一种用于水稻干尖线虫lamp快速检测的引物组合物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于水稻干尖线虫LAMP快速检测的引物组合物及其应用。一种用于水稻干尖线虫LAMP快速检测的引物组合物，由以下引物组成：AB1-F3：SEQ?ID?NO.2，AB1-B3：SEQ?ID?NO.3，AB1-BIP：SEQ?ID?NO.4，AB1-FIP：SEQ?ID?NO.5，AB1-LF：SEQ?ID?NO.6。利用该引物组合物进行水稻干尖线虫的LAMP快速检测，特异性强、灵敏度高，因此，本发明所述的引物组合物可在检测和/或鉴定水稻干尖线虫中应用。
【专利说明】—种用于水稻干尖线虫LAMP快速检测的引物组合物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测领域，涉及一种用于水稻干尖线虫LAMP快速检测的引物组合物及其应用。
【背景技术】
[0002]水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)，又称贝西滑刃线虫，是水稻上重要的种传外寄生线虫，世界范围内各水稻产区均有发生[1]，能引起水稻干尖或白尖病[2]。水稻干尖线虫病于1915年在日本九州岛发现[3]，大约20世纪40年代传入中国，曾被列为中国对内检疫对象[4]，后因采取检疫及种子处理等措施，该病害在80年代得到控制。但是近年来，该病害的发生范围和危害程度在我国又开始加大，目前，广东、广西、湖南、湖北、浙江、江苏、安徽、山东、河北、上海、辽宁、陕西、贵州、四川、云南、台湾等地的主要稻区均有分布，局部地区发生和危害严重[5]。为了阻止水稻干尖线虫病传播范围的不断扩大，对其进行快速、准确地检测鉴定尤为重要。
[0003]传统的水稻干尖线虫检测方法，主要以形态学鉴定为主，但由于线虫形态特征细微复杂，且常具有一定的变化，因此鉴定往往比较困难，需要专业人士操作，过程费时费力，且需要大量线虫样本，在单条线虫水平上难以准确鉴定。近年来随着分子生物学相关技术的发展，基于PCR的方法已经成功用于检测水稻干尖线虫[6]，尽管以PCR为基础的分子鉴定方法一定程度上克服了传统形态鉴定上的缺陷，但由于检测需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统仪等昂贵的专业仪器设备，同时需要操作人员具有一定的分子生物学专业技能，并且只能在实验室条件下完成， 需要较长的时间，检测过程复杂，不能满足快速检测的需求，限制了 PCR检测方法在生产中的推广应用。
[0004]环介导等温扩增技术(Loop- mediated isothermal amplification, LAMP)是Notomi等开发的一种恒温扩增方法m，该方法针对靶基因的6个位点设计出4条引物，利用一种具有链式置换活性的DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)，在恒温条件下(60°C左右)保温30 - 90分钟，即可完成扩增反应。由于该反应过程中产生焦磷酸镁沉淀物，出现浑浊沉淀，因此用肉眼就判定扩增结果，也可通过向其扩增产物中添加荧光染料通过颜色变化来判断，因此不需要专业的仪器设备，在普通水浴锅中或者其他稳定热源即可完成，具有简单、快速、高效、经济等特征。
[0005]凭借快速灵敏的优越性，LAMP技术已在松材线虫W (Bursaphelenchuhxylophilus)、南方根结线虫[9] (Meloidogyne incognita)、象耳豆根结线虫[10](Meloidogyne enterolobii)、香蕉穿孔线虫[n] (Radopholus similis)等植物寄生线虫快速检测中得到了应用，极大的提高了针对上述植物寄生线虫的鉴定效率和准确率，为进一步采取适宜的防控措施控制其危害提供了便利，但目前在水稻干尖线虫中尚无相关报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种用于水稻干尖线虫LAMP快速检测的引物组合物。
[0007]本发明的另一目的是提供该弓丨物组合物的应用。
[0008]本发明的又一目的是提供一种水稻干尖线虫LAMP快速检测方法。
[0009]本发明的目的可通过如下技术方案实现:
[0010]一种用于水稻干尖线虫LAMP快速检测的引物组合物，由以下引物组成:AB1_F3:SEQ ID N0.2,AB1-B3:SEQ ID N0.3,ABl-BIP:SEQ ID N0.4,ABl-FIP:SEQ ID N0.5,ABl-LF:SEQ ID N0.6。
[0011]本发明所述的引物组合物在检测和/或鉴定水稻干尖线虫中的应用。
