转基因水稻科丰2号外源插入基因和侧翼水稻序列的连接区序列及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了转基因水稻科丰2号外源插入基因和侧翼水稻序列的连接区序列及应用。本发明通过Hi-TAIL?PCR获得外源插入基因载体和其两侧5’端及3’端侧翼水稻序列的连接区序列，其核苷酸为SEQ?ID?No.2所示；本发明进一步公开了外源插入载体和3’端侧翼水稻序列的连接区序列，其核苷酸序列为SEQ?ID?No.13所示。本发明进一步公开了所述连接区序列作为靶基因应用于转基因水稻科丰2号品系特异性的检测。本发明为建立转基因水稻科丰2号品系特异性PCR检测方法奠定了基础。
【专利说明】转基因水稻科丰2号外源插入基因和侧翼水稻序列的连接区序列及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及转基因水稻的侧翼序列，尤其涉及转基因水稻科丰2号插入基因载体和侧翼水稻序列的连接区序列及其应用，属于转基因水稻品系特异性的检测领域。
【背景技术】
[0002]随着转基因植物的广泛种植，转基因食品的安全性问题也引起人们极大的关注，已有30多个国家相继实施转基因产品标识制度，包括中国。转基因标识制度的实施依赖于对转基因植物及其加工产品的成分检测。PCR技术是目前国内外检测转基因产品中应用最广泛的方法。在应用这种技术进行转基因作物定性检测时，根据其特异性，将其分为筛选检测法、基因特异性方法、构建特异性方法和品系特异性方法。品系特异性检测是通过检测插入载体与植物基因组的连接区序列实现的，由于每一个转基因植物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，和前三种方法比较，品系特异性具有更高的特异性和准确性，最适合做转基因产品检测。[0003]目前，已有部分专利和文献报道了转基因植物的品系特异性检测方法。例如:张大兵等人于2006年建立了转基因M0N863玉米的品系特异性检测方法；谢家建等人建立了转基因水稻克螟稻、Bt汕优63、科丰6号和科丰8号等一系列品系特异性检测方法；卢长明等人于2007年建立了一系列转基因油菜的品系特异性检测方法。但是，目前为止，尚未发现任何关于转基因水稻科丰2号的品系特异性PCR检测方法。确定外源插入基因和侧翼水稻序列的连接区序列是建立转基因水稻科丰2号的品系特异性PCR检测方法的前提。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一是获取转基因水稻科丰2号外源插入基因载体和侧翼水稻序列的连接区序列；
[0005]本发明的目的之二是将获取转基因水稻科丰2号外源插入基因载体和侧翼水稻序列的连接区序列作为靶基因应用于转基因水稻科丰2号品系特异性的定性检测。
[0006]本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:
[0007]本发明根据转基因水稻科丰2号品系中插入的目的基因为SCK基因(SEQ IDN0.1)通过H1-TAIL PCR获得外源插入基因5’端水稻侧翼序列和3’端水稻侧翼序列，最终所获得的含有SCK基因的外源插入基因载体及其两侧5’端和3’端侧翼水稻序列的连接区核苷酸序列为SEQ ID N0.2所示；本发明进一步根据科丰2号外源插入载体和5’端水稻侧翼序列形成的5段连接区序列设计了 5对转化体引物，这5对转化体引物虽然均能特异性地从科丰2号样品中扩增出特异性片段，但是在华恢I号，抗优97，辽粳371，M0N89788,H7-1等水稻品种也均有扩增条带，所以采用这些连接区作为靶基因设计的特异性引物检测的特异性不好。
