制备兔抗人肺腺癌细胞a549荧光抗体的制作方法
【专利摘要】制备兔抗人肺腺癌细胞A549荧光抗体，包括家兔体内注射人肺腺癌细胞A549免疫原，制备兔抗人肺腺癌细胞A549多克隆抗体，本发明将贴壁的A549细胞经胰酶消化后，制成单细胞悬液，调整细胞密度，加入甲醛灭活，将A549细胞免疫原于第1、3、7、14天背部皮下多点注射家兔(0.5ml)，免疫注射30天后心脏采血分离血清。经硫酸铵盐析法粗提取IgG，葡聚糖凝胶纯化IgG，以透析法制备兔抗人肺腺癌细胞A549荧光抗体。该抗体可识别同一抗原的多个表位，在相同条件可提高检测灵敏度，可用于人肺腺癌细胞的鉴定和人肺腺癌的免疫病理诊断，有良好的社会效益和市场应用前景。
【专利说明】制备兔抗人肺腺癌细胞A549荧光抗体
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药生物【技术领域】，特别是涉一种制备兔抗人肺腺癌细胞A549荧光 抗体。
【背景技术】
[0002] 原发性肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其病死率占居全世界癌症死亡原因 首位；其发病原因包括吸烟、大气污染、某些职业性因素、遗传因素等，在全国第三次死因调 查中，肺癌占全国癌症死因的22. 7%，高居全国癌症死因榜首。肺癌大体可分为非小细胞肺 癌（NSCLC )和小细胞肺癌（SCLC )两类，其中非小细胞肺癌约占肺癌总数的80%-85%，与小细 胞肺癌相比，其癌细胞的生长分裂较慢，扩散转移相对较晚。
[0003] A549细胞属于NSCLC-类，来源于人肺泡细胞癌，属于NSCLC分类中的腺癌细胞， 由Giard D J等人于1973年建立。该细胞既具有肺癌恶性肿瘤细胞的特性，同时又具有 肺泡II型上皮细胞的特性和表型。故深受肺癌研究者的欢迎，A549细胞被广泛用于肺癌的 发生、发展、诊断及治疗研究，也被用于正常人肺泡II型上皮细胞的发生、分化及其结构和 功能的研究。根据Pubmed查询，到目前为止，使用A549细胞进行研究的英文报道已超过 6000篇；其中CNKI收录的利用A549细胞进行研究的中文文献多达4800余篇，且中英文 献数均逐年呈倍数级上升。
[0004] 关于A549单克隆抗体的生产尚未见报道，本发明应用的A549抗体是本实验室通 过将A549细胞免疫兔后，提取、纯化后的多克隆IgG。
[0005] 异硫氰酸突光素 （fluorescein isothiocyanate，FITC)是一种黄色、橙黄或褐黄 色粉末或结晶，性质稳定，易溶于水和酒精，最大吸收光谱为490-495nm，最大发射光谱为 520-530nm，呈现黄绿色荧光，分子质量为398. 4。碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液 中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键，成为标记荧光免疫球蛋白，即 荧光抗体，具有良好的结合力与稳定性，是各实验室经常使用的荧光标记物。
[0006] 免疫突光标记技术（immunofluorescence technique)是将已知的抗体或抗原分 子标记上荧光素，当与其相对应的抗原或抗体起反应时，在形成的复合物上就带有一定量 的荧光素，在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗体结合部位，检测出抗原或抗体。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于公开一种制备兔抗人肺腺癌细胞A549抗体及免疫荧光标记的 方法，为肺癌A549检测提供一种直观有效的手段。
[0008] 制备兔抗人肺腺癌细胞A549荧光抗体，其主要的制备步骤包括：A549细胞的培 养、抗原制备、体内免疫动物、提取抗体、荧光抗体的标记等。