[0012]本发明所述的引物组合物在制备水稻干尖线虫检测和/或鉴定试剂中的应用。
[0013]一种水稻干尖线虫检测试剂,包含本发明所述的引物组合物。
[0014]一种水稻干尖线虫LAMP快速检测方法，包括以下步骤:
[0015](1)提取待检样品DNA ；
[0016](2)以提取的DNA为模板，利用本发明所述的LAMP引物组合物进行LAMP扩增；
[0017](3) LAMP扩增反应结束按照以下任意一种方式观察结果:
[0018]I)向扩增产物中加入显色剂，轻晃混匀，即可观察，扩增产物具有绿色荧光，表明含有水稻干尖线虫；
[0019]2)取扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳中电泳，EB染色，在紫外灯下观测，扩增产物呈梯形条带，表明含有水稻干尖线虫；
[0020]3)将反应后的离心管3000rpm离心30sec，管底观察到白色沉淀，表明含有水稻干尖线虫。
[0021]其中，步骤(2)所述LAMP扩增的反应体系优选为25 μ 1，由
[0022]I)引物混合液:外引物ABl -F3和ABl - Β3各0.2 μ mol/L，内引物ABl - FIP和ABl - BIP 各 0.8 μ mol/L,环引物 ABl - LF 为 0.4 μ mol/L ;
[0023]2)反应混合液:0.8mmol/L dNTP, 20mmol/L Tris - HCl (ρΗ8.8)，10mmol/L KCl,5mmol/L MgCl2, lOmmol/L (NH4) 2S04,0.l%Triton x - 100，0.2mol/L 甜菜碱，8U Bst DNA 聚合酶大片段；
[0024]3) I μ I DNA 模板；
[0025]4)灭菌双蒸馏水组成。其中各成分的浓度均表示在反应体系中的终浓度。
[0026]步骤(2)所述LAMP扩增的反应条件优选:61~65°C保温30~90min，85°C保温IOmin0
[0027]所述的显色剂优选SYBR green I与PCR级DMSO以1:9体积比的混合物。
[0028]有益效果:
[0029]一、特异性强，所用的特异引物根据水稻干尖线虫的28S6个不同区域设计出5条引物，特异性明显强于常规PCR。
[0030]二、灵敏度高，对水稻干尖线虫的检测极限可达到1/10000条幼虫水平，比常规PCR检测水稻干尖线虫的检测灵敏度高100倍。
[0031]三、检测用时短，I小时左右可获得检测结果，比常规PCR节省2 - 4h。
[0032]四、对仪器设备要求低，不需要任何PCR仪、凝胶电泳和成像系统，只需要一个水浴锅或者保温瓶就可以完成检测。
[0033]五、操作简单，结果容易辨别，通过不同颜色，肉眼即可观察结果，不需要繁琐的电泳和紫外观察，一般技术人员即可完成检测。
[0034]六、对人和环境友好，检测过程不需要使用EB等有毒试剂，减少环境污染。
[0035]综上所述，本发明具有比现有普通PCR技术检测水稻干尖线虫的方法具有更高的特异性、灵敏度和可操作性。该技术可应用于对水稻干尖线虫稻种检验检疫及田间植物上水稻干尖线虫病发生的早期快速分子检测，具有实际的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0036]图1为水稻干尖线虫28S序列的LAMP引物设计示意图。
[0037]图2为水稻干尖线虫LAMP方法检测
[0038]A图为加入荧光染料检测结果，1:阳性结果，具有绿色荧光；2:阴性对照，为红褐色；
[0039]B图检测结果为电泳图，M:DL2000DNA标准分子量(Takara) ；1:阳性结果，为LAMP扩增梯形条带；2:阴性对照，无扩增产物。
[0040]图3为水稻干尖线虫LAMP检测方法特异性检测结果图
[0041]A为LAMP加荧光染料检 测结果图，I为阳性，2 - 12为阴性；
[0042]B为LAMP检测结果电泳图；
[0043]C为常规PCR检测结果电泳图；
[0044]上述各图中1- 12泳道的DNA来源如表1所示。
[0045]图4为水稻干尖线虫灵敏度检测结果
[0046]A 为 LAMP 加荧光染料检测结果图，1- 8 分别为:10_1、10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10 -7条线虫DNA和阴性对照；
[0047]B为LAMP检测结果电泳图，M:DL2000DNA标准分子量(Takara);1-8分别为:10_1、10-2UO-3、10 _ 4、10-5UO-6UO-7 条线虫 DNA 和阴性对照；
