一株稳定表达eml4-alk基因的肺癌细胞株及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学分子生物学技术领域，具体设及一种稳定表达EML4-ALK4融合基 因的肺癌细胞株的构建。
【背景技术】
[0002] 肺癌是全世界最常见恶性肿瘤之一，死亡率居恶性肿瘤之首，我国肺癌发病率和 死亡率也呈逐年上升趋势，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer ,NS化C)约占 肺癌的80%-85%，且多数患者确诊时已属晚期，失去了手术治疗的机会，而W销类药物为 基础的化疗效果也不甚理想，总有效率不到15%，2年生存率大约为12%。
[0003] 近年来，随着基因组学的发展，分子祀向治疗成为肺癌治疗的研究热点，并显著提 高了晚期NS化C患者的无疾病进展生存期和总生存期。其中，棘皮动物微管相关蛋白样4-间 变性淋己瘤激酉每（echinoderm microtubule-associated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK)融合基因是新发现的一个肺癌祀向治疗相关基因。
[0004] 间变淋己瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)是一个由细胞外配体结合 区、跨膜区及胞内的酪氨酸激酶区组成的1，620个氨基酸的跨膜蛋白，属于膜岛素受体家 族。于1994年首先发现于间变性大细胞淋己瘤AMS3细胞株中。
[0005] 棘皮动物微管相关样蛋白4(echinode;rm microtubule-associated protein-like 4,EML4)属于棘皮动物微管相关样蛋白家族，由N末端碱基区（N-terminal basic region)、疏水的棘皮动物微管相关蛋白化ydrophobic echinoderm microtubule-associated protein-Uke protein,肥LP)区W及WD重复区（WD-repeat region)3部分构 成。WD重复区是一段通常W色氨酸-天冬氨酸结尾的氨基酸的序列，包含了 4个-16个重复的 单元，其所有的单元一起形成一个beta螺旋结构。WD重复区作为一个大家族广泛存在于真 核生物中，负责细胞信号转导、细胞周期控制、细胞调亡调控等。研究证明在EML4-ALK融合 基因中，W上3个部分都与肿瘤的形成有关，其中N末端碱基区的作用最为重要。
[0006] EML4-ALK融合基因是由日本学者Soda等在1名62岁有吸烟史的男性腺癌患者的肿 瘤组织中首次发现的。基因的重排发生在2号染色体短臂上的2区1带和2区3带，由ALK基因 的y端与EML4基因的5M到位融合形成。EML4基因断裂后形成不同长度的外显子拼接片段， 插入位置相对保守的ALK基因的19号、20号外显子之间，从而形成有11个变体的EML4-ALK融 合蛋白。融合基因大多都有致瘤性，其中变体1最常见，变体3a/3b次之。W最常见的变体1为 例，EML4在WD重复区处断裂，形成一个由N末端碱基区、肥LP区、部分WD重复区组成的片段与 ALK的胞内区融合。融合基因中EML4的启动子位于ALK胞内酪氨酸激酶的上游，从而导致融 合基因活化，表达EML4-ALK融合蛋白。通过EML4的胞外结构形成的二聚体使ALK在缺乏配体 的情况下受体持续自憐酸化，进而持续激活下游细胞信号通路导致细胞恶性转化。
[0007] 据文献报道，目前只有3株肺癌细胞系拥有EML4-ALK融合基因表达，分别是H2228 (EML4-ALK variant3a/b),H3122(EML4-ALK variant I),DFC1032(EML4-ALK variant l)〇 其中ATCC细胞库中有收录H2228细胞系，但截至目前为止在ATCC中关于H2228细胞系的资料 记载中并没有显示其有EML4-ALK的融合基因突变，另外两株细胞系并没有被ATCC保藏， ML4-ALK融合基因突变阳性细胞系来源的局限性大大的限制了运一祀点相关的基础研究甚 至是临床前研究。