[0009] 本发明所制备的IgG为多克隆抗体，能针对一个抗原的多个表位进行识别，提高 检测的灵敏度，对于肺癌，临床上尚无公认特异性较好的肿瘤相关抗原，本发明能为肺癌的 靶向检查提供潜在的选择，为肺癌实验室诊断提供一定的临床应用价值。
[0010] 本发明的技术方案及制备步骤如下： 1、A549细胞的培养、传代：细胞培养于37°C，置5%C02培养箱中，倒置显微镜下观察 A549细胞生长 形态，待细胞生长密度接近于80%时，将细胞进行消化传代。将瓶内旧培养液倒掉，力口 入Iml胰酶，轻微晃动瓶身后迅速将其倒掉，再加入l-2ml胰酶，l-3min后倒置显微镜下观 察细胞形态变圆开始脱落时，加入4-5ml含血清培养基终止消化，用吸管轻柔吹打细胞至 细胞悬液后，以1:3的比例传代，再加入含10%FBS的1640培养液至5ml，静置于37°C，5%C0 2 培养箱中进行培养。
[0011] 2、A549抗原的制备：将贴壁的A549细胞经胰酶消化后，制成单细胞悬液，调整细 胞密度为l〇 6/L，以甲醛与细胞的比例为1 :10的体积加入适量甲醛灭活，放置4°C冰箱备 用。
[0012] 3、动物体内免疫：免疫过程为第1、3、7、14天背部皮下多点注射0. 5mlA549细胞， 免疫注射30天后心脏采血分离血清。
[0013] 4、硫酸铵盐析法粗提取IgG :免疫血清10 ml加生理盐水10 ml混合，加入饱和硫 酸铵2Xml，（缓慢滴加边搅拌边，使硫酸铵饱和度达50% )，4°C，静置3h以上，3 OOOrpm离 心20min，弃上清，沉淀物用生理盐水稀释至Xml，边搅拌边滴加饱和琉酸铵1/2 X ml，使饱 和度为33%，4°C静置3h以上，3 OOOrpm离心20min，弃上清。重复沉淀物用生理盐水稀释 至Xml，边搅拌边滴加饱和琉酸铵1/2 X ml，使饱和度为33%，4°C静置3h以上，3 OOOrpm 离心20min，弃上清2遍。最后一次加少许生理盐水溶解沉淀物装入透析袋，置4°C用PBS 透析除盐，更换透析液数次直至：奈氏试剂测定无 NH4+，（有NH4+会出现砖红色或黄色)，1% BaCl2测定无 SO广(有SO广会出现白色沉淀)，最后测定蛋白含量（mg/ml)，置4°C保存备用。
[0014] 测定蛋白含量计算方法是： IgG 抗体蛋白含量（mg/ml)= (L45X0D28Q - 0.74X0D26Q) X 稀释倍数 IgG抗体效价测定双向琼脂扩散试验效价3 1:16, ELISA试验3 1:8000。
[0015] 5、葡聚糖凝胶纯化IgG :(1)凝胶的预处理：交联葡聚糖凝胶商品多为干燥颗粒， 使用前必须充分溶胀。方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入5?10倍的去离子水中，力口 热煮沸方法进行凝胶溶胀，此法不仅能加快溶胀速率，而且能除去凝胶中污染的细菌，同时 排除气泡。（2)装柱：层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋 白质时，柱床体积应为样品体积的25?100倍。凝胶柱的装填要求，凝胶柱要求柱中的填 料（凝胶）密度均匀一致，没有空隙和气泡。通常新装的凝胶柱用适当的缓冲溶液平衡后， 将带色的兰葡聚糖-2000、细胞色素，或血红蛋白等物质配制成质量浓度为2g/L的溶液过 柱，观察色带是否均匀下移，以鉴定新装柱的技术质量是否合格，否则，必须重新装填。（3) 加样与洗脱：1)加样量：加样量与测定方法和层析柱大小有关。采用280nm波长测定吸光 度，一根2cmX 60cm的柱，加样量需5mg左右。加样量越少或加样体积越小（样品浓度高）， 分辨率越高。通常样品液的加入量应掌握在凝胶床总体积的5%?10%。样品体积过大， 分离效果不好。2)加样方法：凝胶床经平衡后，吸去上层液体，待平衡液下降至床表面时， 关闭流出口，用滴管加入样品液，打开流出口，使样品液缓慢渗入凝胶床内。当样品液面恰 与凝胶床表面持平时，小心加入数mL洗脱液冲洗管壁。然后继续用大量洗脱液洗脱。