[0048]C为普通PCR法检测结果电泳图，M:DL2000DNA标准分子量(Takara) ；1 - 8分别%:10'1UO'2UO'3UO'4UO-5UO-6, UO-7 条线虫 DNA 阴性对照。
[0049]图5颜色判定种子调运带病稻粒中水稻干尖线虫
[0050]1- 7为种子调运带病稻粒中的水稻干尖线虫扩增结果，呈现绿色，表明稻种中携带水稻干尖线虫；8为阴性对照，显红褐色，表明不携带水稻干尖线虫。
【具体实施方式】
[0051]下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0052]所述试剂均为市售，主要试剂:Taq DNA聚合酶、DNA marker购自TaKaRa公司；弓丨物由上海英俊生物技术有限公司合成；pGEM-T EasyVector购于美国promega ；ProteinaseK(蛋白酶K)购自Roche公司；Bst DNA聚合酶大片段购自New England Biolabs公司；SYBRgreen I 购自 Invitrogen 公司。
[0053]实施例1水稻干尖线虫DNA的提取、rDNA28S扩增及序列分析
[0054]1.1水稻干尖线虫DNA的提取[0055]挑取单条水稻干尖线虫或雌虫放入含有8μ LddH2O和I μ LlO X PCRBuffer (Mg2+free)的0.2mL离心管中，放入液氮中冷冻Imin后，置于95°C下2min,重复4~5次；向PCR管中加入1 μ L10mg/ml蛋白酶K，然后将离心管在65°C下温育90min，95°C反应IOmin处理后上清液作为线虫DNA模板直接用于LAMP和PCR反应。
[0056]1.2水稻干尖线虫rDNA28S扩增及序列分析
[0057]采用28S 区的通用引物 D2A(5’ - ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG - 3’，SEQ ID N0.7)和 D3B(5’ - TCGGAAGGAACCAGCTACTA - 3’，SEQ ID N0.8)扩增水稻干尖线虫种群 rDNA28S区片段。PCR 扩增反应体系为 10XBuffer(Mg2+free)2y 1，10mmol/L dNTP2 μ 1，10mmol/LMgCl22 μ 1，引物 TW81 和 AB28(2.5ymol/L)各 2μ l，Taq 酶(5U/μ 1，Takara) 0.5 μ 1，模板DNA5y 1，灭菌ddH20补足至25 μ I。PCR扩增条件为:94°C预变性4min，94°C变性30sec,56°C退火30sec，72°C延伸lmin，40个循环；7°C再次延伸10min，4°C保存。PCR扩增后，取5 μ I扩增产物加I μ I加样缓冲液在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观察并拍照，回收、克隆和测序如SEQ ID N0.1，序列测定由上海英俊生物技术有限公司完成。
[0058]实施例2LAMP技术检测水稻干尖线虫方法的建立
[0059]2.1LAMP 引物设计
[0060]根据水稻干尖线虫28S区扩增后测序结果，设计并筛选下列LAMP引物(见图1)，弓丨物交上海英俊生物技术有限公司合成。引物序列如下:
[0061]①ABl - F3:5，- ATTCCGCAAGGTTGTCTAGG - 3，(SEQ ID N0.2)；
[0062]②ABl - B3:5，- CCGCAACCACAACTCACA - 3，(SEQ ID N0.3)；
[0063]③ABl-BIP:
[0064]5，- CGAGAATCCTGTGCGTTCGGAATTCACCCGCACTCCACA - 3，(SEQ ID N0.4)；
[0065]④AB 1-FIP:
[0066]5’ -AGCGACATCGACCCACTCGGAGTGTTGTTGTTGTGCTCGT - 3’ (SEQ ID N0.5)；
[0067]⑤ABl - LF:5，- CGCACGCAAATGCATCCA - 3，(SEQ ID N0.6)；
[0068]2.2LAMP反应体系配置:
[0069]引物混合液:外引物ABl - F3和ABl - B3各0.2 μ mol/L,内引物ABl - FIP和ABl -BIP 各 0.8 μ mol/L,环引物 ABl - LF 为 0.4 μ mol/L ;
[0070]反应混合液:0.8mmol/L dNTP, 20mmol/L Tris - HCl (ρΗ8.8)，IOmmoI/L KCl,5mmol/L MgCl2, lOmmol/L (NH4) 2S04,0.l%Triton x - 100，0.2mol/L 甜菜碱，8U Bst DNA 聚合酶大片段，I μ IDNA模板，加灭菌双蒸馏水补全到25 μ I。
