体内外循环筛选法构建胰腺癌吉西他滨耐药细胞株模型的方法
【专利摘要】本发明公开了一种体内外循环筛选法构建胰腺癌吉西他滨耐药细胞株模型的方法，包括如下步骤：(1)细胞培养；(2)皮下移植；(3)胰腺癌模型组的构建；(4)化学治疗模型的构建；(5)取材；(6)采用酶消化法进行瘤体源性原代细胞培养；(7)循环筛选，从而获得耐药细胞株。采用体外细胞培养、体内诱导，重复循环筛选的方法，获得的耐药细胞具有与原代细胞相同的遗传特征，是理想的实验平台。
【专利说明】体内外循环筛选法构建胰腺癌吉西他滨耐药细胞株模型的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于药物开发【技术领域】，具体而言，涉及一种体内外循环筛选法构建胰腺癌吉西他滨耐药细胞株模型的方法。
【背景技术】
[0002]构建相应动物及细胞模型是研究肿瘤发生发展重要的部分，建立具有明确特征的肿瘤模型是研究和揭示肿瘤分子机制的关键平台。胰腺癌恶性程度高，术后复发及转移率高，化疗药物作用效果差异大，胰腺癌的治疗效果欠佳。肿瘤对化疗药物的耐药是降低胰腺癌治疗效果的重要原因之一。构建模拟肿瘤生物学特征的动物模型是肿瘤学研究的重要步骤。国内外的学者构建了多种胰腺癌模型:通过瘤块移植构建胰腺癌模型，原位移植法构建淋巴转移模型，腹腔注射构建胰腺癌腹膜转移模型等η°。本研究中应用人胰腺癌细胞株PANC-1构建了较为真实地模拟了与人肿瘤生长和转移相似的微环境。在移植瘤移植5周后，移植成功率达到73.3% -80%，转移率达到11.1% -37%，具有制模时间短、成瘤率高、转移率高的特点。与其他胰腺癌动物模型相比，其生物学行为与人类胰腺癌极为接近，模拟同原发肿瘤发病部位相似的肿瘤微环境(胰腺体尾部肿瘤)，能在相应部位形成转移灶，避免因移植位点特异性引起的假阳性，对胰腺癌的自然病程进行模拟，可以认为是一较理想的“拟人”胰腺癌转移模型η_15。该模型的主要缺点在于手术技术要求较高，且裸鼠耐受能力较差，操作过程有一定的死亡率，本研究中达8.3% -18.3%,故在制模时要求较高的实验条件及操作技术。
[0003]对于耐药细胞系的建立，目前所采用的几乎都是体外培养，药物阶梯浓度诱导驯化的方法。具体到培养手段，可以是培养液中加入药物，也可以是培养基中加入药物。该方法原理简单，但不容易掌握，失败率高。最重要的是不能充分模拟临床上化疗药物多药耐药产生的实际过程。以其为研究平台获得的结果有时候无法反映人体复杂的多因素作用过程。因此，如何通过体外培养-体内诱导循环筛`选法构建胰腺癌吉西他滨耐药细胞及动物模型，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种体内外循环筛选法构建胰腺癌吉西他滨耐药细胞株模型的方法，为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案。
[0005]本发明涉及一种体内外循环筛选法构建胰腺癌吉西他滨耐药细胞株模型的方法，其特征在于包括如下步骤:
[0006](I)细胞培养:培养人胰腺癌细胞株PANC-1，制成单细胞悬液；
[0007](2)皮下移植:将1-1OXlO6细胞悬液接种到裸鼠的右侧颈背部皮下，待长成0.5-1.5cm3大小后处死裸鼠，将实体瘤取出，去除包膜和坏死组织，剪成0.5-1.5mm3大小的瘤块，备用；[0008](3)胰腺癌模型组的构建麻醉裸鼠，剪开胰腺被膜，将步骤(2)的瘤块植入胰尾近脾门处，缝合胰腺被膜，分层缝合肌层及皮肤；
[0009](4)化学治疗模型的构建:胰腺癌裸鼠胰腺原位移植后7天开始，注射抗肿瘤药物，每周I次腹腔注射，共4次，第35天处死；
[0010](5)取材:处死后收集肿瘤病灶，通过病理切片筛选肿瘤组织；
[0011](6)将组织剪碎，采用酶消化法进行瘤体源性原代细胞培养；
[0012](7)循环筛选:将步骤(6)的原代培养细胞重复步骤(2)-(6) I次-4次，从而获得耐药细胞株。
[0013]在本发明的一个优选实施方式中，所述的抗肿瘤药物是吉西他滨，所得到的耐药细胞株耐吉西他滨细胞株。
[0014]在本发明的另一个优选实施方式中，吉西他滨的单次注射量是200_300mg/kg裸鼠。