[0008]本发明进一步根据科丰2号外源插入载体和3’端水稻侧翼序列所形成的连接区核苷酸序列(SEQ ID N0.13)设计5对转化体特异性引物，5对引物的核苷酸序列分别为SEQID N0.3-SEQ ID N0.12所示，应用常规的PCR反应条件，分别采用5对引物进行PCR扩增，设置2个重复；从扩增结果可见，这5对引物均能特异性地从科丰2号样品中扩增出预期片段，但是用SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的引物扩增的条带最为清晰；SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的引物是以SEQ ID N0.13所示的外源插入载体和3’端水稻侧翼序列所形成的连接区核苷酸序列为靶基因所设计的一对特异性检测引物，这说明以SEQ ID N0.13所示的连接区核苷酸序列能够作为转基因水稻科丰2号品系特异性检测的靶基因，例如，以该靶基因设计检测引物，能够准确的对转基因水稻科丰2号品系特异性进行定性检测。
[0009]因此，本发明进一步将所获取的转基因水稻科丰2号外源插入基因和侧翼水稻序列的连接区序列应用于转基因水稻科丰2号的品系特异性的定性检测，包括:(I)提取待检测水稻样品的DNA; (2)以SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.13为靶基因设计特异性检测引物，建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；(3)如果从待检测的样品中扩增出预期的特异性条带，则待检测的水稻样品是转基因水稻科丰2号；如果从待检测的样品中未能扩增出预期的特异性条带，则待检测的水稻样品不是转基因水稻科丰2号。
[0010]其中，所述的从待检测水稻样品中提取DNA的方法，可以是从植物材料中提取DNA的各种常用方法，例如可以是CTAB法、异硫氰酸胍法或盐酸胍法等各种方法。
[0011]PCR反应体系中引物的终浓度以及退火温度对于检测结果的特异性灵敏度均有一定的影响；本发明考察了 PCR反应体系中引物的终浓度以及退火温度对于检测的特异性和灵敏度的影响，实验结果发现在引物终浓度为0.2 μ M、退火温度为58°C时，检测结果的特异性最强，灵敏度最高。
[0012]本发明中所述的PCR扩增体系可参考以下方法建立:反应体系的总体积为25.0 μ L，其中，10 XPCR缓冲液2.5 μ L, 25mmol/L氯化镁溶液1.5 μ L，dNTPs混合溶液(各
2.511111101/1)2 4 1^，0.2 4 11101/1上游引物 0.5 μ L, 0.2 μ mol/L 下游引物 0.5μ L，0.025U/μ LTaq酶1.5yL，25mg/L DNA模板2.0 μ L，余量为双蒸水。
[0013]所述的PCR 扩增条件优选为:94°C,5min ;94°C，30s，58°C，30s，72°C，30s，35 个循环；94°C，2min。
[0014]本发明进一步的目的是提供一种转基因水稻科丰2号的品系特异性PCR定性检测试剂盒，包括=IOXPCR缓冲液，氯化镁溶液，dNTPs混合溶液，检测上下游引物对，Taq酶和双蒸水；其中，所述检测上下游引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示。
[0015]采用本发明建立的转基因水稻科丰2号的品系特异性PCR定性检测方法对转基因水稻π优科丰6号、汕优10、汕优63、皖80-4B、抗优97、华恢I号、科丰2号、常规水稻明恢63以及其它转基因植物(例如:M0N863玉米、GHB614棉花、M0N89788大豆和油菜GT73等)进行了定性检测，定性PCR扩增结果表明，在科丰2号水稻基因组中扩增得到了目的片段大小的条带(201bp)，在其它转基因水稻Π优科丰6号、汕优10、汕优63、皖80-4B、抗优97、华恢I号和其它转基因植物(M0N863玉米、GHB614棉花、M0N89788大豆和油菜GT73)以及常规水稻明恢63等基因组中没有扩增得到目的片段大小的片段；通过测序分析表明科丰2号水稻基因组中扩增获得的序列与目的扩增片段序列一致。实验结果表明，本发明所建立的转基因水稻科丰2号品系特异性定性PCR检测方法具有较强的特异性。[0016]灵敏度实验结果表明，科丰2号水稻成分为1%，0.5%, 0.1%，0.05%，采用本发明建立的PCR反应都扩增出了目的片段大小的条带，说明本发明所建立的科丰2号水稻品系特异性PCR定性检测方法的灵敏度为0.05%，具有高度的灵敏性。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1H1-TAIL PCR扩增结果；M:1Kb plus Markerl:下游第二轮PCR产物2:下游第三轮PCR产物；3:上游第二轮PCR产物4:上游第三轮产物。
