用于防治水稻干尖线虫的类硫氧还蛋白基因及引物和应用的制作方法

本发明涉及一种用于防治水稻干尖线虫的类硫氧还蛋白基因及引物和应用。

背景技术：

水稻(Oryza sativa L.)是世界主要粮食作物之一，是世界上三分之一人类的主食。水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi Christie)引起的水稻干尖线虫病，使水稻在世界范围内每年减产10％～70％，造成巨大的经济损失。目前，对水稻干尖线虫的防治措施，主要是加强检疫，以及播种前用温汤或药剂浸种，但浸种后水稻发芽势常有降低趋势。研究发现，水稻栽培过程中，施肥施药等工作对土壤环境渗透压造成了重要影响。大部分生物在高渗透压下无法存活，而水稻干尖线虫可通过进入变渗隐生状态，在高渗透压环境下存活，当环境适宜时，又恢复正常代谢，使浸种防治与农药防治效果降低，增加防治水稻干尖线虫的难度。对水稻干尖线虫应对高渗透压胁迫时的生理机制进行研究，可为防治水稻干尖线虫提供新思路，避免因化学药剂的过量使用造成环境污染。

硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)具有抗氧化、抗旱、耐热等能力，在生物抗逆中起着重要的作用。Trx广泛存在于各种生物体内，有使巯基和二硫化物相互转换的功能，为一系列生理反应提供氧化还原对，维持细胞内蛋白质的还原状态，使其正常发挥功能，对保持生物体内稳定的氧化还原状态具有重要的作用。在水稻干尖线虫抵抗高渗透压胁迫过程中，Trx起重要辅助作用。目前，国内外对植物寄生线虫Trx的研究较少。鉴于Trx对生物抵抗非生物逆境胁迫的重要作用，拟克隆水稻干尖线虫的类硫氧还蛋白基因(thioredoxin like protein，Trxl)，通过基因沉默技术，探究Trxl基因沉默后水稻干尖线虫在高渗透压条件下的存活情况，为防治水稻干尖线虫提供新思路。

技术实现要素：

基于以上不足之处，本发明提供一种用于防治水稻干尖线虫的类硫氧还蛋白基因及引物和应用。

本发明所采用的技术如下：一种用于防治水稻干尖线虫的类硫氧还蛋白基因，其序列如序列表SEQ No.1所示。

本发明还具有如下技术特征：

1、一种用于构建水稻干尖线虫的类硫氧还蛋白基因的引物组，如下：

上游引物Ab-Trxl-F：如序列表SEQ No.2所示，

下游引物Ab-Trxl-R：如序列表SEQ No.3所示。

2、一种用于构建水稻干尖线虫的类硫氧还蛋白基因dsRNA的引物组，如下：

合成正义链RNA上游引物Ab-Trxl-TTF：如序列表SEQ No.4所示，

合成正义链RNA下游引物Ab-Trxl-iR：如序列表SEQ No.5所示，

合成反义链RNA上游引物Ab-Trxl-iF：如序列表SEQ No.6所示，

合成反义链RNA下游引物Ab-Trxl-T7R：如序列表SEQ No.7所示。

3、一种用于水稻干尖线虫的类硫氧还蛋白酶基因Q-PCR检测的引物组，如下：

上游引物Ab-Trxl-qF：如序列表SEQ No.8所示，

下游引物Ab-Trxl-qR：如序列表SEQ No.9所示。

4、如上所述的一种水稻干尖线虫的类硫氧还蛋白基因在防治水稻干尖线虫中的应用。

本发明的类硫氧还蛋白基因在水稻干尖线虫受高渗透压胁迫后表达上调，表明该基因在水稻干尖线虫抗高渗透压胁迫过程中起作用。通过对该基因的研究，为研究水稻干尖线虫应对高渗透压胁迫的生理机制建立基础，可为防治水稻干尖线虫提供新思路，避免因化学药剂的过量使用造成环境污染。在防治水稻干尖线虫中具有重要的生物学意义和潜在的应用价值。

附图说明

图1为实施例1中Q-PCR技术检验高渗透压胁迫后Ab-Trxl相对表达量变化图；

图2为实施例1中Q-PCR技术检验Ab-Trxl基因沉默效果图；

图3为实施例1中分别对水稻干尖线虫进行Ab-Trxl基因沉默处理与对照处理后，进行高渗透压胁迫时水稻干尖线虫存活数对比图。

具体实施方式

本发明提供的用于防治水稻干尖线虫的类硫氧还蛋白基因来源于水稻干尖线虫，该类硫氧还蛋白基因命名为Ab-Trxl，长度为1,148bp，其基因序列如SEQ No.1所示，具有典型的Trxl结构域。