[0015]经过两轮的筛选，获得胰腺癌吉西他滨的耐药细胞，命名为PANC-1/R2。按此方法，若经后增加循环次数(m)，其命名方法即为PANC-1/Rm。该方法易于标记，也能明确筛选和循环次数。评价筛选的耐药细胞株，体内及体外的耐药实验是必不可少的。本研究测定了三种不同吉西他滨浓度作用下，亲代细胞PANC-1和耐药细胞系PANC-1/R2的抑制率，分别是 21.8%,37.1%A6.1%和 12.6%,25.3%,36.8%，耐药细胞系 PANC-1/R2 的抑制率均明显小于亲代，可见其抗吉西他滨作用明显强于亲代细胞，表现出明显的耐药性。而用PANC-1和PANC-1/R2分别构建胰腺癌动物模型，吉西他滨腹腔注射治疗后，获取瘤体，PANC-1/R2瘤体重量为2.19±0.Hg,明显高于PANC-1的1.87±0.69g。这种通过体内外的耐药实验可以直观的明确细胞的耐药性，较通过测定耐药相关基因表达ABCG2、ABCB1和PLKl等更简便而确切。当然，既然已经筛选 出了细胞和动物模型，进一步筛选耐药相关的蛋白、基因以及相应的机制就水到渠成了。
[0016]通过这种循环筛选的方法，筛选的次数越多，肿瘤细胞出现变异及遗传变异的机会会增多。特别在免疫缺陷的实验动物中进行人类肿瘤移植实验可能诱发宿主自发瘤，为此，必须证明筛选的亚群细胞与亲代细胞是否具有一致的遗传背景，即遗传同源性。本实验从亲代与传代细胞和实验动物胰腺组织中扩增人类特异的D14S68、D18S69、D20S199三个微卫星序列21，结果显示，亲代与耐药亚群细胞3个微卫星位点扩增产物片段完全相同，而裸小鼠正常胰腺没有扩增出相应的产物片段，这既证实耐药瘤体完全来源于原肿瘤模型，也说明该移植模型经过体内连续传代，仍保留其遗传稳定性。本次实验成功筛选和分离吉西他滨耐耐药特征的胰腺癌细胞，为胰腺癌耐药实验研究提供了一个良好的实验工具。通过比较这种亚群细胞和亲代细胞的基因表达差异网，可以获得胰腺癌的化疗药物耐药相关分子表达谱，有利于推动胰腺癌耐药的分子机制研究，并为胰腺癌化疗增敏提高预后和干预提供可能的靶分子。
[0017]该方法能很好得模拟人体复杂环境下产生肿瘤耐药的生物学过程，是一种理想的细胞筛选和建模方法。但也存在一些不足，主要表现在筛选时间长，操作过程复杂，对环境要求较高。其中一轮筛选所需时间长大2个多月，两轮筛选需要5-6月，而且在过程中出现细胞分离、培养等过程的疏漏可致前功尽弃。其技巧是改善实验操作，增加实验动物，分批筛选，细胞培养过程中避免污染，一旦细胞筛选完成，尽早进行体内实验。这些措施可减少实验的失败率。本研究中筛选两轮即停止第三轮筛选就由于耗时过长。但从模型的稳定性上考虑，再筛选1-2轮可增加其耐药的稳定性，其耐药特征将更加明显。相较于第一轮，第二轮的细胞胞体较大，细胞器增多，推测可能与其活力有关，更能适应复杂的外部环境，从而出现对吉西他滨的耐药。随着筛选的推进，其细胞特征可能会更加明显。
[0018]总之，一个良好的细胞及动物模型是研究肿瘤机制的重要平台，体外培养、体内诱导，循环筛选的方法，充分模拟胰腺癌产生对吉西他滨耐药的病理过程，以此平台进行研究，有助于揭示胰腺癌吉西他滨耐药产生的机制，为胰腺癌化学治疗提供增敏的干预靶点，从而提高胰腺癌的治疗效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1左图为PANC-1细胞图片，右图为PANC-1/R2细胞图片。可见耐药细胞株细胞较大，胞浆丰富，细胞器发达，是具有较强适应能力的表现。
[0020]图2 6&，6比6(:分别为014568、018569、0205199序列PCR产物聚丙稀酞胺电泳银染结果。最左边泳道DNAmarker，1、2、3道分别代表从裸小鼠胰腺、亲代细胞PANC-1、吉西他滨耐药细胞PANC-1/R2中扩增产物。可见第2、3泳道扩增产物完全一致，第I泳道没有扩增相应的条带。
【具体实施方式】:
[0021]实施例1:
[0022]一材料
[0023]1.实验动物:雄性BALB/c裸小鼠由浙江中医药大学动物实验中心提供和饲养，鼠龄4周，体质量18~20g，饲养于恒温(25~27°C )，恒湿(45%~50% )，符合SPF条件的裸鼠室内，饮用水及标准食疗均经灭菌后供动物自由食用。
[0024]2.细胞株:人胰腺癌细胞株PANC-1商购得到
[0025]3.仪器、软件和试剂:
[0026]超净工作台:上海上净净化设备有限公司产品；