【发明内容】
[000引本发明为了解决上述问题，提供一株稳定表达EML4-ALK融合基因的肺癌细胞株及 其构建，通过应用慢病毒感染技术，利用LV5-EML4-ALK-GFP/Puro载体侵染A549细胞，建立 稳定表达EML4-ALK融合基因的细胞株，再利用细胞免疫巧光、巧光定量PCR、Western Blot 技术对细胞株进行检测，W证明细胞株构建成功，达到构建一株稳定表达EML4-ALK融合基 因突变阳性的细胞系作为模型用于研究EML4-ALK融合基因在肺癌发生、发展、治疗及后续 耐药过程中提供基本且有力的研究工具的目的。
[0009]为实现上述发明目的，本发明采用W下技术方案：
[0010]本发明提供一株稳定表达EML4-ALK基因的肺癌细胞株，所述人肺癌细胞系A549/ EML4-ALK保藏于中国典型培养物保藏中屯、，保藏编号CCTCC NO: C2015193，保藏时间为2015 年11月20日，保藏地址为中国武汉武汉大学。
[0011 ]本发明还提供上述稳定表达EML4-ALK基因的肺癌细胞株的构建方法，包括W下步 骤：
[0012]步骤日，过表达载体的构建:利用化学合成方法合成EML4-ALK序列片段，然后将目 的基因EML4-ALK克隆到LV5载体中并测序鉴定；
[0013] 步骤b，病毒包装:将步骤a中构建好的重组质粒LV5-EML4-ALK-GFP/Puro转入293T 细胞，收集病毒液并进行滴度测定；
[0014] 步骤C，细胞培养:人非小细胞肺癌细胞(A549细胞)使用含10%FBS的DMEM培养基， 37 °C 5 % C〇2饱和湿度培养箱中培养。
[0015] 步骤d，病毒侵染:膜酶消化处于生长对数期的A549细胞，离屯、后用无抗生素的培 养基重悬细胞，取A549细胞接种于培养皿中，待细胞贴壁后，向培养皿中加入步骤b中的病 毒上清液，加入聚凝胺进行培养；
[0016] 步骤e，加药筛选:弃去病毒液，换上含有10%FBS的正常培养基进行培养，接着用 添加嚷岭霉素的完全培养基换液，每1-2天换液并拍照观察巧光表达。持续培养7-14天后， 侵染过的A549细胞正常生长，带上绿色巧光，得到稳定表达EML4-ALK基因的肺癌细胞株。
[0017] 进一步，步骤a中，将目的基因EML4-ALK基因分成两个片段进行合成，其中两个片 段分别为沈Q NO: 1和沈Q NO:2。
[0018] 进一步，步骤a中，利用EcoRV将两个片段分别克隆到PTC57中，单酶切克隆反应后 挑选出EML 4-ALK基因的两个片段的阳性克隆进行测序验证。
[0019] 进一步，步骤b中，病毒包装质粒和重组质粒LV5-EML4-ALK-GFP/Puro通过 Lipofectamine 2000转入293T细胞，24小时后取出培养皿，弃去培养基，1 X PBS清洗细胞3 次，并轻柔地加入8ml新鲜的293T培养基，继续培养;细胞转染48小时后，收集培养基上清进 行浓缩，更换新鲜培养基培养24小时后再次收集浓缩液，每次收集的病毒上清液用0.45皿 的膜过滤。
[0020] 进一步，步骤d中，取5 X 10 5个A549细胞接种于培养皿中，待细胞贴壁后，向培养 皿中加入1.5ml配置好的病毒上清液，加入聚凝胺，终浓度为化g/ml，培养24小时。
[0021 ] 进一步，步骤e中，将融合度达到80 % -90 %的A549细胞消化，按照每孔5*104细胞 的密度将其接种在24孔板中培养24小时后，加入提前配制好的病毒上清液，并加入终浓度 为扣g/mL的聚凝胺，病毒液解育24小时后将病毒液弃去，换上含有10%FBS的正常培养基， 24小时后将每个孔中的细胞传至IOcm的培养皿中，正常培养24小时后用添加嚷岭霉素的完 全培养基换液;3-4天后，侵染病毒的细胞有部分死亡;继续用含有嚷岭霉素的培养基培养 细胞，每1-2天换液并拍照观察巧光表达，持续培养7-14天后，侵染病毒的细胞正常生长、带 上绿色巧光。
[0022] 与现有技术相比，本技术方案具有W下优点：
[0023] 本发明通过上述构建方法成功构建了肺癌细胞株。本发明构建的肺癌细胞株可W 稳定表达EML4-AL