[0071]2.3LAMP反应扩增条件:将以上混合液置于62°C恒温水浴中等温扩增60min，85°C保温lOmin，反应结束后加入2μ I配制好的显色剂混匀后观察结果(图2Α)。取2μ I产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并拍照，可看到有LAMP特征性梯形带(图2B)。
[0072]实施例3水稻干尖线虫LAMP特异性检测
[0073]收集水稻干尖线虫，大连滑刃线虫，单性滑刃线虫，双尾滑刃线虫，腐烂茎线虫,松材线虫,拟松材线虫，阿苏里伞滑刃线虫，南方根结线虫，小麦孢囊线虫，大豆孢囊线虫，穿刺短体线虫(见表1)，分别提取其DNA作为模板与水稻干尖线虫DNA模板一起进行LAMP检测，以检测水稻干尖线虫LAMP检测方法的特异性。同时以提取DNA为模板，以 SCAR 标记特异性引物(BSF:5，- TCGATGAAGAACGCA GTGAATT - 3，(SEQ ID N0.9)，BSR:5’ - AGATCAAAAGCCAAT CGAATCAT - 3’ (SEQ ID N0.10))，进行常规 PCR 检测，体系如下:10 X Buffer (Mg2+free) 2.5 μ I，IOmmoI/L dNTP2 μ I，IOmmoI/L MgCl22 μ I，引物 BSF 和BSR (2.5 μ mol/L)各 2 μ I，Taq 酶(5U/ μ I，Takara) 0.5 μ I，模板 DNAl μ I，灭菌 ddH20 补足至25 μ I，凝胶电泳观察结果。
[0074]表1供试的全部植物线虫群体样品代码及来源
[0075]
【权利要求】
1.一种用于水稻干尖线虫LAMP快速检测的引物组合物，其特征在于:由以下引物组成:
AB1-F3:SEQ ID N0.2，AB1-B3:SEQ ID N0.3, ABl-BIP:SEQ ID N0.4, ABl-FIP:SEQ IDN0.5 及 ABl-LF:SEQ ID N0.6。
2.权利要求1所述的引物组合物在检测和/或鉴定水稻干尖线虫中的应用。
3.权利要求1所述的引物组合物在制备水稻干尖线虫检测和/或鉴定试剂中的应用。
4.一种水稻干尖线虫检测试剂，其特征在于包含权利要求1所述的引物组合物。
5.一种水稻干尖线虫LAMP快速检测方法，其特征在于包括以下步骤: (1)提取待检样品DNA； (2)以提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的LAMP引物组合物进行LAMP扩增； (3)LAMP扩增反应结束按照以下任意一种方式观察结果: 1)向扩增产物中加入显色剂，轻晃混匀，即可观察，扩增产物具有绿色荧光，表明含有水稻干尖线虫； 2)取扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳中电泳，EB染色，在紫外灯下观测，扩增产物呈梯形条带，表明含有水稻干尖线虫； 3)将反应后的离心管300 0rpm离心30sec，管底观察到白色沉淀，表明含有水稻干尖线虫。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤(2)所述LAMP扩增的反应体系为25 μ I,由 1)引物混合液:外引物AB1-F3和ΑΒ1-Β3各0.2 μ mol/L,内引物ABl-FIP和ABl-BIP各 0.8 μ mol/L,环引物 ABl-LF 为 0.4 μ mol/L ；
2)反应混合液:0.8mmol/L dNTP, 20mmol/L Tris-HCl (pH8.8)，IOmmoI/L KCl,5mmol/L MgCl2, lOmmol/L (NH4) 2S04,0.l%Triton x-100，0.2mol/L 甜菜碱，8U Bst DNA 聚合酶大片段；
3)I μ I DNA 模板； 4)灭菌双蒸馏水组成。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤(2)所述LAMP扩增的反应条件为:61 ~65°C保温 30 ~90min，85°C保温 lOmin。
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于所述的显色剂为SYBRgreen I与PCR级DMSO以1:9体积比的混合物。
【文档编号】C12N15/11GK103805710SQ201410081273
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年3月6日 优先权日:2014年3月6日
【发明者】王暄, 李红梅, 顾建锋, 魏洪岩 申请人:南京农业大学