[0027]台式水平高速离心机:eppendorf产品；
[0028]电热恒温水浴箱:上海医疗器械五厂；
[0029]高压蒸汽灭菌锅:上海医用恒温设备厂；
[0030]电热干燥箱:德国Heraeus公司；
[0031]电热恒温水浴箱(DK-8D):上海医用恒温设备厂；
[0032]常温稳压电泳仪:北京六一仪器厂；
[0033]微量加样器:Eppendorf公司(德国)；
[0034]雪花状制冰机:美国Ross TEMP ；
[0035]TH2-C恒温振荡器:江苏太仓试验设备厂；
[0036]78HW-1型恒温磁力搅拌器:杭州仪表厂；
[0037]Du-640紫外分光光度仪:上海常新仪器厂；
[0038]组织匀浆器:温州市医疗电器厂；
[0039]微量移液器及相应Tip: 10、20、100、1000ul，GILSON 产品；[0040]DMED高糖培养液:吉诺生物医药技术有限公司产品；
[0041]胎牛血清:杭州四季青生物工程材料有限公司产品；
[0042]戊巴比妥钠:中国医药集团上海化学试剂公司产品；
[0043]低温离心机:BeckmanCoul ter Avanti J-20 (Heraeus Inc.德国)；
[0044]精密电子天平:AT2611/1000 (Mettler Inc.美国)；
[0045]PBS~11表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱仪(SELD1-T0F-MS)、CMlO型蛋白质芯片；
[0046]96孔蛋白质芯片工作支架即Bio-proeessor ；
[0047]分析软件ProteinchipSoftware3.0(美国 Ciphergen 公司):支持向量机(support veetor machines, SVM)、判别分析(discriminant analysis)和时间序列分析(time-sequence analysis)软件运用 Matlab6.5 数据处理软件(MathworkS 公司);
[0048]分析纯尿素、乙酸钠、乙睛、DTT和cHAPS缓冲盐(sigma公司)；
[0049]SPSS13.0统计软件包(SPSS公司);
[0050]注射用盐酸吉西他滨(健择)(LILLY公司，批号A283463)；
[0051]微卫星位点分别为D14S68、D18S69、D20S199，引物序列检索
[0052]自NCBI的UniSTS数据库，由上海生工生物工程公司合成。
[0053]二构建方法`
[0054]I细胞培养:人胰腺癌细胞株PANC-1接种于含20%胎牛血清的DMEM培养基，置于37°C、5% C02孵箱中培养，取对数生长期的人胰腺癌培养细胞，轻摇振荡后倾弃培养液，PBS工作液漂洗2遍。加入适量的2.5g/L胰蛋白酶与200 μ mo I/L EDTA混合，室温下倒置显微镜观察消化过程，待单层的细胞成片收缩，细胞逐渐变圆，细胞之间出现空隙时，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，制成单细胞悬液。取样镜下计数，调整细胞浓度为 1.5 ~2X106/mL。
[0055]2.皮下移植:将9X IO6细胞悬液接种到裸鼠的右侧颈背部皮下，待长成Icm3大小后将实体瘤取出，去除包膜和坏死组织，剪成Imm3大小的瘤块,备用。
[0056]3.胰腺癌模型组的构建:20g/L戊巴比妥钠溶液45mg/kg腹腔注射麻醉裸鼠，上腹部2cm切口，剪开胰腺被膜，将Imm3大小的瘤块植入胰尾近脾门处，缝合胰腺被膜，分层缝合肌层及皮肤。
[0057]4.化学治疗模型的构建:胰腺癌裸鼠胰腺原位移植后7天开始，注射240mg健择/kg裸鼠，每周I次腹腔注射，共4次，第35天处死。
[0058]5.取材:所有裸鼠每天检查每周称重，于制模后第35天称重后处死。摘取眼球由眶后静脉窦取血并收集肿瘤病灶及淋巴结和内脏等标本组织。全血取出后立刻放入试管中，静止I~1.5小时，后在4度低温离心(4000转/分钟)10分钟，取上清液，再次离心10分钟，取上清血清分装于印pendorf管中，以石蜡封口，标记后放入-80度冷冻。胰腺肿瘤组织在拭干表面水分后立即在电子称上称重并记录，游标卡尺测量肿瘤体积并记录。所有肿瘤组织石蜡包埋切片HE染色。所有肿瘤组织均得到病理切片证实。
