K融合基因，为进一步研究EML4-ALK融合基因在肺癌发生、发展、治疗及后 续耐药过程中提供基本且有力的研究工具。
【附图说明】
[0024] 图1是LV5-EML 4-ALK重组质粒的双酶切鉴定图。
[0025] 图2是瞬时转染细胞的巧光定量PCR扩增曲线图。
[0026] 图3是瞬时转染细胞的WB蛋白鉴定结果。
[0027] 图4是稳转细胞株的巧光定量PCR扩增曲线图。
[0028] 图5是稳转细胞株的WB蛋白鉴定结果。
【具体实施方式】
[0029] (〇EML4-ALK序列片段的合成
[0030] OligO设计，目的基因上下游引物分别加上NotI和化il及保护碱基，用于载体的亚 克隆，将EML4-ALK基因分成两个片段进行合成，B687A(l-1602bp)，序列如SEQ N0:1所示； B687B:(1564-3180bp)，序列如沈Q N0:2所示。
[0031] 两个片段分别通过两轮PCR反应合成得到，然后利用EcoRV将其分别克隆到PTC57 中，单酶切克隆反应后挑选出EML 4-ALK基因的A，B两个片段的阳性克隆进行测序验证。
[0032] (2)目的基因克隆到载体LV5中
[0033] 用NotI和BspHI对EML4-ALK基因片段A、EML4-ALK基因片段B进行酶切，37°C酶切2 小时，酶切体系为：l〇*buffer扣L，B687A1扣L，Not巧邮S抑I各化L，d地2〇 2祉L。用Bs抑巧口 化il对EML4-ALK基因片段B进行酶切，37°C酶切2小时，酶切体系为：10*buffer化UB687B 1扣UNotI和Bs抑I各化L，d地2〇 2祉L。用NotI和化il对慢病毒载体LV5进行酶切，37°C酶切 2小时，酶切体系为：10*buffer扣L，LV5扣UNotI和化il各化L，dd出0 3祉L。酶切后电泳， 用DNA凝胶回收试剂盒回收EML4-ALK基因片段A、EML4-ALK基因片段B和载体LV5，22 °C连接2 小时，连接体系为：T4DNA Iigase buffer 化L，LV5 化L，B687A 化L B687B 5化，T4DNA Iigase 趾，(1她2〇姐1。
[0034] (3)连接产物转化至感受态细胞并鉴定
[0035] 从-70°C中取出感受态细胞，冰上放置4分钟，待感受态细胞解冻后，加入10化连接 产物，轻柔混匀内容物，冰中放置30分钟;然后将之放到预加溫到42°C的水浴锅中，静置90 秒;快速将离屯、管转移到冰浴中，使细胞冷却3分钟；向离屯、管加入80化L LB培养基(不含抗 生素），然后转移到37°C摇床，250转/分钟，培育45分钟使细菌复苏;取2(K)化培育后的细胞 均匀涂布于含50yg/mL Ampicillin LB平板上，平板上液体被吸收后，将平板倒置于37°C培 养箱中，培养16小时;从培养好的平板上挑取4个单独、饱满的菌落，置于含有5mL(含50yg/ ml AmpicillirOLB培养基的试管中，将试管置于细菌摇床中培养，37°C，250转/分钟，培养 16小时;将培养好的菌液，用质粒小提试剂盒(天根生化，DP104-02)抽提质粒，对抽取好的 质粒进行双酶切鉴定如图1所示，其中图1中泳道1是双酶切产物，泳道2是marker。
[0036] 反应体系为：10XBuffer化L，质粒化L，NotI和NsiI各0.化L，d地20化L，酶切37 °C，1小时后电泳，在目的条带大小对应区域有酶切得到的条带对应的克隆即为阳性克隆。 取2(K)化阳性克隆对应的菌液送测序鉴定，并将剩余的菌液用甘油保存。
[0037] (4)慢病毒包装