3) 洗脱：加完样品后，将层析床与洗脱液储瓶、检测仪、分部收集器及记录仪相连，根据被分离 物质的性质，预先估计好一个适宜的流速，定量地分部收集流出液，每组分一至数mL。各组 分可用适当的方法进行定性或定量分析。凝胶柱层析一般都以单一缓冲溶液或盐溶液作为 洗脱液，有时甚至可用蒸馏水。洗脱时用于流速控制的装置最好的是恒流泵。若无此装置， 可用控制操作压的办法进行。样品体积不宜过多，最好为床体积的1%?5%，最多不要超过 10%。样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。洗脱液应与膨 胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度 和口^1值。分离血清蛋白常用0.02?0.1]?〇1/1口!16.9?8.0的？85液（0.14]\1〇1/1恥(：1) 和 0. IMol/L pH8. OTris-HCl 缓冲盐溶液（0. 14Mol/L NaCl)。6、A549 抗体荧光标记：根据 欲标记蛋白总量，按FITC :蛋白为1:10的比例，用分析天平准确称取所需的FITC粉末。将 FITC粉末置入烧杯中，加入一定量的碳酸盐缓冲液，使最后蛋白浓度为20mg/ml，混匀。欲 标记抗体用碳酸盐缓冲液稀释至l〇mg/ml，取已清洗干净的透析袋，一端绑好，从另一端中 加入适量稀释好的抗体，绑好另一端。将透析袋置入装有FITC的烧杯中，于4°C下，磁力搅 拌器搅拌24小时。
[0016] 7、荧光抗体透析：抗体标记24小时后，取出透析袋放入磷酸缓冲液中透析，每天 换液2-4次，去除非特异性色素，连续6-7天，直至透析液在紫外线照射下完全无荧光为止。
[0017] 8、荧光抗体的保存：以0-4°C或_20°C低温保存，防止抗体活性降低或变性，可加 入浓度为（1:5000)- (1:10000)的NaN3，小量分装，避免反复冻融。
[0018] 9、本发明的特点在于：该抗体为多克隆抗体，可以识别同一抗原的多个表位，而且 在相同条件下，可提高检测的灵敏度。
【具体实施方式】
[0019] 本发明的【具体实施方式】，现将其技术方案及步骤再陈述如下： 1、A549细胞的培养、传代：细胞培养于37°C，置5%C02培养箱中，倒置显微镜下观察 A549细胞生长 形态，待细胞生长密度接近于80%时，将细胞进行消化传代。将瓶内旧培养液倒掉，力口 入Iml胰酶，轻微晃动瓶身后迅速将其倒掉，再加入l-2ml胰酶，l-3min后倒置显微镜下观 察细胞形态变圆开始脱落时，加入4-5ml含血清培养基终止消化，用吸管轻柔吹打细胞至 细胞悬液后，以1:3的比例传代，再加入含10%FBS的1640培养液至5ml，静置于37°C，5%C0 2 培养箱中进行培养。
[0020] 2、A549抗原的制备：将贴壁的A549细胞经胰酶消化后，制成单细胞悬液，调整细 胞密度为l〇 6/L，以甲醛与细胞的比例为1 :10的体积加入适量甲醛灭活，放置4°C冰箱备 用。
[0021] 3、动物体内免疫：免疫过程为第1、3、7、14天背部皮下多点注射0. 5mlA549细胞， 免疫注射30天后心脏采血分离血清。
[0022] 4、硫酸铵盐析法粗提取IgG :免疫血清10 ml加生理盐水10 ml混合，加入饱和硫 酸铵2Xml，（缓慢滴加边搅拌边，使硫酸铵饱和度达50% )，4°C，静置3h以上，3 OOOrpm离 心20min，弃上清，沉淀物用生理盐水稀释至Xml，边搅拌边滴加饱和琉酸铵1/2 X ml，使饱 和度为33%，4°C静置3h以上，3 OOOrpm离心20min，弃上清。重复沉淀物用生理盐水稀释 至Xml，边搅拌边滴加饱和琉酸铵1/2 X ml，使饱和度为33%，4°C静置3h以上，3 OOOrpm 离心20min，弃上清2遍。最后一次加少许生理盐水溶解沉淀物装入透析袋，置4°C用PBS 透析除盐，更换透析液数次直至：奈氏试剂测定无 NH4+，（有NH4+会出现砖红色或黄色)，1% BaCl2测定无 SO广(有SO广会出现白色沉淀)，最后测定蛋白含量（mg/ml)，置4°C保存备用。