[0059]6.酶消化法进行瘤体源性原代细胞培养:在剪碎组织，切成l_2mm3小块中，加入
0.25%胰蛋白酶或2000U/ml胶原酶，在37°C水浴中消化30min或更长一些，去除消化液，用洗液洗3次，培养基洗I次后，用完全培养基悬浮，并用吸管吹打分散制成细胞悬液，计数。以(5-10) XlO8个/L细胞浓度，在含有10%小牛血清的RPM1、EagleMEM或DMEM中，在37°C、5% CO2下分瓶(或皿)中培养。
[0060]7.循环筛选:将腹腔化疗后瘤体最大的5个模型的瘤体组织，按步骤6获得的肿瘤细胞，再进行皮下成瘤，腹腔原位移植，腹腔化疗，获得瘤体组织，细胞分离培养等。具体方法同前，但循环操作I次，从而获得耐药细胞株及耐药动物模型。
[0061]8.耐药细胞亚群的遗传背景鉴定:抽提模型动物胰腺组织(液氮冻存)、PANC-1/R2和亲代细胞PANC-1的DNA，以其为模板，PCR法扩增三个微卫星序列，PCR产物聚丙稀酞胺凝胶电泳和银染显示。具体如下为，PCR扩增:10μ I反应体系中含有样本DNA约0.1 μ g，弓丨物各5pmol，TaqDNA聚合酶0.3μ I等。反应条件:预变性94°C 2min ;循环94°C X30s,56°C X 30s,72°C X 30s，共36个循环；延伸56°C 5min ;显示:PCR产物大小分别为148~172bp、192~210bp、108~126bp，8%聚丙稀酰氨凝胶电泳和银染显色显示。
[0062]三统计学分析
[0063]实验数据中计量资料以i ±s表示，统计分析采用SPSS13.0统计软件包进行，多组
资料的统计学检验采用方差分析，各组均数间的相互比较采用Student-Newman-keuls法，相关分析采用Spearman等级相关分析，P < 0.05为有统计学意义
[0064]结果
[0065]一建立胰腺癌动物模型，体内外循环筛选胰腺癌吉西他滨耐药模型
[0066]构建了胰腺癌吉西他滨耐药的细胞及动物模型，第一循环原位移植成功率为73.3% (11/15)，吉西他滨腹腔灌注后死亡率为18.2% (2/11)，瘤体最大的5个均值为1.76±0.87g，远处转移率11.1% (1/9);第二循环原位移植成功率80% (12/15)，吉西他滨腹腔灌注后死亡率为8.3% (1/12)，瘤体最大的5个均值为2.16±1.12g，远处转移率36.3% (4/11);两循环比较，瘤体大小及远处转移率具有统计学差异(P <0.05)，见表1。
[0067]表1两轮循环的一般资料比较
【权利要求】
1.一种体内外循环筛选法构建胰腺癌吉西他滨耐药细胞株模型的方法，其特征在于包括如下步骤: (1)细胞培养:培养人胰腺癌细胞株PANC-1，制成单细胞悬液； (2)皮下移植:将1-1OXlO6细胞悬液接种到裸鼠的右侧颈背部皮下，待长成0.5-1.5cm3大小后处死裸鼠，将实体瘤取出，去除包膜和坏死组织，剪成0.5-1.5mm3大小的瘤块，备用； (3)胰腺癌模型组的构建:麻醉裸鼠，剪开胰腺被膜，将步骤(2)的瘤块植入胰尾近脾门处，缝合胰腺被膜，分层缝合肌层及皮肤； (4)化学治疗模型的构建:胰腺癌裸鼠胰腺原位移植后7天开始，注射抗肿瘤药物，每周I次腹腔注射，共4次，第35天处死； (5)取材:处死后收集肿瘤病灶，通过病理切片筛选肿瘤组织； (6)将组织剪碎，采用酶消化法进行瘤体源性原代细胞培养； (7)循环筛选:将步骤(6)的原代培养细胞重复步骤(2)46)1次-4次，从而获得耐药细胞株。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的抗肿瘤药物是吉西他滨，所得到的耐药细胞株耐吉西他滨细胞株。
3.根据权利要求2所述的方法，吉西他滨的单次注射量是200-300mg/kg裸鼠。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于通过病理切片筛选肿瘤组织使指选择肿瘤大、转移率高的裸鼠。
【文档编号】C12N5/09GK103820391SQ201410081002
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月6日 优先权日:2014年3月6日
【发明者】朱锦辉, 劳昕元 申请人:朱锦辉