[0018]图2上下游测序拼接结果(2614bp)。
[0019]图3从已知序列的两端设计H1-TAIL PCR的嵌套引物。
[0020]图4H1-TAIL PCR 扩增结果；M:1Kb plus Markerl、上游第二轮 PCR 产物；2、上游第三轮产物；注:下游引物无条带。
[0021]图5上下游测序拼接结果。
[0022]图6PCR扩增结果；M:1Kb plus Markerl:空白对照；2:明恢86阴性对照3:科丰2号。
[0023]图7长片段验证获得的整合结构、②、③、④、⑤分别代表:从所示意的位置设计长片段引物进行扩增。
[0024]图8 I号引物 扩增结果:M:lKb plus Marker ；1:空白对照2:明恢86阴性对照3:科丰2号。
[0025]图9 2号引物扩增结果:M:100bp Marker ；1:空白对照2:明恢86阴性对照3:科
丰2号。
[0026]图10 3号引物扩增结果:M:lKb plus Marker, I:空白对照2:明恢86阴性对照3:科丰2号。
[0027]图11 4号引物扩增结果:M:lKb plus Marker, I:空白对照2:明恢86阴性对照3:科丰2号。
[0028]图12 5号引物扩增结果:M:lKb plus Marker, I:空白对照2:明恢86阴性对照3:科丰2号。
[0029]图13科丰2号转化体5’端旁侧序列特异性引物筛选结果。
[0030]图14 5’端旁侧序列引物的特异性验证结果；A:M:100bp Marker ；1:空白对照；2:明恢86阴性对照；3:科丰2号阳性对照；4-19分别是:明恢63、皖21-B、中花11、汕优63、科丰6号、II优科丰6号、II优明恢86、华恢I号、汕优10、bar68-l、皖80-4B、抗优97、东农、辽粳371、松粳6 ；B:M:1OObp Marker ；1:空白对照；2:明恢86阴性对照；3:科丰2号阳性对照；4-7分别为:玉米阴性、M0N863、Btl76、M0N810 ;8_10分别为:棉花阴性、LL25、M0N15985 ;11_13 分别为:大豆阴性、M0N89788、40-3-2 ;14、15 分别为:油菜 T45、MS1 ;16、17分别为:甜菜GT73、H7-1。
[0031]图15科丰2号转化体3’端旁侧序列特异性引物筛选结果。
[0032]图16PCR反应体系中引物的终浓度和退火温度优化结果；引物的终浓度为0.1 μ M/L ；Μ: IOObp Markerl:明恢 86 阴性对照，2:科丰 2 号 a:54 °C b:56 °C c:58 °C d:60°C e:62。。。
[0033]图17PCR反应体系中引物的终浓度和退火温度优化结果；引物的终浓度为0.2 μ M/L ；Μ:IOObp Markerl:明恢 86 阴性对照；2:科丰 2 号 a:54 °C b:56 °C c:58 °C d:60°C e:62。。。
[0034]图18PCR反应体系中引物的终浓度和退火温度优化结果；引物的终浓度为0.4 μ M/L ；M:IOObp Markerl:明恢 86 阴性对照；2:科丰 2 号；a:54°C b:56°C c:58°C d:60°C e:62°C。
[0035]图19PCR反应体系中引物的终浓度和退火温度优化结果；引物的终浓度为0.8 μ M/L ；M: IOObp Markerl:明恢 86 阴性对照;2:科丰 2 号 a:54 °C b:56 °C c:58 °C d:60°C e:62。。。
[0036]图20科丰2号转化体方法特异性检测；M: IOObp Markerl:空白对照2:明恢86阴性对照3:科丰2号阳性对照；4-19分别是:明恢63、皖21-B、中花11、汕优63、科丰6号、II优科丰6号、II优明恢86、华恢I号、汕优10、bar68-l、皖80-4B、抗优97、东农、辽粳371、松粳6。
