了预料不到的技术效果。(5)本发明方法简单且容易实施，便于推广应用。
图1是第一轮不同激素、不同激素组合物及不同浓度对水稻材料处理的出苗率统计图，图中横坐标表示激素及激素组合物的浓度，纵坐标表示水稻材料的出苗率，图1A中曲线.表示水稻材料用不同浓度NA A处理的出苗率、曲线f表示水稻材料用不同浓度KIN处理的出苗率、曲线+表示水稻材料用不同浓度6-BA处理的出苗率、曲线+表示水稻材料用表2中所列的KN激素组合物处理的出苗率；图1B中曲线普表示水稻材料用表2中所列的DB激素组合物处理的出苗率，曲线+表示水稻材料用表2中所列的NB激素组合物处理的出苗率，曲线+表示水稻材料用表2中所列的DK激素组合物处理的出苗率，曲线O表示水稻材料用表2中所列的NK激素组合物处理的出苗率。图2是第二轮用DK激素组合物不同浓度处理水稻材料的出苗率统计图，图中横坐标表示DK激素组合物的浓度，纵坐标表示处理水稻材料的出苗率，曲线 ■表示f s用表3中所列的不同激素浓度处理的出苗率，曲线 表示FS用表3中所列的不同激素浓度处理的出苗率，曲线 表示CMS用表3中所列的不同激素浓度处理的出苗率，曲线.表示黎榆B用表3中所列的不同激素浓度处理的出苗率，曲线.表示滇杂37用表3中所列的不同激素浓度处理的出苗率。图3是第二轮用NB激素组合物不同浓度处理水稻材料的出苗率统计图，图中横坐标表示NB激素组合物的浓度，纵坐标表示处理水稻材料的出苗率，曲线 ■表示f s用表4中所列的不同激素浓度处理的出苗率，曲线 表示FS用表4中所列的不同激素浓度处理的出苗率，曲线 表示CMS用表4中所列的不同激素浓度处理的出苗率，曲线.表示黎榆B用表4中所列的不同激素浓度处理的出苗率，曲线 表示滇杂37用表4中所列的不同激素浓度处理的出苗率。图4是第二轮用BN激素组合物不同浓度处理水稻材料的出苗率统计图，图中横坐标表示BN激素组合物的浓度，纵坐标表示水稻材料的出苗率，曲线 ■表示fs用表5中所列的不同激素浓度处理的出苗率，曲线 表示FS用表5中所列的不同激素浓度处理的出苗率，曲线 表示CMS用表5中所列的不同激素浓度处理的出苗率，曲线.表示黎榆B用表5中所列的不同激素浓度处理的出苗率，曲线+表示滇杂37用表5中所列的不同激素浓度
处理的出苗率。图5是第二轮用KN激素组合物不同浓度处理水稻材料的出苗率统计图，图中横坐标表示KN激素组合物的浓度，纵坐标表示水稻材料的出苗率，曲线會表示fs用表6中所列的不同激素浓度处理的出苗率，曲线令表示FS用表6中所列的不同激素浓度处理的出苗率，曲线"■■表不CMS用表6中所列的不同激素浓度处理的出苗率，曲线《 ■表不黎榆B用表6中所列的不同激素浓度处理的出苗率，曲线 表示滇杂37用表6中所列的不同激素浓度处理的出苗率。
具体实施方式
是以头季稻稻杆节点处的休眠芽以无性繁殖的途径散播培育再生或结合植物激素诱导培育再生，最终获得再生水稻植株的方法进行再生繁殖，以种子发芽、直接移栽的稻桩为对照，比较它们在各农艺性状上的差异。以下各实施案例均设置三个以上重复实验；所用的实验材料及试剂均可商业购买得到。实施例1
选用FS(雌性可育)、fs (雌性不育)、CMS (细胞质雄性不育cytoplasmic malesterility)、黎榆B (常规材料)、滇杂37 (杂种F1)为试验材料，将带有节点休眠芽的稻杆进行散播覆土培育，并设置直接移栽稻桩为对照，对苗期出苗率，成熟期进行株高、穗长、谷粒数、百粒重等调查，考察本发明方法对一些水稻特殊材料、常规材料、杂交稻等出苗效率等优势。具体方法如下:
(1)在FS、fs、CMS、黎榆B、滇杂37头季稻收割完后7天以内，截取FS、fs、CMS、黎榆B、滇杂37头季稻地上部分带有倒I 倒3节点休眠芽的稻杆，洗净；(所述的头季稻地上部分带有倒I 倒3节点休眠芽的稻杆的具体取材是取地表以上约10 15cm的稻杆，其带有倒I和倒2节点两个节点休眠芽的稻杆，或带有倒1、倒2和倒3节点三个节点休眠芽的稻杆，考虑到实际生产情况，本试验将上述带有倒I和倒2节点两个节点休眠芽以及带有倒1、倒2和倒3节点三个节点休眠芽的同种材料混合一起育苗，以下各实施例带有倒I 倒3节点休眠芽的稻杆的具体取材均与本实施例相同)；
(2)将上述带有节点休眠芽的稻杆按相同材料一个小区均匀散播在育苗床上覆土，按水稻常规苗床育秧方法进行育苗和管理，同时移植FS稻桩、fs稻桩、CMS稻桩、黎榆B稻桩、滇杂37稻桩到相同的育苗床上，按水稻常规苗床育秧方法进行育苗和管理，作为对照；
(3)将处理和对照的再生苗在3叶-4叶期分别统计比较出苗效率，并移栽试验田，按水稻常规大田栽培管理方法进行大田栽培管理。试验结果发现(表I):利用本发明方法将带有倒I 倒3节点休眠芽的稻杆进行散播覆土培育的苗期出苗效率比直接移栽稻桩的出苗效率高得多，其出苗率=FS比对照提高68.7%，fs比对照提高73 .8%，CMS比对照提高80.4%，黎榆B比对照提高80.3%，滇杂37比对照提高91.2% ;其谷粒数(粒/穗)=FS比对照提高158.2%，fs比对照提高146.6%，CMS比对照提高146.9%，黎榆B比对照提高108.6%，滇杂37比对照提高105.5%。即将带有倒I 倒3节点休眠芽的稻杆进行散播覆土培育，其出苗效率比直接移栽稻桩的出苗效率提高68.7% 91.2%，其谷粒数比直接移栽稻桩的谷粒数提高105.5% 158.2%，表明本发明方法对于特殊水稻材料(如雌性可育、雌性不育、雄性不育等)以及常规稻、杂种F1采用带有倒I 倒3节点休眠芽的稻杆繁育获得再生植株，其出苗率、谷粒数与相应材料直接移栽稻桩相比均产生了预料不到的技术效果。
表I实施例1处理和移栽稻桩的出苗效率及—期相关性状统计
权利要求
1.水稻休眠芽繁育再生植株的方法，包括以下步骤: ⑴在头季稻收割完后7天以内，截取水稻地上部分带有倒I 倒3节点休眠芽的稻杆；⑵将步骤(I)所述的稻杆洗净后散播在育苗床上并覆土，按水稻常规苗床育秧方法进行育苗和管理，或将步骤(I)所述的稻杆洗净后用植物激素组合物浸泡40 50小时，再散播在育苗床上并覆土，按水稻常规苗床育秧方法进行育苗和管理； ⑶待再生苗3叶 4叶期移栽大田，按水稻常规大田栽培管理方法进行大田栽培管理。
2.根据权利要求1所述的水稻休眠芽繁育再生植株的方法，其特征在于:所述的植物激素组合物的配方为 0.25mg/L6-BA+30 60mg/L NAA,0.lmg/L NAA+10.0 12.0mg/L6-BA、或 10.0mg/L Kinetin+2.0 5.0mg/L NAA。
3.根据权利要求1或2所述的水稻休眠芽繁育再生植株的方法，其特征在于:所述的植物激素组合物的配方为0.25mg/L6-BA+30mg/L NAA。
全文摘要
本发明公开一种水稻休眠芽繁育再生植株的方法，属于作物育种技术领域。该方法取水稻带有倒1～倒3节点休眠芽的稻杆散播在育苗床上并覆土，或将所述的稻杆用植物激素浸泡，再散播在育苗床上并覆土，按水稻常规苗床育秧方法进行育苗和管理，待再生苗3叶～4叶期移栽大田。该方法能有效保存和繁殖获得大量特殊水稻材料如雌性不育、雄性不育等，解决了特殊材料不易繁殖的难题；直接利用杂种F1即可获得大量F1再生植株，有效降低水稻杂交制种成本和缩短育种周期，还能很好地保持其杂种优势；该方法用水稻地上部分带有倒1～倒3节点休眠芽稻杆用激素处理和不用激素处理的再生效率都极显著优于用稻桩直接再生，其方法简单易实施，便于推广应用。
文档编号A01G16/00GK103070052SQ20131004358
公开日2013年5月1日 申请日期2013年2月5日 优先权日2013年2月5日
发明者李东宣, 陈丽娟, 谭学林, 吕永刚, 孙明姬, 朱有勇, 李成云 申请人:云南农业大学