[0023] 测定蛋白含量计算方法是： IgG 抗体蛋白含量（mg/ml)= (L45X0D28Q - 0.74X0D26Q) X 稀释倍数 IgG抗体效价测定双向琼脂扩散试验效价3 1:16, ELISA试验3 1:8000。
[0024] 5、葡聚糖凝胶纯化IgG :1)凝胶的预处理：交联葡聚糖凝胶商品多为干燥颗粒，使 用前必须充分溶胀。方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入5?10倍的去离子水中，加热 煮沸方法进行凝胶溶胀，此法不仅能加快溶胀速率，而且能除去凝胶中污染的细菌，同时排 除气泡。2)装柱：层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质 时，柱床体积应为样品体积的25?100倍。凝胶柱的装填要求，凝胶柱要求柱中的填料（凝 胶）密度均匀一致，没有空隙和气泡。通常新装的凝胶柱用适当的缓冲溶液平衡后，将带色 的兰葡聚糖-2000、细胞色素，或血红蛋白等物质配制成质量浓度为2g/L的溶液过柱，观 察色带是否均匀下移，以鉴定新装柱的技术质量是否合格，否则，必须重新装填。3)加样与 洗脱：①加样量：加样量与测定方法和层析柱大小有关。采用280nm波长测定吸光度，一根 2cmX 60cm的柱，加样量需5mg左右。加样量越少或加样体积越小（样品浓度高），分辨率 越高。通常样品液的加入量应掌握在凝胶床总体积的5%?10%。样品体积过大，分离效 果不好。②加样方法：凝胶床经平衡后，吸去上层液体，待平衡液下降至床表面时，关闭流出 口，用滴管加入样品液，打开流出口，使样品液缓慢渗入凝胶床内。当样品液面恰与凝胶床 表面持平时，小心加入数mL洗脱液冲洗管壁。然后继续用大量洗脱液洗脱。③洗脱：加完样 品后，将层析床与洗脱液储瓶、检测仪、分部收集器及记录仪相连，根据被分离物质的性质， 预先估计好一个适宜的流速，定量地分部收集流出液，每组分一至数mL。各组分可用适当的 方法进行定性或定量分析。凝胶柱层析一般都以单一缓冲溶液或盐溶液作为洗脱液，有时 甚至可用蒸馏水。洗脱时用于流速控制的装置最好的是恒流泵。若无此装置，可用控制操 作压的办法进行。样品体积不宜过多，最好为床体积的1%?5%，最多不要超过10%。样品 浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。洗脱液应与膨胀一致，否则 更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。分 离血清蛋白常用 〇· 02 ?0· IMol/L pH 6. 9 ?8. 0 的 PBS 液（0· 14Mol/L NaCl)和 0· IMol/ L pH8. OTris-HCl缓冲盐溶液（0. 14Mol/L NaCl)。6、A549抗体荧光标记：根据欲标记蛋 白总量，按FITC:蛋白为1:10的比例，用分析天平准确称取所需的FITC粉末。将FITC粉 末置入烧杯中，加入一定量的碳酸盐缓冲液，使最后蛋白浓度为20mg/ml，混匀。欲标记抗体 用碳酸盐缓冲液稀释至l〇mg/ml，取已清洗干净的透析袋，一端绑好，从另一端中加入适量 稀释好的抗体，绑好另一端。将透析袋置入装有FITC的烧杯中，于4°C下，磁力搅拌器搅拌 24小时。
[0025] 7、荧光抗体透析：抗体标记24小时后，取出透析袋放入磷酸缓冲液中透析，每天 换液2-4次，去除非特异性色素，连续6-7天，直至透析液在紫外线照射下完全无荧光为止。
[0026] 8、荧光抗体的保存：以0-4°C或_20°C低温保存，防止抗体活性降低或变性，可加 入浓度为（1:5000)- (1:10000)的NaN3，小量分装，避免反复冻融。
[0027] 9、该抗体为多克隆抗体，可以识别同一抗原的多个表位，而且在相同条件下，可提 高检测的灵敏度。
【权利要求】