[0037]图21科丰2号转化体方法特异性检测；M: IOObp Markerl:空白对照2:明恢86阴性对照，3:科丰2号阳性对照，4-7分别为:玉米阴性、M0N863、Btl76、M0N810 ;8_10分别为:棉花阴性、LL25、M0N15985 ;11_13分别为:大豆阴性、M0N89788、40-3-2 ;14、15分别为:油菜 T45、MS1 ; 16、17 分别为:甜菜 GT73、H7-1。
[0038]图22科丰2号转化体方法灵敏度测试结果；M:IOObp Markerl:空白对照2、阴性对照 3、4、5、6、7、阳性 100%、1%、0.5%、0.1%、0.05%。
[0039]图23检测限测试结果；M:100bp Marker A:空白对照B:阴性对照；1_10:阳性
0.1%的10个平行11-20:阳性0.05%的10个平行；21-30:阳性0.01%的10个平行。
[0040]实施例1转基因水稻科丰2号品系中外源插入SCK基因的侧翼序列的获取
[0041]转基因水稻科丰2号品系外源插入目的基因为SCK基因，共415bp，其碱基序列为SEQ ID N0.1 所示。
[0042]通过H1-TAIL PCR获得整合结构(外源插入基因侧翼序列)
[0043]1、第一步:在目的基因SCK上设计H1-TAIL PCR的嵌套引物
[0044]①下游引物:
【权利要求】
1.转基因水稻科丰2号外源插入基因载体和其两端侧翼水稻序列形成的连接区序列，其特征在于:其核苷酸序列为SEQ ID N0.2所示。
2.转基因水稻科丰2号外源插入基因载体和3’端侧翼水稻序列形成的连接区序列，其特征在于:其核苷酸序列为SEQ ID N0.13所示。
3.权利要求1所述的连接区序列作为靶基因应用于转基因水稻科丰2号品系特异性定性检测中的应用。
4.权利要求2所述的连接区序列作为靶基因应用于转基因水稻科丰2号品系特异性定性检测中的应用。
5.按照权利要求3所述的应用，其特征在于，包括:(I)提取待检测水稻样品的DNA；(2)以提取的DNA为模板，以SEQ ID N0.2为靶基因设计检测引物，建立PCR反应体系并进行PCR扩增；(3)如果从待检测的样品中扩增出预期的特异性条带，则待检测的水稻样品是转基因水稻科丰2号；如果从待检测的样品中未能扩增出预期的特异性条带，则待检测的水稻样品不是转基因水稻科丰2号。
6.按照权利要求4所述的应用，其特征在于，包括:(I)提取待检测水稻样品的DNA;(2)以提取的DNA为模板，以SEQ ID N0.13为靶基因设计检测引物，建立PCR反应体系并进行PCR扩增；(3)如果从待检测的样品中扩增出预期的特异性条带，则待检测的水稻样品是转基因水稻科丰2号；如果从待检测的样品中未能扩增出预期的特异性条带，则待检测的水稻样品不是转基因水稻科丰2号。
7.按照权利要求6所述的应用，其特征在于:所述的检测引物为SEQID N0.7和SEQID N0.8 所示。
8.按照权利要求6所述的应用，其特征在于:所述预期的特异性条带的大小是201bp。
9.按照权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述的PCR反应体系为:反应体系的总体积为25.0 μ L，其中，10 XPCR缓冲液2.5 μ L，25mmol/L氯化镁溶液1.5 μ L，dNTPs混合溶液 2μ L，0.2ymol/L SEQ ID N0.7 所示的引物 0.5 μ L，0.2 μ mol/L SEQ ID N0.8 所示的引物 0.5 μ L，0.025U/ μ LTaq 酶 1.5 μ L，25mg/L DNA 模板 2.0 μ L,余量为双蒸水。
10.按照权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述的PCR扩增条件为:94°C，5min；94°C，30s, 58°C，30s, 72°C，30s, 35 个循环；94°C，2min。
【文档编号】C12N15/11GK103834645SQ201410081007
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月6日 优先权日:2014年3月6日
【发明者】宛煜嵩, 梁利霞, 张秀杰, 朱祯, 金芜军, 苗朝华, 李亮, 黄卫红 申请人:中国农业科学院生物技术研究所