实施例1：

防治水稻干尖线虫的类硫氧还蛋白基因的获得及其功能验证。

(一)RNA抽提及cDNA合成：

DEPC处理水清洗线虫(雌虫：雄虫：幼虫＝4:2:1)，离心去上清后，液氮处理下研磨。取研磨粉末，应用TRIzol法(Invitrogen，cat.No.15596-026)提取水稻干尖线虫总RNA，DEPC处理水溶解。应用AMV反转录系统(Promega，cat.No.A3500)，以Oligo(dT)₁₈为引物进行第一链cDNA反转录，随机引物法合成第二链cDNA。反应过程根据试验手册进行。

(二)水稻干尖线虫类硫氧还蛋白基因完整阅读框克隆

根据转录组测序结果合成水稻干尖线虫类硫氧还蛋白基因引物组，

Ab-Trxl-F:5`-TTC GAC AAA CTC TAT CCA GC-3`，

Ab-Trxl-R：5`-TGA AAT TCC ATT TGA TGG CG-3`。

以水稻干尖线虫第二链cDNA为模板进行完整阅读框序列的PCR扩增(TaKaRa r-Taq酶25μL反应体系：94℃30s，58℃1min，72℃1min，进行35个循环)，扩增产物送生物公司测序验证，所得序列命名为Ab-Trxl。

(三)荧光定量Q-PCR验证

选取高渗透压(饱和MgSO₄·7H₂O溶液)处理4h、12h、24h、48h和96h后水稻干尖线虫，液氮下研磨并采用TRIzol法提取总RNA。应用GoTaq 2-Step RT-qPCR System(Promega A6010)试剂盒进行第一链cDNA反转录。

根据测序结果合成水稻干尖线虫类硫氧还蛋白基因Q-PCR验证引物组，

Ab-Trxl-qF：5`-TGA CCG ATG AAG CAA ATA CCA-3`，

Ab-Trxl-qR：5`-TCG ACG AGC TCA ACA CTT AC-3`。

水稻干尖线虫28s RNA作为内参基因，

Ab-28s-qF：5`-TAC GAT CGG TGT TCG TTG C-3`，

Ab-28s-qR：5`-CTC ACA TCG TCG ACA TCC AA-3`。

应用Stratagene Mx3000P qPCR system(Agilent,USA)和GoTaq 2-Step RT-qPCR System试剂盒进行Q-PCR扩增。使用2步法PCR，第一步：预变性95℃3min。第二步：95℃30s，58℃1min，72℃30s共40个循环。融解曲线测定从55℃到95℃。对Q-PCR扩增采用相对定量法计算次重复试验初始模板量比值，两配对样本t检验p<0.01，差异显著。结果如图1所示，Ab-Trxl在高渗透压胁迫后4h、12h、24h、48h、72h和96h时均有显著上调，证实Ab-Trxl在高渗透压胁迫中起到一定作用。

(四)Ab-Trxl基因沉默

以水稻干尖线虫cDNA为模板，应用引物组：

Ab-Trxl-T7F：5`-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ACA AGT GCA TTT TGG AGC G-3`，

Ab-Trxl-iR：5`-ACA AAC GAT TTG ATG TCC GC-3`

进行PCR扩增生产正义链模板。

应用引物组：

Ab-Trxl-iF：5`-AAC AAG TGC ATT TTG GAG CG-3`，

Ab-Trxl-T7R：5`-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG ACA AAC GAT TTG ATG TCC GC-3`

进行PCR扩增生产反义链模板。应用RNAi试剂盒进行体外转录反应，合成正义链与反义链RNA，经退火生产dsRNA。

蒸馏水稀释dsRNA浓度至3mg/mL，采用dsRNA喂饲法处理线虫12h，以蒸馏水为对照。处理后一部分线虫用于提取RNA，反转录后应用引物Ab-Trxl-qF和Ab-Trxl-qR进行Q-PCR扩增，应用水稻干尖线虫28s rRNA基因引物Ab-28s-qF和Ab-28s-qR进行Q-PCR扩增作为对照，验证RNAi效果。结果如图2所示，RNAi后Ab-Trxl表达量显著下降。另一部分线虫用于高渗透压处理1d～6d后线虫存活数测定，每个处理随机选取100条虫进行观察，重复三次。结果如图3所示，水稻干尖线虫存活数显著下降。说明水稻干尖线虫类硫氧还蛋白基因沉默，对该线虫抗高渗透压能力起到显著影响，可用于该线虫病害防治。

<110> 东北林业大学

<120> 用于防治水稻干尖线虫的类硫氧还蛋白基因及引物和应用

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<212> DNA

<213> Ab-Trxl

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