1. 制备兔抗人肺腺癌细胞A549荧光抗体，其特征在于：它包括如下步骤： 1. A549细胞的培养、传代：细胞培养于37°C，置5%C02培养箱中，细胞生长密度接近于 80%时，将细胞进行消化传代； 2. A549抗原的制备：将贴壁的A549细胞经胰酶消化后，制成单细胞悬液，调整细胞密 度为l〇6/L，以甲醛与细胞的比例为1 :10的体积加入适量甲醛灭活，放置4°C冰箱备用； 3) 动物体内免疫：免疫过程为第1、3、7、14天于家兔背部皮下多点注射0. 5mlA549细 胞，免疫注射30天后心脏采血分离血清； 4) 硫酸铵盐析法粗提取IgG :免疫血清10 ml加生理盐水10 ml混合，加入饱和硫酸 铵2Xml，（缓慢滴加边搅拌边，使硫酸铵饱和度达50% )，4°C，静置3h以上，3 OOOrpm离心 20min，弃上清，沉淀物用生理盐水稀释至Xml，边搅拌边滴加饱和琉酸铵1/2 X ml，使饱和 度为33%，重复2遍； 最后一次加少许生理盐水溶解沉淀物装入透析袋，置4°C用PBS透析除盐，更换透析 液数次直至：奈氏试剂测定无NH4+,有NH4+会出现砖红色或黄色，1 % BaCl2测定无SO，，有 SO广会出现白色沉淀，最后测定蛋白含量mg/ml，置4°C保存备用； IgG抗体效价测定双向琼脂扩散试验效价3 1:16, ELISA试验3 1:8000 ; 5) 葡聚糖凝胶纯化IgG :将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入5?10倍的去离子水中，力口 热煮沸方法进行凝胶溶胀；装柱：按柱床体积应为样品体积的25?100倍；加样与洗脱采 用280nm波长测定吸光度，一根2cmX60cm的柱，加样量需5mg左右；加完样品后，将层析 床与洗脱液储瓶、检测仪、分部收集器及记录仪相连，分离用〇. 02?0. IMol/L pH 6. 9? 8. 0 的 PBS 液，即 0? 14Mol/L NaCl 和 0? IMol/L pH8. OTris-HCl 缓冲盐溶液，即 0? 14Mol/L NaCl； 6. A549抗体荧光标记：按FITC :蛋白为1:10的比例，用分析天平准确称取所需的FITC 粉末；将FITC粉末置入烧杯中，加入一定量的碳酸盐缓冲液，使最后蛋白浓度为20mg/ml， 混匀；欲标记抗体用碳酸盐缓冲液稀释至l〇mg/ml，取已清洗干净的透析袋，一端绑好，从 另一端中加入适量稀释好的抗体，绑好另一端；将透析袋置入装有FITC的烧杯中，于4°C 下，磁力搅拌器搅拌24小时； 7) 荧光抗体透析：抗体标记24小时后，取出透析袋放入磷酸缓冲液中透析，每天换液 2-4次，去除非特异性色素，连续6-7天，直至透析液在紫外线照射下完全无荧光为止； 8) 荧光抗体的保存：以0-4°C或-20°C低温保存，防止抗体活性降低或变性，可加入浓 度为1:5000-1:10000的NaN 3，小量分装，避免反复冻融。
2. 如权利要求1所述的制备兔抗人肺腺癌细胞A549荧光抗体，其特征在于：步骤2) A549抗原的制备细胞密度为106/L，以甲醛与细胞的比例为1 :10的体积加入甲醛灭活；3) 动物体内免疫：免疫过程为第1、3、7、14天于家兔背部皮下多点注射0. 5mlA549细胞，免疫 注射30天后心脏采血分离血清；4)硫酸铵盐析法粗提取IgG效价测定双向琼脂扩散试验 效价兰1:16, ELISA试验兰1:8000为合格；6)A549抗体荧光标记：按FITC :蛋白为1:10 的比例，使最后蛋白浓度为20mg/ml，混勻；欲标记抗体用碳酸盐缓冲液稀释至10mg/ml，取 已清洗干净的透析袋，一端绑好，从另一端中加入适量稀释好的抗体，绑好另一端，将透析 袋置入装有FITC的烧杯中，于4°C下，磁力搅拌器搅拌24小时。
【文档编号】C07K1/36GK104311664SQ201410593244
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月30日 优先权日:2014年10月30日
【发明者】孙万邦, 王少慧, 郭锦锦, 宋明英 申请人:遵义医学院