[0038] 将处于对数生长期的293T细胞消化，按照每个IOcm的培养皿5 X IO6个细胞数接种 于培养皿中，37 °C，5 %C〇2的培养箱中培养过夜。次日转染前弃去旧的培养基加入5mL新鲜 的含10%血清0161培养液。准备一支无菌的51111^离屯、管，先加入1.51111^无血清化^-161培养 液，再加入pLV/helpe;r-SL3、pLV/helpe;r-化4、pLV/helpe;r-SL5、目的质粒（各4ug)，轻轻颠 倒混匀；准备另外一支无菌的5mL离屯、管里，加入1.5mL无血清化ti-MEM培养液和40化的 Lipofectamine 2000,轻轻颠倒混匀，室溫解育5分钟；将已稀释DM加入到含有 Lipofectamine 2000的无血清化ti-MEM培养液，轻轻颠倒混匀，室溫解育20分钟；将DNA-Lipofectamine 2000复合物一滴一滴地添加到293T细胞中，轻轻地前后摇晃培养皿W混匀 复合物。放置37 °C、5 %C〇2饱和湿度培养箱中过夜培养;次日，更换IOmL含10 %血清DMEM培 养液;转染后48小时收集培养上清进行浓缩;再加入IOmL新鲜的培养液继续培养，72小时再 次收集浓缩;浓缩过程:300化pm低速离屯、15min，上清用0.45皿滤器进行过滤，W彻底去除 细胞碎片;每个UT离屯、管装20mL滤液，50000 X g高速离屯、90min沉淀病毒颗粒，弃去上清;每 管沉淀用20化L培养液重悬病毒沉淀，取一部分用于滴度测定，剩余的分装并存放在-80°C 冰箱。
[0039] (5)细胞培养:人非小细胞肺癌细胞(A549细胞)使用含10 %FBS的DMBl培养基，37 °C 5%C02饱和湿度培养箱中培养。
[0040] (6)LV5-EML4-ALK-GFP/化 ro 载体瞬时侵染 A549细胞
[0041 ] 实验材料；
[0042] 正常培养培养基:DMEM+10%FBS
[0043] 加药筛选培养基:DMEM+10%FBS+puromycin(终浓度化 g/ml)
[0044] PBS
[0045] Tiypsin-EDTA Solution(0.25%Trypsin-EDTA,Gibco)
[0046] 病毒工作液:EML4-ALK病毒液（108TU/ml)，编号V4669
[0047] NC对照组(空载病毒组）：LV5-NC病毒液（108TU/ml)
[004引膜酶消化A549细胞并计数，按照1 X 105cells/well的密度接种于6孔板中，DMEM (10%FBS，无抗生素）培养基培养细胞至融合度达到90%。将慢病毒原液和含10%FBS的 DMBl培养液按1:5的浓度配比成病毒工作液，吸弃6孔板中培养基，加入病毒工作液(NC组： 阴性对照组;V44669组:EML4-ALK病毒液），培养96小时，培养条件为37 °C，5 % C02。
[0049] (7)巧光定量PCR法检测瞬时侵染效果
[0050] RNA提取:将病毒侵染96小时后的细胞拿出培养箱，用预冷PBS缓冲液洗2遍，每孔 中加ImL化01裂解液重悬并分别转移至1. SmLEP管中，然后加入0.2mLS氯甲烧，剧烈摇动 10s，室溫放置3分钟，4°C，12 ,OOOg离屯、20min。将上清水相转移至另一新的无RNA酶离屯、管 中，并加入等体积的100%乙醇，吸取全部样品，加入带有2mL收集管的mini-spin离屯、柱。8， OOOg，室溫离屯、15s，弃尽流穿液。往离屯、柱中加入70化L WB，轻盖盖子，8，OOOg，室溫离屯、 15s，弃尽流穿液。用50化L WB洗涂离屯、柱S次。将离屯、柱转移至一新的无RNA酶的1.5mL离 屯、管中，往硅胶膜中央滴加50化DEPC水，4°C，10,000x g离屯、3min洗脱RNA。
[0化1 ] 逆转录:取RNA化L，向其中加入随机引物N6(IOOiiM)扣L，混匀，置于75 °C溫浴5分 钟，然后向其中分别加入2 X逆转录缓冲液10化，dNTP(2.5mM)化L，匪LV逆转录酶(20011/化） 0.化 1^，化曰3111(401]/化）0.15化置于？0?仪中反应。反应程序为：37°(：，6〇111111;851：，1〇111111;4 C，保持。
[0052]巧光定量PCR反应:按说明书配置反应体系，上机进行PCR扩增和检测。反应总体系 为20化，具体是2X定量PCR Master Mix 10化，上下游引物（20咖)各0.0祉UcDNA模板化L， 化q